基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)芯片數(shù)據(jù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)龍葵干預(yù)胃癌的活性成分和作用機(jī)制

★ 張志強(qiáng)（南城縣中醫(yī)院 江西 南城 344799）

胃癌作為消化系統(tǒng)常見腫瘤，在全世界范圍內(nèi)均具有較高的發(fā)病率和死亡率，目前，已經(jīng)成為第五位最常診斷癌癥，在腫瘤患病死亡率類型中排名第三。研究表明，隨著人民疾病防治意識(shí)的提高，腫瘤篩查技術(shù)的廣泛應(yīng)用和治療關(guān)口前提，在我國各年齡階段的胃癌發(fā)病率已經(jīng)顯著下降，但仍舊高于世界平均水平［1］。西醫(yī)對(duì)于胃癌的治療具有化療放療后免疫力愈發(fā)低下、機(jī)體各項(xiàng)機(jī)能進(jìn)一步退化副作用等，中醫(yī)藥治療胃癌具有一定療效，尤其是減毒增效、改善胃癌患者臨床癥狀等方面具有不可替代的作用［2］。因此，深入探索中醫(yī)藥治療胃癌的具體作用機(jī)制、為胃癌的精準(zhǔn)治療具有重要意義。

胃癌在中醫(yī)學(xué)屬“虛勞”“胃脘痛”“胃痞”“噎膈”等范疇，歷代醫(yī)家對(duì)本病的認(rèn)識(shí)基本一致，認(rèn)為本病病機(jī)屬中氣不足、正氣虧損為發(fā)病之本，以痰濕、瘀血、濕熱、濁毒等有形病理產(chǎn)物相互搏結(jié)為發(fā)病之標(biāo)，正虛邪勝則本病進(jìn)展，預(yù)后不良［3］。龍葵是我國傳統(tǒng)中藥，富含氨基酸、蛋白質(zhì)、糖分等多種有機(jī)元素［4］，在《嶺南中草藥撮要》《本草綱目》中均有記載，后者描述龍葵具有“可散瘀消腫，療癰疽腫毒”的功效，現(xiàn)今已被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療。龍葵多糖是龍葵的水溶性提取物，可調(diào)整細(xì)胞因子的分泌狀態(tài)，對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞株的增殖具有抑制作用，可阻斷胃癌細(xì)胞的發(fā)展［5］。目前，受制于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)靈敏度低、體內(nèi)外腫瘤模型復(fù)制情況不理想等情況，龍葵對(duì)于抗胃癌的具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)庫GEO網(wǎng)站獲取胃癌的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，分析和預(yù)測(cè)龍葵抗胃癌的有效成分和潛在作用機(jī)理，為胃癌的腫瘤標(biāo)記物及龍葵抗胃癌生物學(xué)通路的深入研究提供初步參考。

1 資料與方法

1.1 胃癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載及DEGs篩選 在美國國立生物技術(shù)信息中心基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫GEO下載轉(zhuǎn)錄組胃癌數(shù)據(jù)，以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞檢索表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，研究類型選擇“expression profiling by array”，組織來源選擇“homo sapiens”，下載其平臺(tái)文件和注釋文件，利用R語言工具篩選正常組和胃癌組基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以|logFC|＜1，adjustP＜0.05，進(jìn)一步篩選差異表達(dá)基因DEGs，并繪制火山圖和熱圖進(jìn)行展示。

1.2 龍葵活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 通過中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP，生物利用度＞30%、類藥性＞0.18為條件篩選龍葵中藥活性成分，并命名為“ingredients.txt”文件；檢索龍葵的潛在作用靶點(diǎn)，命名為“target.txt” 文件。

1.3 龍葵靶點(diǎn)基因注釋 在uniprot網(wǎng)站勾選reviewed human基因選項(xiàng)，將“target.txt” 文件靶點(diǎn)信息轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名稱，命名為“symble.txt”文件。

1.4 龍葵靶基因與胃癌差異基因匹配映射 將胃癌差異表達(dá)基因DEGs與龍葵靶基因輸入bioinformatics& evolutionary genomics數(shù)據(jù)庫，通過二者交集得到龍葵治療胃癌的核心基因，并繪制韋恩圖展示。

1.5 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用微生信在線網(wǎng)站對(duì)龍葵及胃癌核心基因構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”?；W(wǎng)絡(luò)圖。應(yīng)用string網(wǎng)站點(diǎn)擊“muitiple proteins”，物種選擇“homo sapiens”，置信度設(shè)置為“＞0.90”，導(dǎo)入核心基因列表輸出結(jié)果，得到蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。

