一種罕見(jiàn)小額外標(biāo)記染色體的鑒定及臨床意義分析

王紅丹，夏海蘭，李永樂(lè)，高 越，張曉梅，馮戰(zhàn)啟

小額外標(biāo)記染色體 (small supernumerary marker chromosomes, sSMC) 是不能夠被傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)識(shí)別的多余的結(jié)構(gòu)異常染色體[1]。大約60%的sSMC衍生于染色體短臂或者近端著絲粒染色體近中心區(qū)域。人群中sSMC的發(fā)生率為0.6/1000左右[2]，是一種罕見(jiàn)染色體異常。25%～30%被發(fā)現(xiàn)的sSMC產(chǎn)生于15號(hào)染色體，sSMC(15)是最常見(jiàn)的sSMC類型[2]。起源于10號(hào)染色體的sSMC更為罕見(jiàn)，截至目前國(guó)內(nèi)外僅見(jiàn)10余例報(bào)道。sSMC的臨床效應(yīng)取決于sSMC中常染色質(zhì)的含量，染色體的起源以及嵌合比例等因素，因此，為了更好地了解核型與表型的相關(guān)性，繼續(xù)研究報(bào)道更多的sSMC病例，特別是起源于10號(hào)染色體的罕見(jiàn)特征性病例。該研究對(duì)一攜帶sSMC(10)的患者進(jìn)行了臨床表型、遺傳特征及臨床意義分析。

1 材料與方法

1.1 病例資料患兒母親，29歲，G3P1，有兩次早孕期胎停史，未進(jìn)行遺傳咨詢?；純焊赣H，30歲，既往體健。患兒，女，7月齡，因新生兒窒息、缺血缺氧性腦病、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩來(lái)河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所遺傳門(mén)診進(jìn)行遺傳咨詢，患兒體檢未見(jiàn)明顯結(jié)構(gòu)畸形?；純焊改敢呀?jīng)簽署知情同意書(shū)，本研究通過(guò)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析 取患兒及其父母肝素鈉抗凝血2 ml，接種于人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，持續(xù)培養(yǎng)72 h，收獲前1 h加入秋水仙素，經(jīng)過(guò)氯化鉀低滲處理、固定、滴片和烤片等常規(guī)過(guò)程制片。胰酶消化后采用Giemsa染色進(jìn)行顯帶。采用全自動(dòng)染色體核型分析系統(tǒng)(德國(guó)LEICA公司)計(jì)數(shù)30個(gè)分散良好且顯帶清晰的分裂相進(jìn)行分析。

1.2.2染色體芯片分析(chromosomal microarray analysis, CMA) 采集患兒及父母外周血2 ml，應(yīng)用柱式全血基因組DNA提取試劑盒 (德國(guó)QIAGEN公司)提取基因組DNA。采用Qubit定量平臺(tái)(美國(guó)Qubit 3.0)定量DNA的濃度。應(yīng)用Agilent公司生產(chǎn)的 SurePrint G3 Human CGH Microarray 8×60K芯片(美國(guó)Agilent公司)對(duì)患者及其父母全基因組CNVs進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)原理是將患者樣本DNA與正常對(duì)照樣本DNA分別用不同的熒光素標(biāo)記(cy3/cy5)標(biāo)記、純化后進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性雜交，采用Agilent Microarray Scanner對(duì)芯片進(jìn)行掃描，運(yùn)用Agilent CytoGenomics Edition軟件得到定量的拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果。軟件參數(shù)設(shè)置為對(duì)基因檢測(cè)片段中連續(xù)3個(gè)探針logR值≥0.25或logR≤-0.25的CNVs進(jìn)行標(biāo)示。據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，大約99.34%致病性拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNVs)長(zhǎng)度均大于300 kb，對(duì)200 kb以上CNVs進(jìn)行檢測(cè)并做出提示。此芯片檢測(cè)不能排除更小的染色體結(jié)構(gòu)異常的可能性。芯片序列信息來(lái)源于2009年2月UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)提供的人類基因組參考序列(GRCh37/hg19)。

1.2.3影像學(xué)檢查 患兒于出生第2天及第11天進(jìn)行了MRI檢查，序列：IR FRFSE SE/EPI；AXI：TIFLAIR&T2FLAIR，F(xiàn)RFSE T2WI；SE/EPI DWI SAG：T1FLAIR。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果患兒母親染色體核型為46, XX, t (10; 13)(p11.1;q11)[11]/ 46, XX[19](圖1)?；純焊赣H染色體核型結(jié)果正常，核型為46，XY?；純喝旧w核型為47, XX, +mar(圖2)。

圖1 患兒母親G顯帶染色體核型分析圖

2.2 CMA技術(shù)分析結(jié)果患兒父母CMA檢測(cè)結(jié)果顯示不存在200 kb以上CNVs?；純篊MA檢測(cè)結(jié)果顯示10號(hào)染色體p15.3p11.1區(qū)域LogR值顯著升高，大約在0.5附近，提示患兒10號(hào)染色體p15.3p11.1區(qū)域發(fā)生了3拷貝重復(fù)。CMA分子核型為：arr[hg19] 10p15.3p11.1(148,206～38,545,928)×3，片段大小為38.39 Mb，13號(hào)染色體未見(jiàn)重復(fù)和缺失(圖3)。

