基于網(wǎng)絡藥理學探討丁香揮發(fā)油治療慢性萎縮性胃炎的作用機制

★ 蔡可珍 鄭琴 章德林 朱麗云 吳夢琪 楊明（江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室 南昌 330004）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是以胃黏膜固有腺體萎縮，數(shù)目減少，或伴腸腺化生和假幽門腺化生，或有異型增生（或上皮內(nèi)瘤變）為特征的慢性消化系統(tǒng)疾?。?］，在發(fā)展中國家的人群中，發(fā)生萎縮性胃炎的被感染者比例更高，并且與腸道類型的胃癌的發(fā)生率密切相關(guān)。幽門螺桿菌（Hp）感染后免疫反應介導慢性胃炎的發(fā)生、發(fā)展［2-3］。反復或持續(xù) Hp 感染、不良飲食習慣等均為加重胃黏膜萎縮和腸化生的潛在因素［4］。在眾多流行病學和病理學的研究中都已經(jīng)確定了萎縮性胃炎與胃癌之間的關(guān)系［5-6］。1980年初WHO將其定義為胃癌的前期疾?。?］。由于CAG的病因病機尚不明確，現(xiàn)代醫(yī)學對本病的治療仍缺乏滿意的治療手段。近年來，中藥由于具有治療和調(diào)理的雙重功能，且副作用少，已被慢性萎縮性胃炎患者廣泛接受［8-9］。

丁香為桃金娘科植物丁香（Eugenia caryophμllataThunb.）的干燥花蕾。具有溫中降逆，補腎助陽的功效。用于脾胃虛寒，呃逆嘔吐，食少嘔吐［10］。丁香揮發(fā)油的主要活性成分為丁香酚，具有抗炎、抑菌、麻醉、保護神經(jīng)細胞等藥理作用［11］。藥理實驗證明，丁香酚具有顯著的抗氧化活性，并能抑制幽門螺桿菌的定殖。在體內(nèi)試驗中，丁香酚可有效抑制HCl /乙醇誘導的胃部病變，并增加黏液含量，但不能有效地抑制胃液分泌［12］。丁香酚可以增加胃蛋白酶分泌和膽汁的分泌，有效改善腸胃功能，在中醫(yī)臨床上對寒邪內(nèi)侵，陽氣受困而見的嘔逆泄瀉，院腹疼痛等脾胃虛寒證有良好療效，是臨床上治療胃病的常用藥物［13］。但丁香揮發(fā)油治療CAG的機制尚未完全明確。本研究運用GC-MS方法對丁香揮發(fā)油成分進行分析,應用網(wǎng)絡藥理學的方法構(gòu)建“活性成分—靶點—通路—疾病”間的多層次網(wǎng)絡關(guān)系，探討丁香揮發(fā)油治療慢性萎縮性胃炎的作用機制，為后期深入研究提供理論基礎。

1 材料

1.1 藥材 丁香購自于江西江中中藥飲片有限公司（批號201015），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學藥學院劉榮華鑒定為桃金娘科丁香（EngeeniacaryophyllataThaunb）干燥花蕾。

1.2 試劑與儀器 無水硫酸鈉（西隴科學股份有限公司，批號1910141）、無水乙醇（西隴科學股份有限公司，批號2011039）均為分析純；DZTW調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；移液器（L14341J 德國艾本德股份公司）；EL104萬分之一天平（賽多利斯上海貿(mào)易有限公司）；Agilent 7890A/5975C型氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（美國安捷倫公司）。

2 方法

2.1 丁香揮發(fā)油的提取 精密稱取丁香飲片50 g,加入8倍量水，水蒸氣蒸餾法提取8 h,收集揮發(fā)油，加入適量無水硫酸鈉靜置過夜［14］。

2.2 丁香揮發(fā)油成分測定

2.2.1 樣品制備 取揮發(fā)油250 μL于5 mL容量瓶，用無水乙醇稀釋至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，加入進樣瓶，于4 ℃下冷藏，備用。

2.2.2 氣質(zhì)條件［15］氣相條件：色譜進樣口溫度：250 ℃,分流比：50∶1,接口溫度：300 ℃,四極桿溫度：150 ℃，離子源溫度：230 ℃，載氣類型:氦氣,進樣量：1 uL；質(zhì)量掃描范圍30～550。載氣流量設置為1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源類型：EI，電子能量：70 eV。升溫程序：50 ℃開始以6 ℃/min的速度升至100 ℃并保持2 min,繼而以5 ℃/min的速度升至150 ℃,保持5 min,再以4 ℃/min的速度升至200 ℃,保持5 min后以5 ℃/min的速度升至250 ℃，溶劑延遲3 min。采用Data Analysis將閾值調(diào)為16，篩選化學成分。

