基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探尋β-谷甾醇的作用機(jī)制

王旭紅 劉改霞 李耀輝 李哲 張濤

摘要 目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析探尋β-谷甾醇的潛在作用機(jī)制。方法：首先，利用PubChem數(shù)據(jù)庫下載β-谷甾醇的2D結(jié)構(gòu)，利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)靶標(biāo)信息，再將結(jié)果中輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫提取靶標(biāo)的基因名，然后利用TTD數(shù)據(jù)庫查詢到靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的疾病信息，STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。結(jié)果：PharmMapper共得到靶標(biāo)223個(gè)，從TTD數(shù)據(jù)庫得到疾病信息86個(gè)，基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)度值較高的基因有RAC1、B2M、ESR1、GTF2F2、AR和KDR，GO富集分析中具有顯著意義的4個(gè)條目有RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始、類固醇激素受體、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路和肽基酪氨酸自磷酸化，通路富集分析中有顯著意義的通路11條，分別為Rho-GTPase循環(huán)、NRAGE通過JNK發(fā)出死亡信號(hào)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、MyD88缺陷（TLR2/4）、IRAK4缺乏癥（TLR2/4）、DAP12信號(hào)、β-丙氨酸代謝、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、Rap1信號(hào)通路和MyD88：MAL（TIRAP）在質(zhì)膜上啟動(dòng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。結(jié)論：β-谷甾醇可以通過多靶點(diǎn)，多通路作用于神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、感染性疾病及腫瘤在內(nèi)的多種疾病。

關(guān)鍵詞 β-谷甾醇;植物甾醇;膽固醇;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);炎癥;腫瘤;中醫(yī);作用機(jī)制

Mechanism of β-Sitosterol Based on Network Pharmacology

WANG Xuhong1，LIU Gaixia2，LI Yaohui3，LI Zhe4，ZHANG Tao2

（1 Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China; 2 Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China; 3 Shaanxi Provincial Hospital of Chinese Medicine，Xi′an 710000，China; 4 Traditional Chinese Medicine Development Research Center，Chinese Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：To explore the underlying mechanism of β-sitosterol through network pharmacology.Methods：Firstly，the 2D structure of β-sitosterol was downloaded from PubChem，and targets were predicted by PharmMapper.The results were input into UniProt to extract the gene names of targets.The disease information corresponding to the targets was retrieved from TTD.STRING was used for the construction of an association network of gene functions and DAVID for GO and pathway enrichment.Results：A total of 223 targets and 86 pieces of disease information were obtained from PharmMapper and TTD，respectively.Genes with high degrees in the association network of gene function included RAC1，B2M，ESR1，GTF2F2，AR，and KDR.Four significant items in the GO enrichment analysis were transcription initiation of RNA polymerase Ⅱ promoter，steroid receptor，steroid-mediated signaling pathway，and peptide tyrosine autophosphorylation.There were 11 significant pathways in the pathway enrichment analysis，including Rho-GTPase cycle，NRAGE signals death through JNK，neurotrophin signaling pathway，basic transcription factor，MyD88 deficiency（TLR2/4），IRAK4 deficiency（TLR2/4），DAP12 signaling pathway，β-alanine metabolism，oocyte meiosis，Rap1 signaling pathway，and MyD88：MAL（TIRAP） cascade initiated on the plasma membrane.Conclusion：The findings of this study reveal that β-sitosterol can act on various diseases including nervous system，reproductive system，immune system，infectious disease，and tumors through multi-target and multi-pathway.

Keywords β-sitosterol; Phytosterol; Cholesterol; Network pharmacology; Inflammation; Tumor; Traditional Chinese medicine; Mechanism of action

