尿石素B對膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞生物學行為的影響

劉翠蘭，趙 娣，代娟娟，王 丹，李 晨，劉 松

膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最普遍、最具破壞性的原發(fā)性惡性腫瘤，其特點是生長速度快、侵襲性強[1]。手術聯(lián)合化療、放療是治療的主要手段，但GBM患者的生存率仍然較低[2]。天然化合物因其成本低、生物利用度高、毒性小、具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性而受到越來越多的關注。尿石素B(urolithin B，UB)是鞣花丹寧和鞣花酸的腸道微生物代謝產(chǎn)物之一[3]。近年來，人們對尿石素的生物功能進行了體外和體內(nèi)的研究，包括抗炎活性、抗腫瘤增殖、抗氧化活性、對脂質(zhì)代謝的有益作用和延長壽命[4]。但是UB對GBM活性的影響尚無報道。本研究在體外實驗中探究了UB對GBM細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及細胞周期的影響，及其對下游信號通路蛋白的影響，該研究為探究GBM的治療藥物提供新的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料UB購自美國Sigma公司；RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；兔抗Phospho-p38、兔抗p38、兔抗Phospho-JNK、兔抗JNK、兔抗Phospho-AKT、兔抗AKT、兔抗ERK、兔抗Phospho-ERK、鼠抗β-actin抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；驢抗鼠二抗和羊抗兔二抗均購于美國Li-COR公司；CCK-8試劑盒購自美國MCE公司；Transwell小室購自美國Corning公司；FITC Annexin V 凋亡檢測試劑盒和PI/RNase染色液均購自美國BD公司。主要儀器：雙紅外激光成像系統(tǒng)(美國Li-COR公司)；SpectraMax M5酶標儀(美國Molecular Devices公司)；IX53光學顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)人膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞系購自中國科學院細胞庫。U251細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。UB用DMSO溶解配置成0.2 mol/L的母液。

1.3 Western blot細胞用RIPA裂解液裂解，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度定量。蛋白復合物用12% SDS-PAGE進行電泳，濕轉法轉至PVDF膜，用pH 7.4的TBST緩沖液(0.02 mol/L Tris-HCl, 0.15 mol/L NaCl, 0.1% Tween-20)溶解的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入一抗Anti-p-p38 (1 ∶1 000), Anti-p38 (1 ∶1 000)，Anti-p-JNK (1 ∶1 000), Anti-JNK(1 ∶1 000)，Anti-β-actin (1 ∶2 000)，Anti-p-AKT(1 ∶1 000)，Anti-AKT(1 ∶1 000)，Anti-ERK(1 ∶1 000)及Anti-p-ERK(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST洗滌4次，每次10 min，加入二抗室溫搖床孵育1 h。然后TBST洗膜4次，經(jīng)雙紅外激光成像系統(tǒng)成像并識別灰度進行分析。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力取對數(shù)期細胞，0.25%胰酶-EDTA消化后細胞計數(shù)，接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種3 000個細胞。實驗分為對照組和不同濃度的UB處理組(20、40、80、120、160、200 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后，分別加入溶媒和不同濃度的UB，繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48 h，根據(jù)CCK-8試劑盒說明書，每孔加入10 μl CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h后，用SpectraMax M5酶標儀檢測450 nm吸光度值。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力取對數(shù)期細胞，接種12孔板，每孔接種500個細胞，分為對照組和不同濃度的UB處理組(40、80、160 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后，分別加入溶媒和不同濃度的UB處理，藥物處理48 h后換液，加入不含藥物的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 d。去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，甲醇固定20 min，PBS洗滌3遍，0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌后觀察拍照。

1.6 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力取對數(shù)期細胞接種6孔板，每孔接種1×106個細胞，24 h后，用200 μl移液器吸頭做“井”字劃痕，PBS洗滌3次，加入無血清培養(yǎng)基及不同濃度的UB(0、40、80、160 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)，0、24 h和48 h時顯微鏡下觀察并拍照。用ImageJ軟件計算劃痕距離，劃痕愈合百分比=(0 h劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.7 Transwell侵襲實驗檢測細胞遷移能力Matrigel基質(zhì)膠用PBS按照1 ∶8的比例稀釋，取80 μl基質(zhì)膠稀釋液加入Transwell上室中，37℃培養(yǎng)箱放置2 h。取對數(shù)期細胞，用無血清DMEM培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整至1×105個/ml，取150 μl細胞懸液加入Transwell上室，同時加入不同濃度UB(0、40、80、160 μmol/L)。下室加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，取出小室甲醇固定20 min，PBS洗滌后，加入0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌后，顯微鏡下觀察拍照。取隨機3個視野進行統(tǒng)計。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期細胞凋亡檢測，取對數(shù)期細胞接種于6孔板，細胞用不同濃度UB(0、40、80、160 μmol/L)處理24 h，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，冰預冷的PBS洗滌3遍，500 μl 1×binding buffer重懸細胞，加入5 μl FITC染色15 min，在上機檢測前5min加入PI染色。細胞充分重懸后，上機檢測并分析細胞凋亡數(shù)據(jù)。

細胞周期檢測，取對數(shù)期細胞接種于6孔板，細胞用不同濃度的UB(0、40、80、160 μmol/L)處理24 h，消化并收集細胞，PBS洗滌3遍，加入冰預冷的70%的乙醇4℃固定過夜，PBS洗滌3遍，然后用PI/RNase染色液避光染色15 min。細胞充分重懸后，上機檢測并用Modfit軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 UB對U251細胞增殖能力及克隆形成的影響與對照組相比，UB對U251細胞的增殖活性有明顯影響，且呈濃度依賴性。進一步分析顯示，在24 h時，20、40、80、120、160、200 μmol/L的UB處理組U251細胞的吸光度相對值與對照組細胞相比均降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=429.10；P<0.01)。在48 h時，20、40、80、120、160、200 μmol/L的UB處理組U251細胞的吸光度相對值與對照組細胞比較均降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=431.20；P<0.01)。見圖1A。