2.3 丁香揮發(fā)油活性成分的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學分析數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://swisstargetprediction.ch/）篩選丁香揮發(fā)油主要活性成分靶點，所得主要靶點錄入UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org），限定物種為“人類（Homo sapiens）”，檢索相應的UniProt ID，并獲取對應的基因簡稱。

2.4 慢性萎縮性胃炎靶點 運用OMIM（http://www.omim.org/）、DisGeNET數(shù) 據(jù) 庫（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）、Gene Cards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），以“慢性萎縮性胃炎”“Chronic atrophic gastrit”“atrophic gastritis”或“CAG”為關(guān)鍵詞，刪除重復靶點，獲取慢性萎縮性胃炎的疾病相關(guān)靶點。

2.5 丁香揮發(fā)油成分靶點與慢性萎縮性胃炎靶點的構(gòu)建 通過在線網(wǎng)站Venny 2.1.0（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中將丁香揮發(fā)油化學成分靶點與的慢性萎縮性胃炎靶點取交集，交集靶點即為丁香揮發(fā)油治療CAG的潛在作用靶點。將丁香揮發(fā)油化學成分與靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件中，構(gòu)建丁香揮發(fā)油化學成分作用靶點網(wǎng)絡圖。

2.6 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建 將“2.5”獲得的交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl），將組織（organism）設置為“homo sapiens”，閾值設為中等置信度0.7“Medium confidence”，獲取PPI網(wǎng)絡功能富集分析，PPI 結(jié)果以 tsv 格式下載，導入Cytoscape 3.7.1軟件，拓撲屬性分析篩選出PPI網(wǎng)絡中的關(guān)鍵靶蛋白。

2.7 GO生物功能及KEGG信號通路富集分析 采用DAVID（https://david.ncifcrf.govl）數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行GO生物功能與KEGG信號通路富集分析，設定標準為P＜0.05，通過imageGP作圖軟件對其結(jié)果進行可視化分析。

2.8 組織分布與亞細胞分布 根據(jù)度值，將2.5得出的關(guān)鍵共有靶點，通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫、BioGPS，獲取器官組織的分布信息和亞細胞分布息，導入Cytoscape 3.7.1軟件中，揭示潛在靶點作用部位。

2.9 分子對接 選擇PPI網(wǎng)絡中度值排名前五的靶點蛋白AKT1、VEGFA、SRC、EGFR、MAPK8作為對接蛋白與篩選的活性成分對接，在PBD數(shù)據(jù) 庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）以PBD格式下載蛋白3D結(jié)構(gòu)，在Pubchem（（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫下載3D結(jié)構(gòu)Sdf格式文件。使用PyMOL軟件對關(guān)鍵靶點蛋白進行去水、加氫等操作，保存為mol2格式。將準備好的靶點蛋白和化合物導入discovery studio 2016中進行分子對接。

3 結(jié)果

3.1 丁香主要活性成分 通過GC-MS測定出丁香揮發(fā)油化合物共22個，如表1所示，占揮發(fā)油總量的99.48%，其中含量最高為Eugenol（59.75%）。丁香揮發(fā)油GC-MS總離子流圖見圖1，大多為酚類、萜烯類、不飽和醇類以及苯類化合物。

表1 丁香揮發(fā)油主要化學成分

圖1 丁香揮發(fā)油總離子圖譜

3.2 丁香揮發(fā)油化學成分作用靶點的收集 將丁香揮發(fā)油的化學成分在TCMSP、Pubchem、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進行作用靶點預測，獲得作用靶點共756個，去除重復靶點后得到329個丁香揮發(fā)油化學成分作用靶點。

3.3 疾病潛在靶點篩選 通過OMIM數(shù)據(jù)庫、Dis Ge NET數(shù)據(jù)庫、Gene Cards數(shù)據(jù)庫搜索慢性萎縮性胃炎的疾病靶點，獲得1 411個基因靶點，刪除重復靶點后，獲取慢性萎縮性胃炎的疾病相關(guān)靶點1 246個。

