C57BL/6小鼠和C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

★ 林瑋 楊燕燕 劉德強(qiáng) 謝金東 鐘秋明 王訓(xùn)立（福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 福州 350122）

人 類 脆 性X綜 合 征（fragile X chromosome syndrome，F(xiàn)raX）是X性染色體連鎖的一種不完全顯性遺傳病，也是遺傳性智力低下疾病中最常見(jiàn)的疾病之一，其發(fā)病率在先天遺傳性智力低下綜合征中排名第二，僅次于先天愚型。X性染色體上FMR1基因的缺陷是該病的誘因，男性的發(fā)病率約為1/1500，女性的發(fā)病率約為1/2500。由于X染色體上連鎖的脆性X智力低下1號(hào)基因（fragile x mental retardation gene 1，F(xiàn)MR1 gene）5’端非編譯區(qū)的CGG三核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)增，當(dāng)擴(kuò)增大于200個(gè)CGG 重復(fù)序列時(shí)，發(fā)生CGG重復(fù)序列的甲基化，因此導(dǎo)致FMR1基因的轉(zhuǎn)錄明顯減少，影響了基因的編碼產(chǎn)物脆性X智力低下蛋白（fragile x mental retardation protein，F(xiàn)MRP）的生成。FMR1基因敲除鼠缺乏正常的FMR1蛋白，導(dǎo)致該疾病的發(fā)生，臨床上表現(xiàn)為巨睪癥、記憶力缺失、行為異常和智力低下等行為［1-8］，與癲癇、腦癱和腦卒中等疾病的臨床癥狀相類似。

利用基因修飾技術(shù)，使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)是目前研究基因功能及某些基因在特殊疾病中作用的主要手段。目前，基因修飾動(dòng)物已在行為學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。嚙齒類動(dòng)物的FMRP同系物與人類的FMRP在結(jié)構(gòu)上存在有97%的相似性，因此兩者具有相似的生理功能，這為研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的疾病模型提供了參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)的C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠于2010年由位于美國(guó)休斯頓的貝勒醫(yī)學(xué)院引進(jìn)，之后由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心委托江蘇集萃藥康生物科技有限公司進(jìn)行胚胎冷凍保存，并于2020年1月進(jìn)行胚胎復(fù)舒后得到3只雌性雜合體小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證SCXK（蘇）2018-0008。C57BL/6為C57BL/6J.KO的源生小鼠，于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)入3只雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行繁殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證為SCXK（滬）2017-0005，最終得到純合的雌性和雄性C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠各10只，與C57BL/6小鼠進(jìn)行后續(xù)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因鑒定

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)FMR1基因的特性設(shè)計(jì)第一對(duì)引物M2和N2，用于檢測(cè)基因敲除C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠中包含新霉素插入片段的等位基因片段，檢測(cè)發(fā)生突變?cè)斐扇笔У腇MR1基因PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為800 bp；以野生型C57BL/6小鼠基因組DNA序列為模板設(shè)計(jì)引物S1和S2，用于檢測(cè)野生型C57BL/6小鼠的FMR1等位基因的片段擴(kuò)增片段長(zhǎng)度468 bp［9］。見(jiàn)表1。

表1 引物序列合成

1.2.2 DNA提取 使用0.292 g EDTA和50 mL ddH2O配置EDTA溶液；使用1 g NaOH和10 mL ddH2O配置NaOH溶液；再使用配置好的10 μL EDTA溶液加10 μL NaOH溶液再加980 μL ddH2O配置成1 mL的裂解液。剪取待進(jìn)行基因鑒定的小鼠的尾巴5 mm左右，放入已添加100 μL裂解液的離心管中，置于98 ℃的金屬浴中，每0.5 h渦旋1次，1 h左右鼠尾會(huì)完全溶解，再使用低溫離心機(jī)離心5 min（4 ℃，4 000 r/min）后，取150 μL上清液即為DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)總體積為50 μL，分別加 入20 μL Mix，20 μL DEPC水，引 物 各2 μL和DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增條件為：?jiǎn)?dòng)后，預(yù)熱10 min，在94 ℃預(yù)變性5 min，之后按照以下溫度和時(shí)間循環(huán)34次：94 ℃30 s，50 ℃60 s，72 ℃60 s。末次循環(huán)結(jié)束后于72 ℃延伸10 min，并于4 ℃保存。

1.2.4 1.5%瓊脂糖凝膠電泳 制作濃度為1.5%瓊脂糖凝膠50 mL，加入5 μL的4S Red Plus核酸染色劑后，分別加入需要進(jìn)行基因鑒定的小鼠的DNA 6 μL，以100 V電泳1 h后于凝膠成像儀中觀察，拍照。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 上海欣軟XR-XM101智能化Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn)的聽(tīng)源性驚厥實(shí)驗(yàn)的設(shè)備；成都泰盟科技有限公司的YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀。