中圖分類號(hào)：R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.005

β-谷甾醇（Beta-Sitosterol）是植物中的一種主要膳食甾醇，存在于油脂、堅(jiān)果和蔬菜等多種植物當(dāng)中[1]。其中植物油含有最高濃度的植物甾醇，堅(jiān)果和種子含有適量的植物甾醇，而水果和蔬菜通常含有最低的植物甾醇[2]。膽固醇通過氧化過程產(chǎn)生膽固醇氧化產(chǎn)物從而成為動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素，β-谷甾醇又分類為非膽固醇固醇或中性固醇，雖然在結(jié)構(gòu)上與膽固醇相似，也可能經(jīng)歷與膽固醇類似的氧化過程，并產(chǎn)生類似的氧化產(chǎn)物，但是這些氧化物的功能卻是通過破壞膽固醇膠束的形成降低膽固醇水平[3]。同時(shí)β-谷甾醇也被用于治療其他疾病，包括前列腺增生、炎癥、腫瘤等，因此人們對(duì)植物甾醇和β-谷甾醇的興趣與日俱增[4]。前期進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究時(shí)，在檢索及篩選中藥有效成分及靶標(biāo)的過程中發(fā)現(xiàn)多藥物中均含有β-谷甾醇，并且其口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）2個(gè)值均較高，如冬蟲夏草、郁金、蒼耳子、鴉膽子等?；谥兴帉W(xué)而言，上述四味中藥分屬不同章節(jié)，主治及功效也大不相同?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)β-谷甾醇具有治療高脂血癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、免疫抑制、前列腺增生、脫發(fā)、燒傷等多種疾病的功效[5]。為進(jìn)一步了解該成分的作用靶點(diǎn)及可治療的疾病從而提供理論支撐，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)其靶點(diǎn)和作用機(jī)制進(jìn)行可視化分析。

1 資料與方法

1.1 β-谷甾醇靶標(biāo)的預(yù)測(cè)

利用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），以“Beta-sitosterol”作為檢索詞進(jìn)行檢索，進(jìn)一步打開“Beta-sitosterol”條目即可看到該成分的2D結(jié)構(gòu)，將2D結(jié)構(gòu)保存為SDF格式進(jìn)一步分析。見圖1。利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），點(diǎn)擊“Submit Job”上傳上述2D結(jié)構(gòu)的SDF文件、填寫自己郵箱，其他相關(guān)信息默認(rèn)該數(shù)據(jù)庫的設(shè)置，最后點(diǎn)擊“Submit”提交完成。待該數(shù)據(jù)庫靶標(biāo)信息預(yù)測(cè)完成之后，即可下載CSV格式的分析結(jié)果，將結(jié)果中UniProt一欄的靶標(biāo)編號(hào)分別輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）提取靶標(biāo)的基因名稱即可完成靶標(biāo)預(yù)測(cè)。

1.2 β-谷甾醇潛在治療疾病的預(yù)測(cè)

首先打開TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/），將1.1中轉(zhuǎn)換后的靶標(biāo)輸入“Search for Targets”搜索框，選擇“Target Name”與靶標(biāo)相符的基因點(diǎn)擊“Target Info”查看靶標(biāo)的詳細(xì)信息，其中“Disease”一欄即為靶標(biāo)可能有關(guān)的疾病。然后將可查詢到疾病信息的靶標(biāo)和其相關(guān)的疾病列表，將表格導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并根據(jù)靶標(biāo)和疾病進(jìn)行圖形調(diào)整。

1.3 基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）是最常用的蛋白數(shù)據(jù)庫，可通過其構(gòu)建基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。首先選擇Multiple Proteins，將預(yù)測(cè)的靶標(biāo)輸入搜索框中，Organism選擇為“Homo Sapiens”開始搜索，搜索完成后點(diǎn)擊“Continue”，在設(shè)置中將分?jǐn)?shù)選擇為0.7，并隱藏散在的節(jié)點(diǎn)，即可得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）是較為全面的生物功能注釋信息平臺(tái)，將預(yù)測(cè)的β-谷甾醇靶點(diǎn)基因名稱輸入DAVID，數(shù)據(jù)類型選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，表格類型選擇“Gene List”，物種類型和背景均選擇“Homo Sapiens”，再選擇“Functional Annotation Tool”即可選擇進(jìn)行GO富集分析和通路富集分析。進(jìn)行GO富集生物過程以及通路富集信號(hào)通路的篩選時(shí)限定條件為P<0.05并且FDR<0.05以及所研究疾病的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 β-谷甾醇的靶標(biāo)

通過PubChem搜索得到β-谷甾醇的2D結(jié)構(gòu)。見圖1。PharmMapper的預(yù)測(cè)（Job ID：200305035857）和UniProt轉(zhuǎn)換，共得到靶標(biāo)223個(gè)，將化合物和靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行“化合物-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中綠色代表化合物，黃色代表所預(yù)測(cè)的靶標(biāo)。見圖2。

2.2 β-谷甾醇的疾病預(yù)測(cè)結(jié)果

通過TTD數(shù)據(jù)庫對(duì)223個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行疾病預(yù)測(cè)，其中有疾病信息的基因52個(gè)，對(duì)疾病信息進(jìn)行去重處理后得到疾病信息86個(gè)，將靶標(biāo)和疾病信息導(dǎo)入Cytoscape數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，其中紅色代表疾病信息，黃色代表靶標(biāo)。見圖3。拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)Solid Tumour/Cancer、AR、KDR的節(jié)點(diǎn)度值較高。

