LncRNA SIL對肺泡上皮細胞增殖和遷移的抑制作用研究

張萬方，潘鵬濤，何金嬌，朱艷平，王選年

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是以肺部蜂窩狀結(jié)構(gòu)改變引起限制性通氣障礙為主要特征的一種間質(zhì)性肺部疾病。大量研究證明lncRNA與肺纖維化有重要的關(guān)系，例如，lncRNA PFAR[1]，lncRNA ZEB1-AS1[2]，lncRNA ITPF[3]，lncRNA PFRL[4]以及l(fā)ncRNA PFAL[5]等參與了肺纖維的發(fā)生過程。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF-β1)是誘導(dǎo)肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子[6]。使用TGF-β1誘導(dǎo)后，肺泡上皮細胞標志蛋白E-Cadherin(E.cad)的表達量降低，間質(zhì)細胞標志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和Collagen-1的表達量升高[7]。LncRNA SIL是突觸極蛋白2(SYNPO2)第四個內(nèi)含子[8]，前期研究顯示lncRNA SIL在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化組織中表達降低，推測lncRNA SIL可能是肺纖維化的潛在抑制因子。該文研究了lncRNA SIL在TGF-β1誘導(dǎo)肺泡上皮細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)中的表達變化，并構(gòu)建了lncRNA SIL真核表達載體，通過研究過表達lncRNA SIL后肺泡上皮細胞生長特性以及標志蛋白表達的變化，分析lncRNA SIL在肺纖維化發(fā)生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料肺泡上皮細胞株(A549)購自上海生物科學研究所；鼠抗人抗體PCNA、E.cad 、α-SMA和Collagen-1購自美國Abcam公司；鼠抗人抗體GAPDH 購自美國Santa Cruz公司；羊抗鼠二抗購自美國Abcam公司。熒光顯微鏡80i購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1RNA 熒光原位雜交(RNA fish) 細胞RNA fish采用廣州博銳生物科技有限公司 lncRNA FISH 試劑盒，按照說明書的要求進行原位雜交實驗。具體步驟如下：細胞通過4%的多聚甲醛室溫固定10 min，每孔加入1 ml 預(yù)冷的0.5% Triton X-100 的PBS，4 °C靜置 5 min；加入1× PBS清洗細胞 3次，每次5 min，加入RNA探針37 °C孵育過夜，避光42 ℃，SSC緩沖液清洗細胞3次，每次5 min，清洗、避光，加入DAPI 染色液，室溫染色10 min, 使用熒光顯微鏡觀察并拍照記錄(80i, 日本Nikon公司)。

1.2.2轉(zhuǎn)染 合成的全長lncRNA SIL連接在pCMV-sport6載體上，使用Lipo3000將lncRNA SIL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A549細胞中，pCMV-sport6空載體做為陰性對照，在轉(zhuǎn)染后4～6 h更換完全培養(yǎng)液，同時加入TGF-β1(5 μmol/L)誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)24、48 h收材作進一步檢測。

1.2.3RT-PCR 收集處理后的A549細胞，加入TRIzol消化，提取RNA。使用Nanodrop 2000檢測RNA的純度和濃度，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，加入引物、2×qPCR MasterMix (SYBR Green)和ddH2O，混勻后放入熒光定量PCR儀中，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。根據(jù)公式2-△△Ct，以GADPH為內(nèi)參進行定量分析。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列表

1.2.4細胞劃痕實驗 收集細胞、計數(shù)并以5×105個/L的密度鋪板，待細胞密度達到70%時轉(zhuǎn)染，24 h后使用無菌20 μl槍頭劃線，隨后PBS洗細胞3次，加入0.5%血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于0、24、48 h采集細胞遷移圖像，觀察細胞傷口愈合情況并計算細胞的遷移率[9]。

1.2.5Western blot 取處理后的細胞，裂解細胞提取總蛋白。SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1～2 h，加入一抗 PCNA (1 ∶1 000)，E.cad (1 ∶1 000)，α-SMA (1 ∶1 000)，Collagen-1 (1 ∶500)，GAPDH (1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜，加入HRP 標記的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h。加入ECL試劑進行顯色。

1.2.6免疫熒光實驗 在24孔板中放入蓋玻片，接種A549細胞，待細胞長到70%～80%時轉(zhuǎn)染，48 h后，使用4%多聚甲醛固定細胞5 min，PBST洗滌3次，每次5 min，加入含有1% BSA的封閉液室溫封閉1 h，加入PBST清洗3次，每次5 min，加入一抗(1 ∶200)，4 ℃封閉過夜，避光條件下加入Cy3標記的二抗(1 ∶500)，室溫孵育1 h，加入PBST洗滌3次，每次5 min。避光加入DAPI室溫孵育10 min，固定到載玻片上，于熒光焦顯微鏡下觀察拍攝照片[10]。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA SIL在TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中表達降低在培養(yǎng)的肺泡上皮細胞A549中加入TGF-β1誘導(dǎo)EMT，并分別通過RNA fish與RT-PCR檢測lncRNA SIL的表達情況。結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)48 h后細胞中的lncRNA SIL的表達量與陰性對照組和轉(zhuǎn)染lncRNA對照組相比熒光強度和數(shù)量均降低(圖1A)。RT-PCR檢測TGF-β1誘導(dǎo)24 h和48 h后lncRNA SIL的表達情況，結(jié)果顯示，lncRNA SIL的表達量隨著TGF-β1的誘導(dǎo)時間的延長逐步降低，方差分析顯示，3組之間lncRNA SIL的表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=298.8,P<0.01)，誘導(dǎo)24 h細胞lncRNA SIL的表達量低于未誘導(dǎo)組(F=14.4,P<0.05)，誘導(dǎo)48 h細胞lncRNA SIL的表達量低于與誘導(dǎo)24 h(F=10.25,P<0.01)(圖1B)。