與對照組相比，UB對U251細胞的克隆形成活性有明顯影響，且呈濃度依賴性。進一步分析顯示，40、80、160 μmol/L的UB處理組U251細胞的克隆形成率與對照組細胞相比均降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=131.10，P<0.01)(圖1B、C)。

2.2 UB對U251細胞遷移和侵襲能力的影響與對照組相比，UB對U251細胞的遷移能力有明顯影響，且呈濃度依賴性。進一步分析顯示，在24 h時，40、80、160 μmol/L的UB處理組U251細胞的劃痕愈合率與對照組細胞相比降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=22.51，P<0.05或P<0.01)；48 h時，40、80、160 μmol/L的UB處理組U251細胞的劃痕愈合率與對照組細胞比較均降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=39.36，P<0.01)(圖2A、B)。

圖1 CCK-8法和細胞克隆形成實驗檢測UB對U251細胞增殖能力的影響

圖2 劃痕愈合實驗和Transwell小室法檢測UB對U251細胞遷移和侵襲能力的影響

與對照組相比，UB對U251細胞的侵襲能力有明顯影響，且呈濃度依賴性。進一步分析顯示，40、80、160 μmol/L的UB處理組U251細胞發(fā)生侵襲的相對細胞數(shù)量與對照組相比降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=31.59，P<0.01)(圖2C、D)。

2.3 UB對U251細胞凋亡和細胞周期的影響與對照組相比，UB對U251細胞的凋亡有明顯影響，且呈濃度依賴性。進一步分析顯示，40、80、160 μmol/L的UB處理組U251細胞凋亡相對值與對照組細胞相比升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=51.05，P<0.01)(圖3A、C)。與對照組相比，40、80、160 μmol/L的UB處理組U251細胞的周期有明顯影響。進一步分析顯示，與對照組細胞相比，高濃度UB處理組U251細胞處于G0/G1期細胞的比值降低(F=6.18，P<0.01)，G2/M期細胞的比值升高(F=11.39，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義(圖3B、D)，而對處于S期細胞的比值沒有影響(F=0.58，P>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。

2.4 UB對U251細胞下游信號通路的調(diào)節(jié)作用如圖4所示，與對照組相比，80、160 μmol/L的UB處理組能增加ERK蛋白的磷酸化水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，40 μmol/L的UB處理組ERK蛋白磷酸化水平的改變沒有顯著變化；80、160 μmol/L的UB處理組AKT蛋白的磷酸化水平與對照組相比降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，40 μmol/L的UB處理組與對照組相比，AKT蛋白的磷酸化水平?jīng)]有顯著變化；UB對p38和JNK磷酸化水平的影響沒有統(tǒng)計學意義。

圖3 不同濃度的UB對細胞凋亡及細胞周期的影響

圖4 UB對下游信號通路蛋白的影響與0 μmol/L對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

鑒于GBM的病死率非常高，因此，研制延長GBM患者生存時間、提高其生活質(zhì)量的治療策略和藥物，特別是能夠穿透血腦屏障治療GBM細胞的藥物勢在必行。天然化合物/草藥在歷史上被認為是一種重要的治療藥物的來源。在現(xiàn)代醫(yī)學中，大約40%的新合成藥物是天然產(chǎn)物或來自天然化合物。據(jù)估計，大多數(shù)抗微生物和抗癌藥物來自天然產(chǎn)物，天然產(chǎn)物已成為治療重大疾病的新型藥物或重要先導化合物的主要源泉[5]。

文獻報道天然產(chǎn)物中鞣花丹寧和鞣花酸的腸道微生物代謝產(chǎn)物包括尿石素A(UA)、尿石素B(UB)、尿石素C(UC)和尿石素D(UD)[6]。UB可以抑制肝癌細胞[7]、黑色素瘤細胞[8]、前列腺癌[9]等腫瘤細胞的生長。本研究評價了UB對GBM細胞生長繁殖的抑制活性及其機制，并發(fā)現(xiàn)UB可以誘導GBM細胞凋亡和影響細胞周期的變化，表明UB具有較好腫瘤抑制效果。ERK、AKT蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]，本研究顯示UB可以促進ERK的磷酸化水平，并抑制AKT的磷酸化，與文獻[10]報道尿石素C可以促進葡萄糖誘導的ERK激活，UB抑制AKT、信號通路結果一致[11]。雖然有文獻[12]報道UB具有抑制重組人單胺氧化酶A酶的活性，但是其發(fā)揮腫瘤抑制效果的下游作用分子或基因尚不清楚，還需要進一步深入研究。血腦屏障的通透性是化療藥物在GBM治療中的重要限制因素，因為血腦屏障是給藥GBM的物理和生理屏障。因此，傳統(tǒng)的治療方法是通過血腦屏障來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)。研究[13]報道UB可以通過血腦屏障，外周給予UB具有神經(jīng)保護的功能[14]。UB穿透血腦屏障的能力使其成為治療GBM極具潛力的藥物。

綜上所述，本研究系統(tǒng)研究了UB對GBM細胞增殖、遷移及侵襲的抑制活性，及其誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯的作用。同時研究了UB對下游信號通路ERK和AKT的調(diào)節(jié)作用。因此，本研究為探究GBM的致病機制和靶向治療提供新的理論依據(jù)。