穿心蓮內酯對胰腺癌細胞順鉑敏感性的作用機制研究

張鈴枝 王楠 楊麗芳 廷荃 楊卜瑞

摘要 目的：探討穿心蓮內酯對胰腺癌細胞順鉑敏感性的作用和機制。方法：將人胰腺癌細胞SW1990分成對照組、穿心蓮內酯組（穿心蓮內酯處理）、順鉑組（順鉑處理）、穿心蓮內酯+順鉑組（穿心蓮內酯、順鉑處理）、穿心蓮內酯+順鉑+轉化生長因子-β1（TGF-β1）組（穿心蓮內酯、順鉑、TGF-β1處理）、TGF-β1組（TGF-β1處理），Western Blotting檢測TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達，MTT檢測增殖，流式細胞術檢測凋亡，Transwell小室檢測侵襲和遷移。結果：與對照組比較，穿心蓮內酯組胰腺癌細胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達量減少（P<0.05），TGF-β1組胰腺癌細胞p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達量增多（P<0.05）。與對照組比較，穿心蓮內酯組、順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑組胰腺癌細胞增殖活性減少，凋亡率增多，細胞侵襲和遷移數目降低（P<0.05）。與穿心蓮內酯組、順鉑組比較，穿心蓮內酯+順鉑組胰腺癌細胞增殖活性減少，凋亡率增多，細胞侵襲和遷移數目降低（P<0.05）。與穿心蓮內酯+順鉑組比較，穿心蓮內酯+順鉑+TGF-β1組胰腺癌細胞增殖活性增多，凋亡率減少，細胞侵襲和遷移數目增多（P<0.05）。結論：穿心蓮內酯通過抑制TGF-β1/Smad2/3信號通路提高胰腺癌細胞對順鉑敏感性。

關鍵詞 穿心蓮內酯;胰腺癌;順鉑;TGF-β1/Smad2/3信號;侵襲;遷移;凋亡;增殖

Mechanism of the Sensitivity of Cardiac Linolestide Route to Cisplatin in Pancreatic Cancer Cells

ZHANG Lingzhi1，WANG Nan2，YANG Lifang3，LI Tingquan3，YANG Burui1

（1 Shanxi University of Traditional Chinese Medicine Clinical Sciences，Taiyuan 030024，China; 2 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China; 3 Affiliated Hospital of Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China）

Abstract Objective：To investigate the effect and mechanism of andrographolide on the sensitivity of pancreatic cancer cells to cisplatin.Methods：Human pancreatic cancer cells SW1990 were divided into a control group，an andrographolide group（andrographolide treatment），cisplatin group（cisplatin treatment），an andrographolide+cisplatin group（andrographolide，cisplatin treatment），andrographolide+cisplatin+transforming growth factor β1（TGF-β1） group（andrographolide，cisplatin，TGF-β1 treatment），a TGF-β1 group（TGF-β1 treatment），Western blot detection of TGF-β1，p-Smad2/Smad2，p-Smad3/Smad3 protein expression，MTT detection of proliferation，flow cytometry detection of apoptosis，Transwell chamber detection of invasion and migration.Results：Compared with the control group，TGF-β1，p-Smad2/Smad2，p-Smad3/Smad3 protein expression in pancreatic cancer cells in the andrographolide group decreased（P<0.05）.Compared with the control group，the expression of p-Smad2/Smad2，p-Smad3/Smad3 protein in pancreatic cancer cells in the TGF-β1 group increased（P<0.05）.Compared with the control group，pancreatic cancer cell proliferation activity decreased，apoptosis rate increased，the number of cell invasion and migration decreased in andrographolide group，cisplatin group，and andrographolide+cisplatin group（P<0.05）.Compared with the andrographolide group and the cisplatin group，the pancreatic cancer cell proliferation activity in the andrographolide+cisplatin group decreased，and the apoptotic rate increased，the number of cell invasion and migration decreased（P<0.05）.Compared with andrographolide+cisplatin group，pancreatic cancer cell proliferation activity increased，apoptosis rate decreased，the number of cell invasion and migration increased in andrographolide+cisplatin+TGF-β1 group（P<0.05）.Conclusion：Andrographolide can increase the sensitivity of pancreatic cancer cells to cisplatin by inhibiting the TGF-β1/Smad2/3 signaling pathway.