1.6 GO和KEGG富集分析 通過DAVID庫對(duì)核心基因進(jìn)行 GO和KEGG富集分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 胃癌GEO芯片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異分析 從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫GEO下載人類臨床試驗(yàn)胃癌轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù)集GSE118916，得到正常的胃黏膜組織標(biāo)本和胃癌標(biāo)本。該數(shù)據(jù)集共有30個(gè)樣本數(shù)據(jù)，其中正常胃組織樣本15個(gè)，胃癌樣本15個(gè)，共含基因18 835個(gè)。下載矩陣文件和平臺(tái)文件，同時(shí)借助GEO2R在線工具進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾和標(biāo)準(zhǔn)化，并繪制胃癌基因火山圖，數(shù)據(jù)集中的上調(diào)（紅色）、下調(diào)（綠色）、無差異基因（灰色）的分布情況。見圖1。以|logFC|＜1，adjustP＜0.05為條件篩選到正常組和胃癌組織的差異基因1 056個(gè)，分別選擇上調(diào)和下調(diào)幅度最大的前20位基因繪制聚類熱圖；橫坐標(biāo)為樣本名稱，GSM3351220至GSM3351234均為正常組織樣本，GSM3351235至GSM3351249為胃癌組織樣本，縱坐標(biāo)為顯著差異基因，紅色顯示基因在該樣本高表達(dá)，綠色則是低表達(dá)，如GKN2基因在正常組織高表達(dá)，在腫瘤組織低表達(dá)。見圖2。

圖1 GSE118916芯片數(shù)據(jù)集差異基因火山圖

圖2 GSE118916芯片顯著差異基因聚類熱圖

2.2 龍葵活性成分及作用靶點(diǎn) 中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP按照生物利用度＞30%、類藥性＞0.18為條件篩選龍葵中藥活性成分發(fā)現(xiàn)結(jié)果較少不足以納入研究，故調(diào)整檢索條件，按生物利用度＞20%、類藥性＞0.18進(jìn)行檢索得到12個(gè)有效成分及相應(yīng)的靶基因137個(gè)。見表1。

表1 龍葵部分活性成分及作用靶點(diǎn)

2.3 龍葵抗胃癌的核心靶點(diǎn)及調(diào)控圖 將1 056個(gè)芯片數(shù)據(jù)集胃癌差異基因與龍葵137個(gè)作用靶基因輸入韋恩圖生物繪制網(wǎng)站，兩組數(shù)據(jù)取交集后，得到共同的核心樞紐基因17個(gè)，分別是：HSPB1、CCNB1、PCOLCE、BIRC5、DUOX2、PPARG、SELE、NR3C1、MYC、CCL2、IL6、NR3C2、CXCL2、ERBB3、CAV1、CXCL10、MMP9。見圖3。將17個(gè)靶基因與中藥龍葵及其活性成分一一映射，得到“中藥-成分-靶基因”調(diào)控?；鶊D，顯示中藥多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜調(diào)控特點(diǎn)。見圖4。

圖3 龍葵治療胃癌核心基因韋恩圖

圖4 “中藥-成分-靶基因”調(diào)控?；鶊D

2.4 核心靶點(diǎn)蛋白互作用網(wǎng)絡(luò) 將韋恩圖生物繪制網(wǎng)站得到的17個(gè)龍葵治療胃癌的核心基因輸入string網(wǎng)站繪制該17個(gè)靶基因的蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)圖。見圖5。

圖5 核心基因蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 龍葵抗胃癌基因的GO富集分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體富集分析可視化展示，分別展示龍葵治療胃癌17個(gè)核心基因的生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）3種的基因本體功能。見圖6。其中，BP共富集74個(gè)條目，對(duì)富集條目最多的前20條生物過程可視化，涉及對(duì)伽馬輻射的反應(yīng)、寒冷反應(yīng)、機(jī)械刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)胰島素刺激的反應(yīng)、生物趨化性、趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)、免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路等；CC細(xì)胞成分共富集到8種組分，涉及細(xì)胞外間隙、主軸、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、頂端質(zhì)膜、胞外區(qū)、蛋白質(zhì)復(fù)合物、小窩、核質(zhì)；MF分子功能富集到16類，涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、鋅離子結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA結(jié)合、趨化因子活性、類固醇激素受體、肝素結(jié)合、酶結(jié)合、受體結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、補(bǔ)綴結(jié)合、肽酶激活劑活性、類固醇結(jié)合、膠原結(jié)合等。

圖6 龍葵治療胃癌基因GO富集分析

2.6 龍葵抗胃癌基因的KEGG富集分析 將龍葵治療胃癌的17個(gè)核心基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行京都基因與基因組百科全書富集分析（KEGG），共富集到13條信號(hào)通路，涉及到腫瘤壞死因子信號(hào)通路等，氣泡圖顯示腫瘤壞死因子信號(hào)通路是富集數(shù)目最多、富集差異最明顯的通路。見表2和圖7。

