TAK-733對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究

鄭 朦，魏 楓，邵 國，王曉艷，程 冉，張 苑

甲狀腺癌(thyroid cancer，TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤，其中，人甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)占所有TC的70%～80%，是最常見的類型[1]。目前國際上公認(rèn)的PTC常規(guī)治療手段為“手術(shù)+131I+促甲狀腺激素(TSH)抑制治療”[2]，大多數(shù)患者預(yù)后良好，但仍有1/3的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)[3]。已知PTC的發(fā)生、發(fā)展與某些信號(hào)通路的活性改變存在密切聯(lián)系。其中Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的過度激活是其中最為常見的遺傳學(xué)變異，與細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)[4]。近年來隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，特異靶向信號(hào)通路關(guān)鍵分子的抑制劑成為新藥研發(fā)的重點(diǎn)[5]。(R)-3-(2,3-二羥丙基)-6-氟-5-((2-氟-4-碘苯基)氨基)-8-甲基吡啶[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733)是一種高效選擇性的非ATP競爭性MEK 1/2激酶變構(gòu)抑制劑，于2011年被首次合成。de la Puente et al[6]研究表明TAK-733在多發(fā)性骨髓瘤中表現(xiàn)出抗腫瘤活性，其可抑制多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。該研究以人甲狀腺乳頭狀癌(thyroid papillary carcinoma,TPC)-1細(xì)胞為研究對(duì)象，通過體外細(xì)胞初步探討TAK-733對(duì)PTC的影響,為PTC的藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株 人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞購自上海復(fù)旦細(xì)胞庫。

1.1.2藥物與試劑 TAK-733購自美國MCE公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(trypsin)、青鏈霉素混合液購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)和MTT粉末購自美國Sigma公司；碘化丙啶(PI)和細(xì)胞凋亡試劑盒Annexin V-FITC購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；RNA酶(RNase A)購自北京天根生物科技公司

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 3111型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；ELX-800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD 公司)；TE2000-U倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) TPC-1細(xì)胞用含10% FBS，1%青鏈霉素混合液的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 將人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組的藥物濃度梯度分別為2.5、5、10 μmol/L，對(duì)照組加入普通培養(yǎng)基。

1.2.3溶液配制 按照產(chǎn)品說明書寫明的方法使用DMSO將TAK-733粉末完全溶解，配制成終濃度為20 mmol/L的儲(chǔ)存液。實(shí)驗(yàn)過程中用RPMI 1640培養(yǎng)基將其稀釋成終濃度為2.5、5、10 μmol/L的工作液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4MTT比色分析法檢測細(xì)胞增殖抑制率 取處于對(duì)數(shù)生長期的TPC-1細(xì)胞，以3×104個(gè)/ml 接種于96孔板中，每孔加入100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)過夜后實(shí)驗(yàn)分組同1.2.2,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物干預(yù)24、48、72 h后，向各孔加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，使紫色結(jié)晶充分溶解。將酶標(biāo)儀波長設(shè)為490 nm，檢測各孔吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率，抑制率=(OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/OD對(duì)照組×100%。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 將TPC-1細(xì)胞以1×106個(gè)/皿密度接種于 60 mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)分組同1.2.2，分別于24、48 h后用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min后用提前預(yù)冷的PBS洗2次，收集細(xì)胞沉淀于75%冷乙醇中固定過夜，24 h后1 200 r/min離心5 min，棄去乙醇，PBS洗2次，PBS重懸細(xì)胞，加入RNase A，37 ℃水浴30 min，加入PI染料，室溫下染色30 min后應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析488 nm處激發(fā)波長熒光強(qiáng)度。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞的接種培養(yǎng)及分組同1.2.5。藥物干預(yù)24、48 h后收集各組細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min,預(yù)冷PBS洗滌2遍,1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1×Binding Buffer 500 μl重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻,室溫避光孵育10～15 min，然后以流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測分析。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.7劃痕愈合試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取處于對(duì)數(shù)生長期的TPC-1細(xì)胞，消化離心后將細(xì)胞按5×105個(gè)/ml的密度接種至6 孔板，每孔2 ml細(xì)胞懸液。待細(xì)胞貼壁后，用200 μl槍頭于培養(yǎng)孔正中處垂直劃線，PBS 緩沖液清3次，實(shí)驗(yàn)分組同1.2.2項(xiàng)。熒光倒置顯微鏡下分別拍照記錄0 h和24 h的劃痕區(qū)域面積; 遷移率(%)=(1-24 h劃痕區(qū)域面積/0 h劃痕區(qū)域面積)×100%。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TAK-733對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)顯示，比較3個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖抑制率,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。當(dāng)處理時(shí)間一定時(shí)，隨著TAK-733的濃度增加，TPC-1細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增高(F=336.822、671.322、1 498.396,P<0.05)；且相同濃度的TAK-733在不同的作用時(shí)間點(diǎn)，隨著作用時(shí)間的不斷延長，TPC-1細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸增高(F=86.547、296.955、296.222,P<0.05)，TAK-733對(duì)TPC-1細(xì)胞生長的抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性。見表1。