Keywords Andrographolide; Pancreatic cancer; Cisplatin; TGF-β1/Smad2/3 signal; Invasion; Migration; Apoptosis; Proliferation

中圖分類號：R284;R735文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.008

胰腺癌屬于消化系統惡性腫瘤，早期臨床癥狀不明顯，5年生存率極低，順鉑是常用化療藥物，提高胰腺癌對順鉑的敏感性具有重要意義[1]。穿心蓮內酯是穿心蓮的主要活性成分，其屬于二萜內酯類的化合物，有調控免疫、抗炎、抗病毒等作用[2]。穿心蓮內酯有抗腫瘤作用，對胃癌等有抑制作用[3-4]。穿心蓮內酯還可以提高胰腺癌吉西他濱治療效果[5]。目前尚不清楚穿心蓮內酯對胰腺癌順鉑敏感性的影響。本實驗探討穿心蓮內酯對胰腺癌細胞SW1990順鉑敏感性的影響及機制，為提高胰腺癌患者順鉑敏感性提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人胰腺癌細胞SW1990，通派（上海）生物科技有限公司提供。

1.1.2 藥物 穿心蓮內酯滴丸（天士力醫(yī)藥集團股份有限公司，批號：20200315）;順鉑注射液（諾欣）（江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，批號：20200224）。

1.1.3 試劑與儀器 TGF-β1（ACROBiosystems公司，美國，貨號：TG1-H4212）;兔抗TGF-β1抗體（Santa Cruz Biotechnology公司，美國，貨號：sc-130348），兔抗Bax抗體（武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：FNab10410）;兔抗Bcl-2抗體（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：2876），兔抗E-cadherin抗體（Thermo公司，美國，貨號：33-4000），兔抗N-cadherin抗體（Thermo公司，美國，貨號：MA5-15633），兔抗Smad3抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，貨號：AF6362），兔抗MMP-9抗體（武漢博歐特生物科技有限公司，貨號：orb97357），兔抗p-Smad2抗體（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：3101），兔抗p-Smad3抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，貨號：AF3363），兔抗MMP-2抗體（GeneTex公司，美國，貨號：GTX25704），兔抗Smad2抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，貨號：AF6497），酶標儀（北京悅昌行科技有限公司，SpectraMax Plus 384型），流式細胞儀（貝克曼庫爾特公司，美國，CytoFLEX型），倒置顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司，XDS-900型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 將胰腺癌細胞分成對照組、穿心蓮內酯組、順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑+TGF-β1組、TGF-β1組，對照組細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)，穿心蓮內酯組用6 μmol/L的穿心蓮內酯處理，順鉑組用0.5 μg/mL的順鉑處理[6]，穿心蓮內酯+順鉑組用6 μmol/L的穿心蓮內酯和0.5 μg/mL的順鉑處理，穿心蓮內酯+順鉑+TGF-β1組用6 μmol/L的穿心蓮內酯、0.5 μg/mL的順鉑、2 ng/mL的TGF-β1處理[7]，TGF-β1組用2 ng/mL的TGF-β1處理。胰腺癌細胞培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的DMEM，在細胞培養(yǎng)液中同時添加1%的青鏈霉素，細胞培養(yǎng)參數為：飽和濕度、37 ℃、5%CO2、95%空氣。