圖7 龍葵治療胃癌基因KEGG富集分析

表2 龍葵治療胃癌核心基因KEGG富集表

3 討論

作為我國常見的惡性腫瘤之一，胃癌多由慢性胃炎逐漸發(fā)展而來，前期經(jīng)過胃黏膜上皮腸化、不典型增生、異型增生等階段，大多數(shù)患者確診腫瘤時(shí)已經(jīng)處于中晚期階段，以胃腺癌最為常見［6］。給患者和社會(huì)帶來了極大的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管近年來國家對(duì)腫瘤的防治極為重視，但我國農(nóng)村地區(qū)的胃癌發(fā)病率仍在持續(xù)上升，患病情況不容樂觀［7］。中醫(yī)學(xué)對(duì)于胃癌并無針對(duì)性命名，根據(jù)該病臨床癥狀，可以與“胃脘痛”“伏梁”“癥瘕”“虛勞”“噎膈”“積聚”等病名相對(duì)應(yīng)。古文記載“飲食不下，膈塞不通，邪在胃脘”的臨床表現(xiàn)與本病相似［8］。《靈柩·五變》言：“人之善病腸中積聚者，皮膚薄而不澤，肉不堅(jiān)而淖澤，惡則邪氣留止，積聚乃傷脾胃之間，寒溫不次，蓄積留止，大聚乃起”［9］。對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行了詳細(xì)描述，認(rèn)為本病發(fā)生與邪積聚腸腑、傷及腸胃相關(guān)。近代醫(yī)家張錫純首次明確提出“胃癌”一名，并總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，在《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中較全面的將胃癌發(fā)生的病機(jī)歸納為中氣衰弱、胃中虛寒、氣機(jī)沖逆、痰涎瘀血壅滯，為現(xiàn)代醫(yī)家治療本病打下基礎(chǔ)［10］。

本研究在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫GEO下載轉(zhuǎn)錄組胃癌數(shù)據(jù)集GSE118916，該數(shù)據(jù)集是由Li L等［11］在2019年通過胃癌患者臨床實(shí)驗(yàn)得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包含30個(gè)不同的樣本。該數(shù)據(jù)集基因表達(dá)差異分析得到不同表達(dá)趨勢(shì)的差異基因，并通過聚類分析展示顯著差異基因的表達(dá)情況，后續(xù)將該差異基因和在TCMSP數(shù)據(jù)庫中藥龍葵的靶基因進(jìn)行交集，得到NR3C1等17個(gè)中藥龍葵治療胃癌的核心基因。通過對(duì)該17個(gè)核心基因進(jìn)行GO富集分析，顯示龍葵涉及到驗(yàn)證反應(yīng)、蛋白激酶結(jié)合、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)等重要的生物學(xué)過程，部位包括細(xì)胞外間隙等，KEGG通路富集分析顯示腫瘤壞死因子經(jīng)典通路是富集程度最顯著的信號(hào)通路，相關(guān)研究表明，腫瘤壞死因子（TNF）可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，其遺傳多態(tài)性與多種腫瘤類型有關(guān)，攜帶TNF-β基因與252位點(diǎn)A等位基因與Hp 感染存在交互作用，對(duì)于胃癌有很高的易感性［12-13］。

藥用龍葵是茄科茄屬植物龍葵的全草，又被稱為天茄子、苦葵等，性寒味苦，入胃經(jīng)，在李時(shí)珍《本草綱目》中記載龍葵的功效為“療癰疽腫毒，跌打損傷，散瘀消腫”，常用于治療疔瘡、癰腫、丹毒等疾?。?4-15］。龍葵是一種富含較多化合物的植物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，龍葵全草中含有多種甾體生物堿，以及黃酮類化合物、小分子有機(jī)酸類等化合物，通過UHPLC-QExactive 高分辨質(zhì)譜和代謝組學(xué)技術(shù)鑒定出其含有化合物 89 個(gè)，得出甾體生物堿和甾體皂苷是龍葵的特征成分［16-17］，明確本藥的藥用化學(xué)成分及物質(zhì)基礎(chǔ)?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明龍葵可有效抑制胃癌，黃苗苗等［18］通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)龍葵堿可通過上調(diào)miR-140表達(dá)并下調(diào)MACC1，從而調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和凋亡；常樂等［19］通過MTT 法檢測(cè)龍葵多糖對(duì)于胃癌細(xì)胞的抑制作用，能顯著抑制MGC-803細(xì)胞增殖，阻止胃癌細(xì)胞周期進(jìn)程。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，進(jìn)一步總結(jié)和預(yù)測(cè)了胃癌的差異表達(dá)基因，以及龍葵抗胃癌的相關(guān)作用靶點(diǎn)，為下一步實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。