2.3 β-谷甾醇的基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

為了更直觀地了解β-谷甾醇的作用機(jī)制，將所得靶標(biāo)輸入STRING V11.0平臺(tái)構(gòu)建基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。見圖4。網(wǎng)絡(luò)中共包含221個(gè)節(jié)點(diǎn)，205條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值1.86。進(jìn)行拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)RAC1、B2M、ESR1、GTF2F2、AR、KDR等基因的節(jié)點(diǎn)度值高于其他靶點(diǎn)（>8），上述靶點(diǎn)可能在疾病的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用，屬于核心靶點(diǎn)。

2.4 GO富集分析和通路富集分析

共得到12個(gè)富集的生物過程聚類，分為58個(gè)條目，其中具有顯著意義的4個(gè)條目為：RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始、類固醇激素受體、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、肽基酪氨酸自磷酸化。通路富集分析共獲得9個(gè)富集的通路聚類，分為44條通路，P<0.05的通路11條，分別為Rho-GTPase循環(huán)、NRAGE通過JNK發(fā)出死亡信號(hào)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、MyD88缺陷（TLR2/4）、IRAK4缺乏癥（TLR2/4）、DAP12信號(hào)、β-丙氨酸代謝、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、Rap1信號(hào)通路、MyD88：MAL（TIRAP）在質(zhì)膜上啟動(dòng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。見圖5、表3。紅色代表通路結(jié)果，綠色代表GO富集結(jié)果，黃色代表藥物靶點(diǎn)。見圖5。