1.4 方法

1.4.1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 先連續(xù)進(jìn)行4天的定位航行實(shí)驗(yàn)，每只小鼠每天測(cè)試4次，每次間隔10 min，按順時(shí)針順序分別從4個(gè)象限入水點(diǎn)將小鼠面朝墻壁放入水中，透明狀平臺(tái)放置于SW象限，水面沒(méi)過(guò)平臺(tái)大約1 cm左右，并在水面上灑滿白色塑料小珠，保證實(shí)驗(yàn)小鼠無(wú)法用肉眼發(fā)現(xiàn)平臺(tái)。水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)時(shí)間為60 s，若小鼠在平臺(tái)上停留時(shí)間超過(guò)2 s以上，判定為成功找到平臺(tái)，將小鼠從入水到成功找到平臺(tái)所需的時(shí)間記作定位航行的潛伏期，若60 s時(shí)間結(jié)束時(shí)，小鼠還未找到平臺(tái)則潛伏期記為60 s。定位航行實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先讓小鼠在水迷宮的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)15 min，每次定位航行實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，先將小鼠置于平臺(tái)上適應(yīng)15 s，測(cè)試完成，無(wú)論小鼠是否尋找到平臺(tái)，均需要在平臺(tái)適應(yīng)10 s。通過(guò)軟件計(jì)算每天定位航行的潛伏期的平均值，以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)小鼠的空間記憶能力。在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第二天，進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，首先需要拆除平臺(tái)，選擇SW象限作為入水象限，通過(guò)軟件計(jì)算小鼠在60 s內(nèi)通過(guò)SW象限的原平臺(tái)位置的次數(shù)和游泳的平均速度來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的空間記憶能力?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)束的次日，開(kāi)始連續(xù)進(jìn)行4天工作記憶實(shí)驗(yàn)，固定SW象限作為入水象限，且每天變換一次平臺(tái)的位置，按照SW、NE、NW、SE順序依次進(jìn)行，測(cè)試前不再進(jìn)行適應(yīng)，測(cè)試結(jié)束后適應(yīng)5 s，其余實(shí)驗(yàn)過(guò)程與定位航行實(shí)驗(yàn)相同。以每次實(shí)驗(yàn)的潛伏期來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的工作記憶能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后無(wú)論小鼠是否找平臺(tái)，都給予每只小鼠在平臺(tái)上適應(yīng)5 s。當(dāng)小鼠每次完成水迷宮實(shí)驗(yàn)后，立刻在暖燈下使用干毛巾給予擦拭。

1.4.2 聽(tīng)源性驚厥實(shí)驗(yàn) C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠是一種遺傳性癲癇易感的嚙齒類動(dòng)物，其驚厥的發(fā)生是自然的、非致癇（物理的、化學(xué)的）致驚的，克服了以往用物理或化學(xué)等方法對(duì)正常動(dòng)物人工致驚的非自然性［10］。實(shí)驗(yàn)小鼠在受到聲音刺激后發(fā)生驚厥，按照其表現(xiàn)的行為進(jìn)行評(píng)分統(tǒng)計(jì)得分情況。根據(jù)小鼠受到刺激后的不同表現(xiàn)，對(duì)其進(jìn)行評(píng)分，受聲音刺激后行為無(wú)改變者記0分；受聲音刺激后僅有狂奔、跳躍者記2分；受聲音刺激后出現(xiàn)兩次或以上的狂奔、跳躍者記5分；受聲音刺激后出現(xiàn)狂奔、跳躍并出現(xiàn)抽搐者記8分；受聲音刺激后出現(xiàn)狂奔、跳躍并出現(xiàn)全身性強(qiáng)直陣攣者記9分。當(dāng)每只小鼠完成聽(tīng)源性驚厥實(shí)驗(yàn)后，清除糞便，并用75%酒精擦拭一遍，再進(jìn)行下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn) 使用成都泰盟科技有限公司的YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀，記錄5 min內(nèi)小鼠自主活動(dòng)的次數(shù)。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清除糞便，并用75%酒精擦拭一遍，再進(jìn)行下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 懸尾實(shí)驗(yàn) 懸尾實(shí)驗(yàn)采用自制設(shè)備，將實(shí)驗(yàn)小鼠的尾部進(jìn)行固定，使其頭部向下懸掛，小鼠在該環(huán)境中掙扎，企圖擺脫該困境，在經(jīng)過(guò)努力仍無(wú)法擺脫后，出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，判定為相對(duì)靜止時(shí)間。相對(duì)靜止時(shí)間包含但不限于完全靜止的狀態(tài)，小鼠四肢的細(xì)微抖動(dòng)也判定為相對(duì)靜止的狀態(tài)，并對(duì)相對(duì)靜止的時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 基因鑒定 小鼠經(jīng)基因鑒定，當(dāng)只在800 bp位置出現(xiàn)條帶時(shí)，為純合的C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠；當(dāng)只在468 bp的位置出現(xiàn)條帶時(shí)，為野生的C57BL/6小鼠；而當(dāng)在兩個(gè)位置都出現(xiàn)條帶的時(shí)候，為雜合的C57BL/6小鼠。

2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 在連續(xù)進(jìn)行的4天定位航行實(shí)驗(yàn)中，WT組和KO組的平均潛伏期均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。在第四天WT組和KO組的之間的潛伏期出現(xiàn)差異性，KO組的潛伏期明顯大于WT組（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 WT組和KO組定位航行潛伏期 s

