MiR-24對肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移的影響

杜娟，嚴(yán)馨，邱麗，易靜葉，陽甜

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710061)

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤疾病[1]，截止2013年我國的肺癌發(fā)生率和病死率均居惡性腫瘤首位，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[2]。其中，非小細(xì)胞肺癌作為肺癌的常見亞型，約占所有病例的85%，傳統(tǒng)的化療藥物雖然可有效延長患者的生存期，但治療副作用較大，嚴(yán)重時還會危及患者生命[3-4]。微小核糖核酸24(micro ribonucleic acid 24，MiR-24等微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)作為機(jī)體內(nèi)的癌基因或抑癌基因，可通過抑制細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞的凋亡和分化過程，進(jìn)而影響宮頸癌、膽管癌等多種惡性腫瘤疾病的發(fā)生和進(jìn)展[5-7]。異常表達(dá)的MiR-24在惡性腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮出了“致癌”或“抑癌的作用”，甚至在惡性腫瘤疾病的放化療治療中也發(fā)揮出了一定的作用。然而，臨床中針對其在肺癌細(xì)胞中的影響研究卻相對較少，且其作用機(jī)制尚不明確。本研究分析MiR-24對肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移的影響，并探討其作用機(jī)制，期望為肺癌的靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人肺癌A549細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清 [賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，臺盼藍(lán)染色檢測試劑盒(上海碧云天)，噻唑藍(lán) [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT](上海碧云天)，兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)(美國Abcam公司)，兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)(美國Abcam公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(美國Abcam公司)，TUNEL染色試劑盒(上海碧云天)，青霉素/鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)，MiR-24擬似物(CATGAGGGCAGAAACCGATGCAA)和MiR-24抑制物(GTTGCATCGGTTTCTGCCCTCATG)由廣州銳博生物有限公司合成，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(上海碧云天)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(上海碧云天)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將人肺癌細(xì)胞A549放入10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的雙抗細(xì)胞培養(yǎng)基中，并將其放置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，QP-50)內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿約90%時進(jìn)行傳代，培養(yǎng)后取對數(shù)生長的細(xì)胞用于實驗。將加入MiR-24擬似物的細(xì)胞作為觀察組，加入MiR-24抑制物的細(xì)胞作為抑制組，另設(shè)空白對照作為對照組。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖能力 將人肺癌A549細(xì)胞接種于1×104/孔的96孔板(賽默飛世爾科技有限公司)內(nèi)，12 h后分別轉(zhuǎn)染MiR-24擬似物和抑制物，分別作為觀察組和抑制組，另設(shè)空白對照組，并在處理后分別于0、12、24和48 h各個不同時間段分別加入MTT，于37 ℃條件下孵育4 h，隨后加入100 μL DMSO，震蕩15 min后于490 nm處測量吸光值(optical density，OD)，以反映細(xì)胞增殖活力。OD490值越高，細(xì)胞的活力越高。平行試驗3次。

1.2.3 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 將處理后的人肺癌A549細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每孔3 mL，待細(xì)胞生長至90%融合后使用200 μL的吸頭在孔板內(nèi)垂直劃痕，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)對清洗3次后，將A549細(xì)胞分為3組，分別加入無血清培養(yǎng)基(對照組)、MiR-24擬似物(觀察組)和抑制物(抑制組)繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)立2個復(fù)孔，培養(yǎng)時間均為24 h。分別于實驗0 h和24 h于光學(xué)顯微鏡下觀察劃痕傷口的寬度并做好記錄，計算創(chuàng)面的愈合率作為細(xì)胞遷移能力的判定依據(jù)。創(chuàng)面愈合率=(1-24 h創(chuàng)面寬度/0 h創(chuàng)面寬度)×100%[8]。

1.2.4 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 將對數(shù)生長的人肺癌A549細(xì)胞接種于Transwell小室中，每孔密度為1×105，終體積為200 μL，將600 μL的無血清培養(yǎng)基加入至下室內(nèi)，待12 h后更換培養(yǎng)基，將A549細(xì)胞分為3組，分別加入無血清培養(yǎng)基(對照組)、MiR-24擬似物(觀察組)和抑制物(抑制組)繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)立2個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h后，使用棉簽將上層細(xì)胞擦去，使用濃度為95%的乙醇溶液固定20 min后，使用4%的臺盼藍(lán)染色20 min，于200倍的顯微鏡下觀察實驗結(jié)果，每個小室隨機(jī)抽取6個視野拍照并計算穿膜細(xì)胞個數(shù)。