3 討論

β-谷甾醇是一種植物甾醇，它與膽固醇結(jié)構(gòu)相似，但并在人類體內(nèi)合成，而是通過腸道吸收來獲取。相關(guān)研究顯示β-谷甾醇的吸收量遠(yuǎn)小于膽固醇，口服生物利用度為0.41%，清除率為85 mL/h，周轉(zhuǎn)率為5.8 mg/d[6]。β-谷甾醇的酯化速度比膽固醇慢，但轉(zhuǎn)化為原膽汁酸、膽酸和鵝去氧膽酸的速度與膽固醇基本一致[7]。有研究表明β-谷甾醇抑制了培養(yǎng)的癌細(xì)胞系鞘磷脂周期的激活，阻滯細(xì)胞周期以及刺激凋亡細(xì)胞死亡[8]。除抗腫瘤外，也有研究證明其具有抗高膽固醇、炎癥、抗菌和抗真菌的特性[9]。雖然目前關(guān)于β-谷甾醇的研究有限，但其作為一種天然產(chǎn)物被認(rèn)為是安全的，并且抑制多種途徑參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)度值較高的靶點(diǎn)有RAC1、B2M、ESR1、GTF2F2、AR、KDR，其中RAC1基因編碼的蛋白是GTPase，屬于小GTP結(jié)合蛋白的ras超家族，這一超家族的成員似乎調(diào)節(jié)著一系列不同的細(xì)胞事件，包括細(xì)胞生長(zhǎng)的控制、細(xì)胞骨架的重組和蛋白激酶的激活，與RAC1相關(guān)的疾病包括精神發(fā)育遲滯、智力殘疾綜合征[10]。B2M基因編碼一種血清蛋白，該蛋白與幾乎所有有核細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體I型重鏈相關(guān)，該蛋白具有主要的β折疊片狀結(jié)構(gòu)，在某些病理?xiàng)l件下可形成淀粉樣纖維，與該基因相關(guān)的疾病包括免疫缺陷和淀粉樣變性[11]。ESR1基因編碼雌激素受體，雌激素及其受體對(duì)性發(fā)育和生殖功能至關(guān)重要，但也在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和骨質(zhì)疏松癥組織中發(fā)揮作用[12]。GTF2F2是一種蛋白質(zhì)編碼基因，其主要作用包括形成含有HIV-1 Tat和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始和啟動(dòng)子清除的HIV-1延伸復(fù)合物[13]。AR在骨髓、乳腺、前列腺組織中表達(dá)，編碼的蛋白質(zhì)有3個(gè)主要功能域：N末端域、DNA結(jié)合域和雄激素結(jié)合域，靶點(diǎn)作為類固醇激素激活的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用[14]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是內(nèi)皮細(xì)胞的主要生長(zhǎng)因子，KDR基因編碼VEGF的2個(gè)受體之一是一種Ⅲ型受體酪氨酸激酶，該成分是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、成活、遷移、小管形態(tài)發(fā)生和萌發(fā)的主要介質(zhì)[15]。本研究的靶點(diǎn)富集在11條通路上，其中Rho GTPase是一類重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，主要作用是轉(zhuǎn)換GTP的活化狀態(tài)和非活化狀態(tài)，在其中發(fā)揮開關(guān)作用[16]。NRAGE是一種p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白受體相互作用蛋白，通過JUN依賴性線粒體途徑誘導(dǎo)Caspase激活和細(xì)胞死亡，p75NTR與NRAGE相互作用從而導(dǎo)致JUN激酶（JUK）的磷酸化和活化，進(jìn)一步誘導(dǎo)促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，并直接激活細(xì)胞死亡機(jī)制[17]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素是一類參與神經(jīng)細(xì)胞分化和成活的營(yíng)養(yǎng)因子，一方面，它通過與Trk酪氨酸激酶受體或p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體（p75NTR）結(jié)合發(fā)揮其功能，另一方面，p75NTR同時(shí)傳輸正信號(hào)和負(fù)信號(hào)，這些信號(hào)對(duì)神經(jīng)發(fā)育和其他高階活動(dòng)如學(xué)習(xí)和記憶起著重要作用?；A(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子是指真核基因轉(zhuǎn)錄除RNA聚合酶外還需要許多蛋白因子——轉(zhuǎn)錄因子參加，其中一些轉(zhuǎn)錄因子是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始必需的，并且可以維持基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。在配體結(jié)合時(shí)，TLRs通過其各自的TIR結(jié)構(gòu)域異源或均聚并招募MyD88，MyD88通過其死亡結(jié)構(gòu)域（DD）和TIR結(jié)構(gòu)域寡聚并與白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAKs）相互作用形成Myddosome復(fù)合物從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子活化的信號(hào)[18]。IRAK4依賴的TLR7和TLR8信號(hào)事件與肝病病毒感染相關(guān)，MyD88和IRAK4缺陷患者至今尚未報(bào)道易受病毒感染[19]。白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶4（IRAK4）通過IRAK4的死亡結(jié)構(gòu)域和適配型髓樣分化因子88蛋白（MyD88）的同源性相互作用被招募到TLR受體復(fù)合物中，基于細(xì)胞的分析以及與IRAK4變體的體外蛋白質(zhì)相互作用分析表明，缺陷IRAK4的功能喪失是由蛋白質(zhì)生產(chǎn)的喪失或與MyD88的相互作用受損引起的，研究已確定患有常染色體隱性遺傳（AR）型IRAK4缺乏癥的患者，在嬰兒期或幼兒期有臨床癥狀，表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性化膿性細(xì)菌感染[20]。在受體連接反應(yīng)中，DAP12的免疫受體酪氨酸基激活基序（ITAM）中的酪氨酸殘基被Src家族激酶磷酸化，這些磷酸酪氨酸在髓細(xì)胞中形成蛋白酪氨酸激酶SYK和NK細(xì)胞中的SYK和ZAP70的對(duì)接位點(diǎn)，所有這些中間信號(hào)分子導(dǎo)致激酶AKT、CBL和ERK的募集和激活，以及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重排最終導(dǎo)致細(xì)胞活化[21]。β-丙氨酸的代謝主要在大腦和肌肉中，可以提高抗氧化能力和抗疲勞作用。Rap1是一種控制細(xì)胞黏附、細(xì)胞-細(xì)胞連接形成和細(xì)胞極性等多種過程的小GTPase，Rap1以高度依賴于細(xì)胞類型的方式調(diào)節(jié)MAP激酶（MAPK）活性，在非活性GDP結(jié)合構(gòu)象和活性GTP結(jié)合構(gòu)象之間循環(huán)，Rap1通過調(diào)節(jié)整合素和其他黏附分子在不同細(xì)胞類型中的功能，在控制細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用中起主導(dǎo)作用[22]。MyD88包含一個(gè)N末端死亡結(jié)構(gòu)域（DD）和一個(gè)C末端TIR，TIR同型相互作用的配體與激活的TLR接觸，而DD模塊招募絲氨酸/蘇氨酸激酶，這些蛋白激酶的募集伴隨著磷酸化，從而導(dǎo)致IRAKs與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）的相互作用[23]。

綜上所述，β-谷甾醇可以通過多靶點(diǎn)、多通路作用于神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、感染性疾病及腫瘤在內(nèi)的多種疾病。

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（2020-04-30收稿 本文編輯：魏慶雙）