3.4 丁香揮發(fā)油成分靶點與慢性萎縮性胃炎靶點交集靶點構(gòu)建 將329個丁香揮發(fā)油化學成分靶點與1 246個慢性萎縮性胃炎靶點進行映射，共獲得73個交集靶點，見圖2。將丁香揮發(fā)油化學成分與交集靶點分別導入Cytoscape 3.7.1軟件中。構(gòu)建“丁香化學成分-靶點”網(wǎng)絡圖，見圖3。其中有節(jié)點104個，邊200條，每條邊代表著“丁香揮發(fā)油-疾病靶點”之間的相互關(guān)系，通過運用Network Analyzer 插件計算分析網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，網(wǎng)絡節(jié)點的度值（Degree）越大，表示該節(jié)點與其他節(jié)點相互作用越多。（紫色三角形和粉色圓形的節(jié)點分別代表丁香的活性成分和對應靶點）。在網(wǎng)絡中，有28個節(jié)點的度值≥3.84（平均值），其中有效節(jié)點16個。見表2。

圖2 韋恩圖

圖3 “成分-靶點”網(wǎng)絡圖

表2 成分-靶點網(wǎng)絡有效節(jié)點

3.5 PPI構(gòu)建結(jié)果 將73個交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫中，獲取靶標蛋白互作關(guān)系。并將結(jié)果導入Cytoscape 3.7.1軟件中繪制靶蛋白互作網(wǎng)絡圖。PPI網(wǎng)絡由61個靶蛋白節(jié)點和190條相互作用的線組成，如圖4所示。運用 Network Analyzer 插件對靶點進行運算分析，將丁香潛在靶點信息按照Degree值排名整理分析，選取Degree＞中位數(shù)2倍（即8）以上，篩選出PPI網(wǎng)絡中關(guān)鍵靶點15個，AKT1、VEGFA、SRC、EGFR等，如表3所示。提示丁香揮發(fā)油治療慢性萎縮性胃炎可能與這些靶點顯著相關(guān)。

圖4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡

表3 核心靶點

3.6 丁香揮發(fā)油治療慢性萎縮性胃炎作用靶點GO生物功能富集分析結(jié)果 采用DAVID數(shù)據(jù)庫對丁香揮發(fā)油治療慢性萎縮性胃炎作用靶點GO生物功能富集分析，共獲得P＜0.05的GO功能條目234條，其中生物過程（BP）174條，細胞組分（CC）23條，分子功能（MF）37條。按P值從低到高排序，分別取BP、CC、MF前15個結(jié)果繪制成條形統(tǒng)計圖。生物過程主要富集在凋亡過程的負調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、炎 癥 反 應（inflammatory response）、細胞對機械刺激的反應（cellular response to mechanical stimulus）等，細胞組分主要富集在細胞外間隙（extracellular space）、細胞表面（cell surface）、膜筏（membrane raft）、胞漿的核周區(qū) 域（perinuclear region of cytoplasm）、胞 質(zhì)（cytosol）、溶酶體（lysosome）等，分子功能主要富集在酶結(jié)合（enzyme binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、蛋白結(jié)合（protein binding）、蛋白激酶結(jié)合（protein kinase bindig）等。見圖5-7。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG富集通路

3.7 KEGG通路富集分析 采用DAVID數(shù)據(jù)庫對丁香揮發(fā)油治療慢性萎縮性胃炎作用靶點KEGG通路富集分析，共獲得P＜0.01的通路有54條，如圖8所示，KEGG富集分析顯示，丁香揮發(fā)油可以作用于癌癥通路（Pathways in cancer）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、VEGF信號通路（VEGF signaling pathway）、ErbB信號通路（ErbB signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）等信號通路。

3.8 組織分布與亞細胞分布 將表2所示的關(guān)鍵靶點導入BioGPS數(shù)據(jù)庫獲取其組織分布信息將組織分布信息導入Cytoscape 3.7.1中繪制組織-靶點網(wǎng)絡圖，圖中節(jié)點大小代表度值大小，紫色三角形節(jié)點代表經(jīng)篩選后的關(guān)鍵基因，黃色節(jié)點代表組織，如圖7所示。結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點在平滑肌、全血、淋巴細胞、骨髓細胞中表達。

圖7 組織-靶點網(wǎng)絡圖

將表2所示的關(guān)鍵靶點導入Gene cards數(shù)據(jù)庫，保留confidence≥5的各靶點亞細胞分布信息，導入Cytoscape 3.7.1中繪制亞細胞-靶點網(wǎng)絡圖。紫色三角形節(jié)點代表經(jīng)篩選后的關(guān)鍵基因，橘色節(jié)點代表亞細胞結(jié)構(gòu)，如圖8所示。結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點更多分布于細胞核、細胞質(zhì)基質(zhì)、細胞質(zhì)膜、細胞外液。