1.2.2 檢測指標與方法

1.2.2.1 MTT檢測細胞增殖 胰腺癌細胞接種到96孔板內，每個孔中添加5 000個細胞，分別在細胞中加入0、3、6、12、24、48 μmol/L的穿心蓮內酯，或者按照對照組、穿心蓮內酯組、順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑+TGF-β1組分組處理，細胞培養(yǎng)24 h后，在細胞中添加10 μL的MTT，放在37 ℃孵育4 h。棄掉上清，添加150 μL的二甲基亞砜，繼續(xù)反應10 min，用酶標儀測定450 nm的OD值。OD值表示細胞增殖活性。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.2.2 Western Blotting檢測蛋白表達 胰腺癌細胞接種到12孔板內，按照對照組、穿心蓮內酯組、順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑+TGF-β1組、TGF-β1組處理，細胞培養(yǎng)24 h后，分別提取細胞總蛋白，并將蛋白樣品和5×上樣緩沖液混合，放在100 ℃煮沸5 min。利用10%分離膠、5%濃縮膠進行電泳，每孔上樣40 μg蛋白，首先以90 V電壓電泳，觀察藍色染料即將進入分離膠時，調整為110 V繼續(xù)電泳。在4 ℃條件轉膜，轉膜時間為1.5 h，轉膜電壓為100 V。將NC膜用5%牛血清白蛋白封閉以后，置于一抗稀釋液內，在4 ℃過夜。然后將NC膜放在二抗稀釋液內，在室溫結合1.5 h。TGF-β1、Bax、Bcl-2、上皮性鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經性鈣黏蛋白（N-cadherin）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9一抗按照1∶1 200稀釋，p-Smad2、p-Smad3一抗按照1∶1 000稀釋，Smad2、Smad3一抗按照1∶800稀釋。二抗按照1∶4 000稀釋。ECL發(fā)光。GAPDH作為參照，根據條帶的灰度值計算目的蛋白表達變化。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.2.3 流式細胞術檢測凋亡 胰腺癌細胞接種到12孔板內，按照對照組、穿心蓮內酯組、順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑+TGF-β1組處理，24 h后，每個檢測樣品收集106個細胞，懸浮在500 μL結合緩沖液中，添加10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，在室溫條件下結合15 min。用流式細胞儀檢測。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.2.4 Transwell小室檢測細胞侵襲、遷移 細胞侵襲實驗首先需要用基質膠濕化小室，其余步驟相同。將胰腺癌細胞用不含血清的細胞培養(yǎng)液懸?。芏葹?×106個/mL），吸取100 μL的細胞懸浮液添加到小室的上室，在下室內添加600 μL的含血清細胞培養(yǎng)液，放在37 ℃培養(yǎng)24 h。將沒有穿膜的細胞擦掉，無水乙醇固定，結晶紫染色，在顯微鏡下觀察細胞穿膜數目，隨機選擇5個視野，結果取均值。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，多組差異比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 穿心蓮內酯對胰腺癌細胞增殖的影響 與0 μmol/L比較，6、12、24、48 μmol/L穿心蓮內酯處理后胰腺癌細胞增殖活性降低，差異有統計學意義（P<0.05）。12 μmol/L穿心蓮內酯處理后胰腺癌細胞成活率接近50%，選擇6 μmol/L的穿心蓮內酯做后續(xù)實驗。見表1。

2.2 穿心蓮內酯抑制胰腺癌細胞中TGF-β1/Smad2/3信號激活 與對照組比較，穿心蓮內酯組胰腺癌細胞TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達量減少，差異有統計學意義（P<0.05）。與對照組比較，TGF-β1組胰腺癌細胞p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達量增多，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1～2，表2～3。

2.3 穿心蓮內酯調控TGF-β1/Smad2/3增強順鉑抗胰腺癌細胞增殖和誘導凋亡作用 與對照組比較，穿心蓮內酯組、順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑組胰腺癌細胞增殖活性、Bcl-2蛋白表達量減少，凋亡率和Bax蛋白表達量增多，差異有統計學意義（P<0.05）。與穿心蓮內酯組、順鉑組比較，穿心蓮內酯+順鉑組胰腺癌細胞增殖活性、Bcl-2蛋白表達量減少，凋亡率和Bax蛋白表達量增多，差異有統計學意義（P<0.05）。與穿心蓮內酯+順鉑組比較，穿心蓮內酯+順鉑+TGF-β1組胰腺癌細胞增殖活性、Bcl-2蛋白表達量增多，凋亡率和Bax蛋白表達量減少，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3～4，表4。

2.4 穿心蓮內酯調控TGF-β1/Smad2/3增強順鉑抗胰腺癌細胞EMT作用 與對照組比較，穿心蓮內酯組、順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑組胰腺癌細胞E-cadherin蛋白表達量增多，N-cadherin蛋白表達量減少，差異有統計學意義（P<0.05）。與穿心蓮內酯組、順鉑組比較，穿心蓮內酯+順鉑組胰腺癌細胞E-cadherin蛋白表達量增多，N-cadherin蛋白表達量減少，差異有統計學意義（P<0.05）。與穿心蓮內酯+順鉑組比較，穿心蓮內酯+順鉑+TGF-β1組胰腺癌細胞E-cadherin蛋白表達量減少，N-cadherin蛋白表達量增多，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖5和表5。