表1 不同濃度TAK-733對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 不同濃度TAK-733 對(duì) TPC-1細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測TAK-733實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞周期，結(jié)果顯示相比于對(duì)照組，隨著TAK-733處理濃度增加，G1/G0期細(xì)胞比例逐漸增多(F=58.536、179.347,P<0.05)，S期(F=34.894、76.293,P<0.05)和G2/M期(F=24.192、96.688,P<0.05)細(xì)胞比例相對(duì)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而當(dāng)處理濃度一定時(shí)，隨著時(shí)間的延長，G1/G0期細(xì)胞比例亦逐漸增多(t=-10.447、-12.209、-8.839,P<0.05)，S期(t=8.003、9.682、10.342，P<0.05)和G2/M期(t=6.112、10.220、3.349，P<0.05)細(xì)胞比例逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明細(xì)胞發(fā)生G1/G0阻滯，此時(shí)TPC-1細(xì)胞的生長停滯，且這種抑制作用隨著作用濃度的增加和時(shí)間的延長而逐漸加強(qiáng)。見表2及圖1、2。

表2 不同濃度TAK-733作用不同時(shí)間對(duì)TPC-1細(xì)胞周期的影響

圖1 不同濃度TAK-733對(duì)TPC-1細(xì)胞作用不同時(shí)間細(xì)胞周期的分布圖

圖2 不同濃度TAK-733對(duì)TPC-1細(xì)胞作用不同時(shí)間細(xì)胞周期的百分比

2.3 不同濃度TAK-733 對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組凋亡率均增高，處理時(shí)間一定時(shí)，隨著TAK-733濃度的增加，凋亡率逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.929、94.542,P<0.05)。并且相同濃度的TAK-733作用48 h后的凋亡率高于24 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.888、-4.962、-4.275，P<0.05)。見圖3、4。

2.4 不同濃度TAK-733 對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移的影響不同濃度的TAK-733作用于TPC-1細(xì)胞后，TPC-1細(xì)胞的遷移能力不同，實(shí)驗(yàn)組的劃痕愈合率均小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=37.086,P<0.05)，且隨著TAK-733濃度的增加，劃痕愈合率亦逐漸降低。見圖5、6。

3 討論

作為最常見的內(nèi)分泌癌，TC約占全身惡性腫瘤的1%[7]。近年來TC的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，其中以PTC情況最為突出。盡管PTC常規(guī)治療后總體預(yù)后良好，5年生存率可達(dá)到98%[8]，但出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的部分患者仍然值得關(guān)注。為了降低術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)、改善患者的生存狀況，從分子生物學(xué)層面深入了解惡性腫瘤的相關(guān)致病機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近年來，靶向藥物在惡性腫瘤的中晚期治療中的成功應(yīng)用被廣泛認(rèn)可，為廣大患者帶來了福音與希望。因此，靶向藥物的開發(fā)與利用是當(dāng)前腫瘤治療的潮流所向。

