蛹蟲草中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的克隆及在畢赤酵母中的表達(dá)

楊 聰， 郭麗瓊， 葉志偉， 鄒 苑， 余穎豪， 林俊芳*

（1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系 廣州510640 2 廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心 廣州510640）

蟲草菌是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥用真菌， 屬于大型藥食同源真菌。 蛹蟲草【Cordycepsmilitaris （Vuill.）Fr.】，又名迷力菌、蟲草花，是麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）的模式種[1]，富含蟲草素、蟲草多糖、甾醇等對人體有益的活性物質(zhì)及微量元素，具多種抗性，有免疫調(diào)節(jié)活性[2]。蛹蟲草在衛(wèi)生部2009年底3 號公告中被正式批準(zhǔn)為新資源食品，在2014年被納入新食品原料[3]。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）是一種天然蛋白質(zhì)交聯(lián)劑， 能催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團(tuán)與伯胺化合物（?；荏w）之間發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，使蛋白質(zhì)發(fā)生共價交聯(lián)，通過胺的導(dǎo)入、 交聯(lián)及脫胺3 種途徑對蛋白質(zhì)進(jìn)行改性[4]，被譽為“21 世紀(jì)超級黏合劑”。 該酶廣泛存在于生物界中， 來源于微生物的TGase（Microbial transglutaminase， MTG）屬胞外酶，底物特異性低，在無Ca2+存在的條件下仍有催化活性[5]，工業(yè)上主要通過微生物發(fā)酵制備，原料廉價、周期短，利于大規(guī)模工業(yè)制備， 用于食品工業(yè)改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)。 目前MTGase 最主要的微生物來源是鏈霉菌屬，如茂源鏈霉菌、吸水鏈霉菌等，然而鏈霉菌來源的MTGase 在食品工業(yè)中應(yīng)用的安全性有待考證，尚有爭議。從大型食用真菌蟲草屬的蛹蟲草CM01 中獲取，其來源是食用真菌，食品安全性得到保證。 目前MTGase 的食用真菌來源只有香菇[6]。 近年來，對TGase 研究集中在應(yīng)用領(lǐng)域的拓展及對TGase 進(jìn)行基因改造， 用重組表達(dá)系統(tǒng)來實現(xiàn)酶的高表達(dá)。

巴斯德畢赤酵母，是甲醇營養(yǎng)型酵母，以甲醇為唯一碳源，有良好的基因遺傳穩(wěn)定性，翻譯后修飾能力，自身蛋白分泌較少，外源蛋白是其發(fā)酵液中主要蛋白，分離純化簡單等[7]。 甲基營養(yǎng)型酵母畢赤酵母（Pichia pastoris）是近20年發(fā)展起來的一種異源蛋白表達(dá)的首選系統(tǒng)[8]，已具有成熟的高密度培養(yǎng)技術(shù)。 近年來用重組表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)TGase 成為工業(yè)化生產(chǎn)的主要方式， 應(yīng)用最為成功的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[9]、棒桿菌表達(dá)系統(tǒng)[10-11]和甲基營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)[12]。 本文所用畢赤酵母GS115 就是甲基營養(yǎng)型酵母， 畢赤酵母不僅可以做到外源蛋白的高表達(dá)、高分泌，而且其工程菌株穩(wěn)定性高，能進(jìn)行多種翻譯后加工修飾，如糖基化、磷酸化等，是當(dāng)前最適合用來表達(dá)蛋白的表達(dá)系統(tǒng)[13]。

本文擬從蛹蟲草CM01 中獲取TGase 相似蛋白的編碼基因片段tgM， 轉(zhuǎn)化入畢赤酵母構(gòu)建工程菌株，進(jìn)行異源表達(dá)，并對其發(fā)酵液做TGase 酶活試驗， 以此驗證蛹蟲草中是否有表達(dá)TGase 的能力，為TGase 的工業(yè)用菌提供新的食用菌來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 蛹蟲草菌株CM01、大腸桿菌E.coli DHK、 畢氏酵母GS115、pMD18-T 載體質(zhì)粒、表達(dá)載體pPIC9K 質(zhì)粒，均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑 DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ，Takara 公司；核酸Marker、蛋白Marker，Thermo Fisher Scientific 公司；Trizol 試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、小片段回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，Omega 公司；蛋白胨、酵母浸膏，Oxoid 公司； 引物及DNA 測序由北京擎科生物有限公司完成；N-α-CBZ-Gln-Gly、L-谷氨酸-γ-單羥肟酸，Sigma 公司；其它試劑均為分析純級。

1.1.3 培養(yǎng)基

1） PDA 固體培養(yǎng)基 （按1 L 劑量配制） 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g；

2） LB 固體培養(yǎng)基（按1 L 劑量配制） 酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g；

3） YPD 固體培養(yǎng)基 （按1 L 劑量配制） 酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g；

4） MD 培養(yǎng)基 （按1 L 劑量配制） 葡萄糖20 g，瓊脂15 g，YNB 13.4 g，生物素0.04 g；

5） BMGY 液體培養(yǎng)基（按1 L 劑量配制）酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，10×YNB（無氨基酵母氮源） 100 mL，10×甘油100 mL，500×生物素2 mL； 無菌水700 mL；1 mol/L 磷酸鹽緩沖液100 mL；

6） BMMY 液體培養(yǎng)基（按1 L 劑量配制）酵母提取物10 g， 蛋白胨20 g，10×YNB 100 mL，500×生物素2 mL；1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）100 mL，甲醇5 mL，無菌水800 mL。

