湘產(chǎn)濃香型白酒釀造過(guò)程中氨基甲酸乙酯含量變化規(guī)律

黃雄偉 李文祥 曾憲峰 李 青 張建輝

(1. 湖南省產(chǎn)商品評(píng)審中心，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2. 湖南志成食品技術(shù)服務(wù)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3. 廣電計(jì)量檢測(cè)〔湖南〕有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)又名尿烷、胺甲酸乙酯等，是一種具有致突變性、免疫抑制性及心率抑制性的2A類(lèi)致癌物質(zhì)[1-2]，廣泛存在于釀造酒等發(fā)酵產(chǎn)品中[3-4]。因此，部分國(guó)家制定了酒精飲料中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)。如加拿大對(duì)佐餐葡萄酒限量值為0.03 mg/L，加強(qiáng)葡萄酒限量值為0.1 mg/L，蒸餾酒限量值為0.15 mg/L，烈性酒和水果白蘭地限量值為0.4 mg/L[5]。美國(guó)FDA規(guī)定：1988年以后生產(chǎn)的佐餐葡萄酒(酒精度≤14%)EC含量不能超過(guò)0.015 mg/L，1989年以后生產(chǎn)的甜葡萄酒(酒精度≥14%)EC含量不能超過(guò)0.06 mg/L。2002年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織將其作為重點(diǎn)監(jiān)控物質(zhì)，并制定了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，含量不得超過(guò)0.02 mg/L[6]。

湘產(chǎn)濃香型白酒具有悠久的歷史。近年來(lái)，白酒中EC的含量調(diào)查、機(jī)理形成，含量控制以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等研究日益引起人們的關(guān)注[7-9]，但研究對(duì)象均為基酒(包括生產(chǎn)企業(yè)自產(chǎn)的基酒和實(shí)驗(yàn)室蒸餾后的基酒)，而有關(guān)窖泥、酒醅和酒糟中EC含量的測(cè)定及變化規(guī)律研究尚未見(jiàn)報(bào)道。研究擬對(duì)原糧、窖泥、酒醅、酒糟以及基酒中的EC含量進(jìn)行檢測(cè)，并采用統(tǒng)計(jì)分析手段對(duì)不同工藝流程中的含量進(jìn)行分析，旨在為提高濃香型白酒的安全性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

自2021年3月起，于湖南省內(nèi)某濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)采集183批次樣品，其中糧食原料樣品7批次，窖泥樣品36批次，酒醅樣品64批次，酒糟樣品10批次，新釀基酒樣品48批次，貯存年份基酒18批次。

1.2 試劑和設(shè)備

二氯甲烷、正己烷、乙腈：色譜純，默克化工技術(shù)(上海)有限公司；

氯化鈉、乙二胺-N-丙基(PSA)：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜儀：Agilent 7890B-5977A型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Hei-VAP Advantage ML/G3型，廣州市京度進(jìn)出口有限公司；

電子天平：ME204E型，梅特勒—托利多科技(中國(guó))有限公司；

離心機(jī)：TDL-5A型，廣州云星科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 毛細(xì)管色譜柱為HP-INNOWAX，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度220 ℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；柱溫：初溫50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至180 ℃，以20 ℃/min升至220 ℃。載氣為氦氣，純度≥99.999%，流速1 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊源(EI)，能量為70 eV；四級(jí)桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲5 min；選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)；氨基甲酸乙酯選擇監(jiān)測(cè)離子(m/z) 44，62，74，89，定量離子62。

1.3.3 檢測(cè)方法 準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00 g試樣于濃縮瓶，40 ℃ 水浴減壓濃縮至液體少于2 mL，用水洗滌轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加水使液體最終體積為10 mL，加入適量氯化鈉振搖使其過(guò)飽和。加入10 mL二氯甲烷，渦旋混勻1 min，4 000 r/min離心3 min，將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移入濃縮瓶中。水相中加入10 mL二氯甲烷，重復(fù)提取2次，合并下層有機(jī)相，40 ℃水浴減壓濃縮至近干。

準(zhǔn)確移取2 mL乙腈至濃縮瓶中，溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入2 mL正己烷，渦旋混勻1 min，4 000 r/min 離心3 min，棄去正己烷相，加入2 mL正己烷重復(fù)凈化1次。向乙腈相中加入0.05 g PSA填料，渦旋混勻1 min，過(guò)0.45 μm有機(jī)相濾膜。GC-MS外標(biāo)法定量測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2016統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與整理；t檢驗(yàn)采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀造過(guò)程中不同物料氨基甲酸乙酯含量

由表1可知，7批次原糧均未檢出EC，窖泥、酒糟、酒醅、新釀基酒(含酒頭、酒尾)和貯存基酒(貯存期1～10年不等)的EC平均檢出值分別為84，124，170，270，325 μg/kg，EC檢出率分別為72.2%，90.0%，98.4%，98.0%，100.0%。

表1 樣品檢測(cè)結(jié)果?