1.2.5 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞處理24 h后進(jìn)行收集，裂解后再次收集細(xì)胞總蛋白，取等量的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后將其轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(poly(1,1-difluoroethylene)，PVDF)膜上，使用含有5%脫脂奶粉的封閉液將其封閉60 min，隨后加入兔抗MMP-2(1∶2 000)、兔抗MMP-9(1∶4 000)和鼠抗β-actin(1∶8 000)，于4 ℃的條件下反應(yīng)8 h，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶10 000)于室溫條件下反應(yīng)60 min，以GAPDH作為內(nèi)參照，使用凝膠分析軟件進(jìn)行分析，觀察內(nèi)參泳道灰度及目的條帶之間的比值作為蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)檢測相關(guān)mRNA表達(dá) 利用qPCR法針對人肺癌A549細(xì)胞中的MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，采用TRizol法提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37 ℃條件下反應(yīng)15 min，98 ℃條件下反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后將cDNA稀釋至5倍，放置于-20 ℃的條件下保存，隨后使用檢測試劑盒(天根生化科技有限公司)配置反應(yīng)體系并在PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司)上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃條件下15 min，95 ℃條件下10 s，62 ℃條件下10 s，共計反應(yīng)40個循環(huán)后，使用儀器自帶的程序分析溶解曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MiR-24對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

0 h時，觀察組和抑制組的OD490值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在12、24和48 h，觀察組的OD490值低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 MiR-24對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

2.2 MiR-24對肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響

單因素ANOVA分析結(jié)果顯示，各組間的遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)和愈合率比較，觀察組<對照組<抑制組，且組間三項指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1和圖2。

2.3 MiR-24對肺癌A549細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

單因素ANOVA分析結(jié)果顯示，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平比較，觀察組<對照組<抑制組，組間兩項指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3和圖3。

表2 MiR-24對肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響

表3 MiR-24對肺癌A549細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 MiR-24對肺癌A549細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

單因素ANOVA分析結(jié)果顯示，MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較，觀察組<對照組<抑制組，組間兩項指標(biāo)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 MiR-24對肺癌A549細(xì)胞相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

3 討論

肺癌是目前導(dǎo)致癌癥相關(guān)性死亡的常見病因，每年有180萬的肺癌新發(fā)病例，且有160萬人因肺癌死亡[9]，而肺癌患者的5年生存率僅有4%～17%[10]。臨床中，針對肺癌患者的治療方式包括手術(shù)治療、藥物治療和放射干預(yù)治療等，隨著近年來臨床治療水平的不斷提升，各種治療方式雖取得了一定的進(jìn)步，但肺癌患者的遠(yuǎn)期生存率仍相對較低，因此迫切需要一種更加有效的治療手段[11]。近年來，大量臨床研究[12-15]發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛存在于人體的體液、組織以及血液當(dāng)中，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后中至關(guān)重要，由于其可在血清中穩(wěn)定存在，且具有一定的重復(fù)性，因此在臨床中有較好的應(yīng)用價值[12]。譬如，MiR-21、MiR-34和MiR-23等多種miRNA均在肺癌組織中存在明顯的表達(dá)異常，對肺癌的發(fā)生和發(fā)展有重要作用[13-15]。

MiR-24在人體多種組織內(nèi)廣泛存在，可調(diào)控細(xì)胞的生長發(fā)育和增殖、凋亡，但其在不同細(xì)胞內(nèi)對細(xì)胞的增殖和凋亡調(diào)控作用卻并不相同[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)觀察組在12 h、24 h和48 h的細(xì)胞增殖率低于抑制組(P<0.05)，觀察組的遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)和愈合率均低于對照組和抑制組(P<0.05)，且對照組低于抑制組(P<0.05)，說明MiR-24過表達(dá)可有效抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，與既往研究[18]結(jié)果相似。

MMP是一種內(nèi)肽酶，可降解大部分的細(xì)胞外基質(zhì)成分，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破組織屏障，侵襲鄰近組織的能力[19]。MMP-2和MMP-9在許多腫瘤組織中均有所表達(dá)，不僅影響腫瘤細(xì)胞的組織屏障及其侵襲鄰近組織的能力，且對腫瘤細(xì)胞的黏附能力也可以產(chǎn)生一定的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2、MMP-9蛋白以及兩者mRNA的表達(dá)比較，觀察組>對照組>抑制組(P<0.05)，提示MiR-24可能通過對MMP-2和MMP-9表達(dá)水平的調(diào)控，進(jìn)而對肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，MiR-24可有效抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，且其作用機(jī)制與對MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。