2.5 穿心蓮內酯調控TGF-β1/Smad2/3增強順鉑抗胰腺癌細胞侵襲和遷移作用 與對照組比較，穿心蓮內酯組、順鉑組、穿心蓮內酯+順鉑組胰腺癌細胞侵襲和遷移數目降低，MMP-2、MMP-9蛋白表達量減少，差異有統計學意義（P<0.05）。與穿心蓮內酯組、順鉑組比較，穿心蓮內酯+順鉑組胰腺癌細胞侵襲和遷移數目降低，MMP-2、MMP-9蛋白表達量減少，差異有統計學意義（P<0.05）。與穿心蓮內酯+順鉑組比較，穿心蓮內酯+順鉑+TGF-β1組胰腺癌細胞侵襲和遷移數目增多，MMP-2、MMP-9蛋白表達量增多，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖6，表6。

3 討論

胰腺癌作為常見的惡性腫瘤，其具有轉移速度快、發(fā)展迅速等特點[8]。順鉑是臨床常見化療藥物，具有天然的抗腫瘤活性，可抑制腫瘤細胞增殖、轉移，促進細胞凋亡[9]。Bcl-2、Bax是細胞凋亡的標志蛋白，其均屬于Bcl-2蛋白家族成員[10]。腫瘤轉移的基礎條件之一是降解細胞外基質，MMPs是細胞外基質降解酶，其蛋白成員MMP-2、MMP-9表達改變與腫瘤細胞遷移、侵襲有關[11]。EMT是指上皮特征逐漸消失而間質特征逐漸明顯的過程，腫瘤細胞EMT發(fā)生于腫瘤轉移之前，EMT后的細胞轉移能力明顯增加[12]。E-cadherin是上皮細胞標志蛋白，N-cadherin是間質細胞標志蛋白，二者表達變化是EMT改變的重要參考指標[13]。在腫瘤進展中，TGF-β1/Smad2/3等信號通路參與其中，TGF-β1活化后可在細胞表面與TGF-β1受體結合，促進下游Smad2/3磷酸化，進而影響腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移，TGF-β1/Smad2/3在胰腺癌進展中發(fā)揮促進作用，二甲雙胍可通過抑制TGF-β1活性降低胰腺癌侵襲[7，14-15]。

穿心蓮內酯有涼血消腫、保肝利膽、抗糖尿病等作用，提取于中藥穿心蓮[16]。穿心蓮內酯對腫瘤有抑制作用，穿心蓮內酯可在體外抑制卵巢癌、骨肉瘤等腫瘤細胞增殖、侵襲，并促進細胞凋亡[17-19]。研究發(fā)現，穿心蓮內酯和化療藥物吉西他濱聯合治療較單純一種藥物治療效果更好[5]。本實驗顯示，穿心蓮內酯和順鉑均可以降低胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡，抑制MMP-2、MMP-9、Bcl-2、N-cadherin蛋白表達，促進E-cadherin、Bax表達，并且二者聯合效果更明顯，這提示穿心蓮內酯能夠增強順鉑抗胰腺癌作用。本實驗還發(fā)現，穿心蓮內酯降低胰腺癌細胞中TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3表達量，并且TGF-β1可部分逆轉穿心蓮內酯對順鉑抗胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和誘導凋亡的增強作用，說明穿心蓮內酯通過抑制TGF-β1/Smad2/3信號提高胰腺癌細胞順鉑敏感性，穿心蓮內酯可能是提高胰腺癌患者化療藥物敏感性的藥物之一。本研究存在一定的局限性，僅初步在細胞中證明了穿心蓮內酯的作用，尚未在體內和臨床應用中進行廣泛驗證，以后會繼續(xù)探討穿心蓮內酯提高胰腺癌順鉑敏感性的臨床應用可能。體外細胞實驗中，在一定范圍內的藥物抗腫瘤作用強弱與藥物作用濃度有關，且在本研究中，只選擇了一種作用濃度的穿心蓮內酯、順鉑進行了聯合處理，沒有對比穿心蓮內酯和順鉑抗癌作用強弱，這部分內容會在以后實驗中進行探討。

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（2021-11-25收稿 本文編輯：楊覺雄）