圖2 患兒G顯帶染色體核型分析圖

圖3 患兒CMA檢測(cè)結(jié)果

2.3 影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果患兒于出生第2天進(jìn)行了頭部MRI檢查?？梢?jiàn)左側(cè)顳葉、右側(cè)枕葉異常信號(hào)，雙側(cè)側(cè)腦室后角內(nèi)積血，符合缺氧缺血性腦??；Dandy-Walker畸形，枕大池內(nèi)有積血；胼胝體異常信號(hào)及左側(cè)頭皮下血腫。出生第11天進(jìn)行了頭部MRI復(fù)查，與前片相比，右側(cè)額葉新見(jiàn)異常信號(hào)區(qū)，有局部腦軟化形成趨勢(shì)，余同前片。CT檢測(cè)結(jié)果支持缺血缺氧性腦病。

2.4 回顧性總結(jié)以往sSMC(10)病例對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的sSMC(10)病例進(jìn)行了遺傳學(xué)和臨床總結(jié)。見(jiàn)表1。

表1 文獻(xiàn)報(bào)道的sSMC(10)病例的遺傳學(xué)及臨床特征

3 討論

加用傳統(tǒng)核型分析以外的遺傳學(xué)檢測(cè)方法，明確sSMC的衍生來(lái)源、大小、嵌合比例、組成結(jié)構(gòu)以及包含的基因等顯得尤為重要，是臨床進(jìn)行遺傳學(xué)診斷及產(chǎn)前診斷的依據(jù)。針對(duì)有明確臨床表型，同時(shí)核型檢測(cè)到sSMC的病例，目前臨床多采用CMA進(jìn)行復(fù)查及確診。但是需要注意的是CMA不能檢測(cè)到平衡易位、倒位、低比例嵌合及多倍體等情況。

各個(gè)報(bào)道給出的sSMC攜帶頻率不盡相同，目前尚無(wú)中國(guó)人群攜帶sSMC頻率等相關(guān)報(bào)道。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，sSMC在人群中比較罕見(jiàn)，本病例代表一種新的sSMC(10)細(xì)胞遺傳學(xué)形成機(jī)制，這在以往尚未見(jiàn)報(bào)道。課題組應(yīng)用CMA技術(shù)對(duì)患兒基因組DNA進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CMA分子核型為：arr[hg19]10p15.3p11.1(148,206～38,545,928)×3，片段大小為38.39 Mb。結(jié)合父母核型結(jié)果，分析患兒mar可能主要是由10號(hào)染色體短臂組成。

由于sSMC的常染色體組成、與sSMC同源的親本染色體嵌合比例以及單親二倍體程度等的不同，特定sSMC的表型是難以預(yù)測(cè)的。研究者普遍認(rèn)為，攜帶sSMC的表型主要取決于sSMC中常染色質(zhì)的含量以及嵌合比例。來(lái)自于10號(hào)染色體的sSMC非常罕見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)已報(bào)道的sSMC(10)案例進(jìn)行了總結(jié)，詳見(jiàn)表1。這些病例中，其中有5例出現(xiàn)異常表型。未見(jiàn)異常表型的染色體來(lái)源區(qū)段分布在10p11.2q11.2以及10pterp14-15[6,11-12]。Trimbom et al[10]報(bào)道的患者是一個(gè)例外，報(bào)道了一個(gè)攜帶環(huán)狀sSMC的14歲女孩(淋巴細(xì)胞嵌合比例為14%)呈現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、智力低下、肌張力減退、注意力下降等表型。由于技術(shù)手段的局限性，這些病例并未進(jìn)行單親二倍體檢測(cè)，如果sSMC同源的親本染色體來(lái)源于一個(gè)親本，這樣的患者是有可能表現(xiàn)出異常表型的。排除單親二倍體以及其它未檢測(cè)到的遺傳學(xué)改變的情況下，臨床上遇到10p11.2q11.2的sSMC，可以認(rèn)定為良性變異。Snyder et al[5]和Chen et al[8]報(bào)道的病例幾乎涉及到整個(gè)10號(hào)染色體短臂，患者出現(xiàn)了腎臟發(fā)育不全，指甲發(fā)育不全等多發(fā)畸形。Blennow et al[4]報(bào)道的10p11.1p12是涉及范圍最小的致病性sSMC，本病例顯示10p11.2p12可能是比較重要的致病區(qū)域，但其對(duì)sSMC范圍的認(rèn)定可能不是那么精確，且未進(jìn)行單親二倍體檢測(cè)。

本研究患者由于涉及的片段比較大，幾乎涉及到整條10號(hào)染色體短臂，且sSMC占比達(dá)到100%，依照ACMG和Clingen制定的CNV致病性判定指南，判定該CNV為致病性，該sSMC即為患兒致病原因。本例患兒是由于母親的染色體易位，形成sSMC，在卵子形成過(guò)程中沒(méi)有參與細(xì)胞分裂，遺傳至患兒，核型分析顯示該sSMC是由10號(hào)染色體的短臂和13號(hào)染色體短臂隨體組成。本病例這種新的sSMC(10)細(xì)胞遺傳學(xué)形成方式在以往尚未見(jiàn)報(bào)道。該患兒未見(jiàn)明顯的結(jié)構(gòu)畸形，進(jìn)行了腦部核磁檢測(cè)，留下了珍貴的病例資料。患兒腦部發(fā)現(xiàn)Dandy-Walker畸形等，這在以往尚未見(jiàn)報(bào)道，于以后的臨床遺傳學(xué)工作是一種啟示。