圖8 亞細胞-靶點網(wǎng)絡圖

4 討論

“整體觀念”和“辨證論治”是中醫(yī)學理論體系兩大基本特點，中醫(yī)學并無“慢性萎縮性胃炎”這一病名，常常將其歸屬為“胃痞”“虛痞”“痞滿”“胃痛”“嘈雜”等范疇［16］。現(xiàn)代研究表明，中藥在治療與幽門螺桿菌感染（Hp）有關(guān)的CAG,改善患者病灶局部及全身癥狀、提高Hp敏感及耐藥菌株根除率等方面有顯著優(yōu)勢［17］。

本研究應用網(wǎng)絡藥理學篩選了丁香揮發(fā)油的生物活性成分及其治療慢性萎縮性胃炎的有效作用靶點。研究表明，丁香揮發(fā)油的主要成分為丁香酚、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯等成分?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，其主要成分丁香酚通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白、APAF-1、細胞色素C和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，抑制侵襲和血管生成，誘導細胞凋亡，表 現(xiàn) 為MMPs活 性 和MMP-2、MMP-9、VEGF、VEGFR1、TIMP-2和RECK表達的變化，達到預防胃癌的作用［18］。在胃愈傷活性研究中，丁香酚能幫助修復潰瘍組織結(jié)構(gòu)，恢復超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性。此外，丁香酚可降低胃黏膜髓過氧化物酶活性，增加黏蛋白的分泌［19］。

本研究通過GC-MS 篩選出丁香22個有效成分，成分靶點與疾病靶點交集出73個共同靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，丁香揮發(fā)油治療CAG的作用機制可能與其調(diào)控腫瘤壞死因子信號通路、VEGF信號通路、HIF-1信號通路，并對相關(guān)通路中的腫瘤因子（AKT1、VEGFA、PTGS2）、炎癥反應因子（IL1B）具有重要調(diào)節(jié)作用，進而參與急性炎癥應答、細胞因子調(diào)節(jié)、細胞凋亡等生物過程。VEGFA具有促進細胞遷移、增殖和血管形成的作用［20］。CAG 屬于癌前病變，抑制VEGFA在胃癌中的表達導致血管生成減少，從而減少對腫瘤的營養(yǎng)供應［21］。VEGF在慢性萎縮性胃炎及胃癌的表達有顯著性差異［22］。在宿主遺傳因素中，白細胞介素-1B（IL-1B）［23］和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）［24］的多態(tài)性與患胃癌的風險息息相關(guān)。幽門螺桿菌感染是CAG的主要因素。反復或持續(xù)的HP感染是CAG癌變的重要因素［25］。通過激活巨噬細胞分泌IL-1B和中性粒細胞的NF-κB來增強HP觸發(fā)的炎癥。Hp感染生理性誘導的IL1B通過影響炎癥細胞和上皮細胞而促進胃炎癥和癌變的發(fā)展［26］。PTGS2又名COX-2，是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素代謝中的關(guān)鍵酶。COX-2蛋白在胃癌發(fā)生的早期（癌前病變）呈高表達，并隨著胃黏膜病變的加重而逐漸升高［27］。HIF-1是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋-PAS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，通過影響血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達和微血管密度來調(diào)節(jié)血管形成。HIF-1α被證明可以促進胃癌的血管生成和腫瘤生長，可能是治療胃癌的候選分子靶點［28］。CDK5RAP3蛋白通過調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGFA信號通路可以抑制胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌的血管生成［29］。丁香揮發(fā)油的作用機制與上述腫瘤相關(guān)信號通路密切相關(guān)，進一步驗證了其臨床廣泛用于胃癌前病變和胃癌手術(shù)后輔助治療的適應癥。

綜上所述，本研究基于多成分、多靶點作用的研究思路,利用GC-MS技術(shù)檢測揮發(fā)油中的成分,并結(jié)合網(wǎng)絡藥理學的研究理念和手段,分析丁香揮發(fā)油治療慢性萎縮性胃炎的靶點，構(gòu)建丁香揮發(fā)油抗CAG靶點的交互作用網(wǎng)絡,富集抗CAG相關(guān)的生物過程和通路,闡述丁香抗CAG的機制,為丁香實驗研究及產(chǎn)品開發(fā)提供科學依據(jù)［30］，并為進一步在臨床運用及科學研究提供初步工作基礎，也從一定程度上為和新藥開發(fā)提供了新的方向。