2.2 過表達lncRNA SIL抑制肺泡上皮細胞A549遷移lncRNA SIL基因序列全長為1 914 nt，由上海生工生物工程有限公司合成，構(gòu)建重組真核表達載體pCMV-lncRNA SIL。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCMV-lncRNA SIL轉(zhuǎn)染到肺泡上皮細胞A549中，其中空載體pCMV為陰性對照。結(jié)果顯示，與空載體pCMV對照組相比，轉(zhuǎn)染lncRNA SIL后細胞的遷移能力降低，見圖2。

2.3 過表達lncRNA SIL抑制肺泡上皮細胞A549增殖lncRNA SIL對A549細胞增殖方面作用的研究結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后，過表達lncRNA SIL組細胞的增殖能力低于對照組；細胞增殖相關(guān)蛋白PCNA和Ki67表達變化的研究顯示，過表達lncRNA SIL后，PCNA的表達量與對照組相比降低；Ki67 mRNA表達水平也比對照組降低，免疫熒光結(jié)果圖中可以看出過表達lncRNA SIL組細胞Ki67蛋白的熒光信號比對照組減少，見圖3。

2.4 過表達lncRNA SIL抑制間質(zhì)細胞標志蛋白的表達lncRNA SIL在TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中對相關(guān)細胞標志蛋白表達變化的研究結(jié)果顯示。當使用TGF-β1對細胞進行誘導(dǎo)時，標志蛋白α-SMA和Collagen-1的表達量比未誘導(dǎo)組升高。當TGF-β1誘導(dǎo)并同時轉(zhuǎn)染lncRNA SIL后，標志蛋白α-SMA和Collagen-1的表達量與轉(zhuǎn)染空載體pCMV相比降低，標志蛋白E.cad的表達量與轉(zhuǎn)染空載體pCMV相比升高。由此說明lncRNA SIL能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，也揭示出lncRNA SIL很有可能通過抑制EMT最終達到抑制肺纖維化的目的。

圖1 LncRNA SIL在TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞A549間質(zhì)轉(zhuǎn)化中表達降低 ×400

圖2 過表達lncRNA SIL抑制肺泡上皮細胞A549遷移 ×40與空載體pCMV組比較：**P<0.01

3 討論

LPF是一種慢性、進行性、不可逆性的肺間質(zhì)組織異質(zhì)性疾病，隨著年齡增長顯著增加，男性發(fā)病率更高，發(fā)病機制不清楚，致殘率、病死率高，診斷后的平均生存期僅為2～5年[11]。因此研究肺纖維化的發(fā)病機制對臨床診斷和治療具有重要的意義。

LncRNA通常指一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，雖然lncRNA不具有編碼蛋白的功能，越來越多的研究[12]發(fā)現(xiàn)，lncRNA與細胞生長、增殖、遷移、侵襲以及藥物耐性等多種重要生命過程有重要的關(guān)系。近年有研究[13]發(fā)現(xiàn)一些lncRNA參與到了肺纖維化發(fā)生的調(diào)控中，例如lncRNA DNM3OS在TGF-β誘導(dǎo)的肺肌細胞激活中發(fā)揮重要作用；lncRNA sirt1 AS能夠抑制TGF-β1介導(dǎo)的EMT[4]；lncRNA H19在IPF患者以及博來霉素處理小鼠的肺組織中表達上調(diào)，缺失lncRNA H19可改善博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[14]等。LncRNA SIL是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，本實驗的前期研究結(jié)果顯示lncRNA SIL在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中表達降低，因此推測其可能參與了肺纖維化的調(diào)控。本文為研究lncRNA SIL對TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程的影響，首先利用TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞進行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并檢測誘導(dǎo)后lncRNA SIL的表達量的變化。結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)后細胞中l(wèi)ncRNA SIL表達量低于對照組，此結(jié)果與前期動物模型中的結(jié)果一致。為了進一步證明lncRNA SIL的作用，構(gòu)建了lncRNA SIL真核表達載體，通過向A549細胞中轉(zhuǎn)染lncRNA SIL，分析過表達lncRNA SIL后對細胞的增殖與遷移能力的影響。結(jié)果顯示，過表達lncRNA SIL后細胞的增殖與遷移能力均比對照組降低；對相關(guān)標志蛋白的研究結(jié)果從另一方面證明了lncRNA SIL的作用，結(jié)果顯示，過表達lncRNA SIL后，與對照組相比間質(zhì)細胞標志蛋白α-SMA和Collagen-1的表達降低，而肺泡上皮細胞標志蛋白E.cad的表達升高。以上結(jié)果證明lncRNA SIL很可能是一種肺纖維化的抑制因子，其通過抑制肺泡上皮細胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)化最終達到抑制肺纖維化的目的。

圖3 過表達lncRNA SIL對A549細胞增殖能力的影響

圖4 過表達lncRNA SIL對抑制間質(zhì)細胞標志蛋白的表達與空載體組比較：*P<0.05