圖3 不同濃度TAK-733作用不同時(shí)間的TPC-1細(xì)胞凋亡率的分布圖

圖4 不同濃度TAK-733作用不同時(shí)間對(duì)TPC-1細(xì)胞凋亡率的影響

Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的過度激活被認(rèn)為在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用?，F(xiàn)有研究[9-11]已證實(shí)，在PTC中亦存在Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路過度激活。該信號(hào)通路的激活在于Raf、MEK、ERK依次發(fā)生磷酸化[12]。磷酸化的ERK進(jìn)一步影響其下游重要的信號(hào)分子，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移等重要的生理活動(dòng)。在整個(gè)通路中，ERK是MEK下游的唯一底物，這無疑表明了MEK在通路中至關(guān)重要的地位。近年來，關(guān)于針對(duì)MEK抑制劑的研發(fā)得到了廣泛關(guān)注。TAK-733作為一種新型的MEK 1/2抑制劑，可選擇性結(jié)合并抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路上的關(guān)鍵信號(hào)分子MEK 1/2的活性，從而阻止了依賴MEK 1/2的效應(yīng)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的激活，尤其對(duì)MEK 1/2下游靶點(diǎn)ERK 1/2的磷酸化有明顯的抑制作用[13]。多項(xiàng)研究證實(shí),TAK-733在多種惡性腫瘤中可發(fā)揮抗腫瘤作用。von Euw et al[14]體外細(xì)胞研究提示TAK-733干預(yù)后黑色素瘤細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。Baranski et al[15]通過實(shí)驗(yàn)表明TAK-733作用于骨肉瘤細(xì)胞后，可引起MOS和U2OS兩種細(xì)胞的凋亡蛋白Caspase 3/7顯著增加。

圖5 不同濃度TAK-733處理TPC-1細(xì)胞24 h的劃痕分布

圖6 不同濃度TAK-733對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度TAK-733處理TPC-1細(xì)胞24、48、72 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率均高于對(duì)照組，且低、中、高劑量組細(xì)胞增殖抑制率依次增高,均隨處理時(shí)間的延長而增高，這與Micel et al[13]對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的研究中顯示TAK-733可抑制細(xì)胞的增殖結(jié)果類似。因此，可推斷TAK-733作用于人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞，MAPK/ERK通路的的活化程度被抑制后細(xì)胞的增殖能力減弱。

為對(duì)TAK-733抑制TPC-1細(xì)胞增殖的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行更深一步的探索，該研究采用了流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，以不同濃度TAK-733分別處理TPC-1細(xì)胞24、48 h后，TPC-1細(xì)胞的G1/G0期細(xì)胞比例均上升，而S期和G2/M期細(xì)胞比例則相對(duì)降低。隨著TAK-733濃度的逐漸增加和處理時(shí)間的延長，G1/G0期細(xì)胞比例逐漸增高，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。提示TAK-733可阻滯細(xì)胞周期，使TPC-1細(xì)胞發(fā)生G1/G0期停滯，細(xì)胞分裂不能繼續(xù)往下進(jìn)行，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。

該研究還采用Annexin V-FITC/PI雙染法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行了檢測。以不同濃度TAK-733分別處理TPC-1細(xì)胞24、48 h。與對(duì)照組相比，不同濃度的TAK-733干預(yù)后細(xì)胞的凋亡率均增高，且低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率依次增高,各組凋亡率均隨處理時(shí)間的延長而增高。進(jìn)一步證實(shí)TAK-733可促進(jìn)TPC-1細(xì)胞的凋亡。

此外，該研究還通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)初步研究腫瘤細(xì)胞的遷移能力,通過計(jì)算細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的劃痕愈合率來判斷細(xì)胞遷移能力的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)中觀察到與對(duì)照組相比，低、中、高濃度的TAK-733干預(yù)TPC-1細(xì)胞24 h后細(xì)胞的劃痕愈合率均降低，且隨著TAK-733濃度的逐漸增加，劃痕愈合率逐漸降低。提示TAK-733在PTC的發(fā)展中可抑制TPC-1細(xì)胞的遷移，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用。

綜上所述，TAK-733能通過將TPC-1細(xì)胞阻滯于G1/G0期而抑制細(xì)胞的增殖和遷移, 促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。該研究為PTC的靶向治療提供了新的思路。