2.2.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 在第五天進(jìn)行的空間搜索實(shí)驗(yàn)中，WT組的穿越原平臺(tái)的次數(shù)和平均速度均大于KO組，且都存在顯著性（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 空間搜索實(shí)驗(yàn)穿越原平臺(tái)的次數(shù)和平均速度 s

2.2.3 工作記憶 在空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，連續(xù)進(jìn)行4天的工作記憶實(shí)驗(yàn)。WT組和KO組的平均潛伏期在第二天均出現(xiàn)了升高，但是無(wú)顯著性。在第四天時(shí)，WT組的平均潛伏期明顯高于KO組，且存在顯著性（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 工作記憶平均潛伏期 s

2.3 聽(tīng)源性驚厥實(shí)驗(yàn)、自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn) 在聽(tīng)源性驚厥實(shí)驗(yàn)中，KO組受刺激后的行為表現(xiàn)得分高于WT組，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)自主活動(dòng)儀在5 min中內(nèi)測(cè)得的活動(dòng)次數(shù)，KO組高于WT組，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在懸尾實(shí)驗(yàn)中，KO組的相對(duì)靜止時(shí)間大于WT組，不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表5。

表5 聽(tīng)源性驚厥實(shí)驗(yàn)、自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果 s

3 討論

嚙齒類動(dòng)物善于游泳，但是游泳對(duì)小鼠的體力消耗較大，所以嚙齒類動(dòng)物會(huì)本能的在水中尋找場(chǎng)所休息。水迷宮實(shí)驗(yàn)利用小鼠的這一特性來(lái)衡量小鼠的記憶和學(xué)習(xí)等能力。定位航行實(shí)驗(yàn)主要反映的是小鼠的記憶能力和對(duì)物體的識(shí)別能力，從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，KO組潛伏期明顯高于WT組，說(shuō)明KO小鼠的識(shí)別和記憶能力明顯低于WT小鼠。空間搜索實(shí)驗(yàn)中，WT組穿越原平臺(tái)的次數(shù)高于KO組，說(shuō)明WT組對(duì)原有的定位航行的實(shí)驗(yàn)的記憶更好，所以會(huì)更有目的在原平臺(tái)區(qū)域?qū)ふ移脚_(tái)；而平均速度也能看出WT組小鼠明顯高于KO組，反應(yīng)出KO組小鼠運(yùn)動(dòng)能力相對(duì)較弱。工作記憶實(shí)驗(yàn)主要反應(yīng)的是小鼠對(duì)復(fù)雜的認(rèn)知工作所必需的信息進(jìn)行臨時(shí)存儲(chǔ)和處理的能力，跟定位航行試驗(yàn)不同的是，平臺(tái)是每天變化的，所以在工作記憶實(shí)驗(yàn)的第二天，兩組小鼠的潛伏期都出現(xiàn)了不同程度的升高；在第四天WT組的潛伏期出現(xiàn)了明顯下降，且與KO組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明KO組工作記憶能力低于WT組。

研究發(fā)現(xiàn)敲除 FMR1基因的動(dòng)物可導(dǎo)致其癲癇發(fā)作敏感性明顯增高［11-12］。聽(tīng)源性驚厥是一種腦干型驚厥，對(duì)神經(jīng)中樞的中腦上丘在發(fā)作的發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用［13］。Huber等［14］在FMR1基因敲除小鼠的大腦中發(fā)現(xiàn)pyramidal cell的突觸對(duì)調(diào)節(jié)大腦活動(dòng)起到關(guān)鍵的作用，提示人類脆性X綜合征患者FMR1基因的轉(zhuǎn)入減少，導(dǎo)致FMRP生成受到影響，導(dǎo)致C57BL/6 FMR1小鼠的大腦發(fā)育不成熟或異常，并使癲癇發(fā)作的幾率增加。在本實(shí)驗(yàn)中，KO組的驚厥值明顯高于WT組，也能反應(yīng)出FMR1基因敲除后的C57BL/6小鼠更易引發(fā)癲癇等狀態(tài)。

自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)主要反應(yīng)的是小鼠的活躍度。而KO組主要表現(xiàn)就是癡呆和運(yùn)動(dòng)能力的減弱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本和其相符，KO組的自主活動(dòng)次數(shù)明顯低于WT組。

懸尾實(shí)驗(yàn)是一種抗抑郁藥物活性篩選非常靈敏的行為學(xué)檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KO組小鼠的相對(duì)靜止時(shí)間比WT組小鼠長(zhǎng)，與FXS患者的常見(jiàn)表現(xiàn)基本相符［15-16］。

行為學(xué)是研究動(dòng)物個(gè)體和動(dòng)物社群為適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境變化(刺激)所做出反應(yīng)的學(xué)科。由于行為學(xué)研究的是動(dòng)物行為，因此，它也被稱為“動(dòng)物行為學(xué)”。C57BL/6小鼠和C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)存在許多不同，實(shí)驗(yàn)證明，C57BL/6 FMR1基因敲除小鼠在運(yùn)動(dòng)能力、驚厥等方面，是一種理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，選用適合的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，能更好的保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。