原糧中未檢出EC，說(shuō)明原糧本身不含有EC，但原料產(chǎn)區(qū)和品種的不同會(huì)影響白酒中EC含量，這與原糧發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的尿素等前體物質(zhì)的含量高低有關(guān)[10]。白酒中EC的產(chǎn)生和積累與前體物質(zhì)尿素含量具有較大相關(guān)性[11]，由尿素與乙醇反應(yīng)生成；窖泥中含有一定量的尿素，但乙醇含量較低，因此其EC含量相較于酒醅、酒糟的要低；白酒在蒸餾過(guò)程中溫度可達(dá)100 ℃，EC沸點(diǎn)為184 ℃，但由于其溶于水和乙醇，有少量酒醅中的EC經(jīng)蒸汽流入基酒中，因此酒醅中的EC含量要高于酒糟；而基酒中的EC主要在蒸餾過(guò)程中和蒸餾后貯存過(guò)程中產(chǎn)生。

2.2 不同蒸餾段基酒中氨基甲酸乙酯含量

由表2可知，酒頭和酒尾EC含量顯著性檢驗(yàn)P=0.041<0.05，說(shuō)明酒頭和酒尾間存在顯著差異，且酒頭EC含量顯著高于酒尾；中間段基酒和酒頭、酒尾間顯著性檢驗(yàn)P值分別為0.516，0.071，不顯著，具體原因尚需進(jìn)一步研究，這與張瑩等[12]的結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了濃香型白酒在蒸餾過(guò)程中“掐頭”的重要性。

表2 不同蒸餾段基酒t檢驗(yàn)方差分析表(LSD多重比較)?

2.3 不同層酒醅和基酒中氨基甲酸乙酯含量

對(duì)采集的上、中、下3層酒醅和基酒(掐頭去尾后)按試驗(yàn)方法分別進(jìn)行含量檢測(cè)，采用SPSS對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明不同層酒醅EC含量顯著性P=0.770>0.05，不同層基酒EC含量顯著性P=0.980>0.05，因此不同層酒醅和基酒間的EC含量無(wú)顯著性差異。不同層酒醅EC含量無(wú)顯著性差異可能是由于不同層酒醅之間的活性微生物數(shù)目差異較小，群落組成無(wú)明顯差異[13]，使得產(chǎn)生的尿素等EC前體物質(zhì)無(wú)顯著性差異。而不同層基酒EC含量無(wú)顯著性差異的原因與基酒中的EC含量形成機(jī)理(主要為蒸餾過(guò)程中產(chǎn)生)有關(guān)[7]。

2.4 貯藏時(shí)間對(duì)氨基甲酸乙酯含量的影響

由圖1可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論是酒頭、酒尾還是中間段基酒，EC含量均有不同程度的升高，升高幅度為0.5～2.0倍，EC含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而升高的原因可能與其前體物質(zhì)尿素或氰化物等含量有關(guān)[14-15]。從絕對(duì)增長(zhǎng)幅度來(lái)看，酒頭>中間段基酒>酒尾，其原因可能是酒頭、中間段基酒中EC的前體物質(zhì)繼續(xù)與乙醇生成EC。

圖1 基酒EC含量與貯藏時(shí)間關(guān)系圖

由圖2可知，不同品種濃香型白酒貯存3～5年后，EC含量逐漸達(dá)到峰值，隨后慢慢回落至1年貯存期水平，與張瑩等[12]的結(jié)論基本一致，具體原因尚需進(jìn)一步研究。

圖2 年份基酒EC含量與貯藏年份關(guān)系圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，濃香型白酒各工藝階段中，酒糟、酒醅、基酒以及窖泥中普遍存在氨基甲酸乙酯，酒醅中氨基甲酸乙酯含量高于酒糟，且不同蒸餾段基酒中酒頭的氨基甲酸乙酯含量顯著高于酒尾?；拼娣胚^(guò)程中，酒頭中氨基甲酸乙酯含量的絕對(duì)增幅高于中間段基酒和酒尾，因此，“掐頭”是降低成品酒中氨基甲酸乙酯含量的有效手段。濃香型白酒的基酒和酒醅中氨基甲酸乙酯含量無(wú)相關(guān)性，個(gè)別基酒中的氨基甲酸乙酯含量甚至高于酒醅，說(shuō)明濃香型白酒中的氨基甲酸乙酯主要來(lái)源于蒸餾過(guò)程和貯存過(guò)程。因此如何降低發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)含量，減少蒸餾和貯存過(guò)程中氨基甲酸乙酯的生成，是企業(yè)控制成品白酒中氨基甲酸乙酯含量的重點(diǎn)。同時(shí)，濃香型白酒貯存3～5年后，氨基甲酸乙酯含量逐漸達(dá)到峰值，隨后有所下降，具體原因尚需進(jìn)一步研究。