1.2 方法

1.2.1 蛹蟲草CM01 的TGase 目的基因克隆 將蛹蟲草CM01 進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)菌絲， 收集菌絲用trizol 試劑盒提取RNA， 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA， 根據(jù)NCBI 查找得到的TGase 相似蛋白基因序列 （基因庫查詢號NO.NW_006271971.1）， 設(shè)計TGase 基因的擴增引物TGF 和TGR （添加6 個組氨酸標(biāo)簽， 便于后期純化），以蛹蟲草CM01 的基因組DNA 為模板，PCR擴增TGase 基因的目的片段。PCR 條件為94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s；55 ℃退火30 s；68 ℃延伸2 min；30 個循環(huán)；4 ℃保存20 min；將PCR 產(chǎn)物純化回收， 將純化后的TGase 基因片段與pMD18-T 載體通過DNA 連接酶連接，在含有100 μg/mL 氨芐青霉素（Amp）的平板培養(yǎng)基中對轉(zhuǎn)入重組載體的大腸桿菌DHK 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行篩選，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。 挑取陽性轉(zhuǎn)化子以TGT 和TGB 為引物，進(jìn)行菌落PCR，擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳驗證， 將可以擴增出目的條帶大小的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將分泌型表達(dá)載體pPIC9K 用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切， 酶切體系：EcoRⅠ1.0 μL，NotⅠ1.0 μL， 質(zhì)粒pPIC9K 10.0 μL，10×緩沖液 2.0 μL，ddH2O 定容到20 μL，37℃酶切1 h， 酶切產(chǎn)物經(jīng)由1%瓊脂糖凝膠電泳回收后獲得線性化質(zhì)粒載體， 測定濃度。 設(shè)計TG-9KF（引入EcoRⅠ酶切位點）和TG-9KR（引入NotⅠ酶切位點）引物，對目的片段進(jìn)行PCR 擴增，同時引入pPIC9K 載體的同源臂。將帶有表達(dá)載體同源臂的目的片段與雙酶切后的pPIC9K 通過重組試劑盒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DHK 感受態(tài)細(xì)胞， 于含100 μg/mL Amp 平板培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，37 ℃過夜培養(yǎng)。 挑取單菌落送測序， 鑒定連接成功，提取重組表達(dá)載體pPIC9K-TG。

1.2.3 酵母的電轉(zhuǎn)化及重組子的篩選 將構(gòu)建成功的pPIC9K-TG 表達(dá)載體用SalⅠ單酶切線性化， 產(chǎn)物純化回收后獲得線性化質(zhì)粒， 用NanoDrop 測定DNA 濃度。 酶切體系：Sal Ⅰ1.0 μL；10×緩沖液2.0 μL； 線性化質(zhì)粒17.0 μL；37 ℃酶切過夜； 畢赤酵母感受態(tài)的制備和電轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)[14]。 將酵母轉(zhuǎn)化子涂布于組氨酸缺乏的MD 平板培養(yǎng)基篩選重組子。 選取成功長出的重組子用GS115 通用引物α-factor primer 和3'AOX1 primer 進(jìn)行菌落PCR 和凝膠電泳， 判斷目的基因是否成功整合到畢赤酵母GS115 的基因組中。

1.2.4 重組酵母的搖瓶表達(dá)及TGase 酶活測定將得到的酵母重組子用BMGY 培養(yǎng)基活化，30℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)至OD600nm=2～6，（16～18 h），離心取菌體， 將收集到的菌體用BMMY 重懸至OD600nm=1.0，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件為30 ℃200 r/min、 每24 h 加甲醇至甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)7 d 后得到重組酵母的發(fā)酵液。

表1 引物列表Table 1 List of primer

1.2.5 TGase 蛋白純化 TGase 的蛋白純化采用鎳柱純化親和層析法， 步驟如下： 將體積為2.0 mL 的Ni 樹脂裝入合適的純化柱中， 用預(yù)冷的平衡緩沖液平衡樹脂， 將平衡后的樹脂與粗酶液混合， 置于磁力攪拌器上攪拌40～60 min 使二者混合， 環(huán)境溫度4 ℃； 將樹脂與粗酶液的混合液過柱； 將20 mL 預(yù)冷的洗滌緩沖溶液加入到柱子清洗雜蛋白； 用5 mL 含500 mmol/L 咪唑的洗脫緩沖溶液洗脫，洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.2.6 TGase 酶活測定 酶活測定采用Crossowicz 比色法，以N-α-CBZ-Gln-Gly 為底物，以L-谷氨酸-γ-單羥肟酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體步驟參照參考文獻(xiàn)[15]。 酶活定義為：37 ℃時TGase 每分鐘催化底物生成1.0 μmol L-谷氨酸-單羥胺酸（氧肟酸）為1 個酶活單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的驗證

以蛹蟲草的基因組cDNA 為模板利用引物TGF 和TGR 通過PCR 擴增獲得TGase 基因（tgM），如圖1 所示，可見距離1 200 bp 處有一條單一、明亮條帶，與tgM 片段1 023 bp 符合，電泳結(jié)果顯示與預(yù)期相符。PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DHK 感受態(tài)細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化子后提質(zhì)粒后測序， 測序結(jié)果表明tgM 基因與NCBI 公布序列完全吻合。

圖1 tgM 目的片段PCR 結(jié)果Fig.1 PCR results of tgM target fragment

2.2 重組表達(dá)載體pPIC9K-TG 的構(gòu)建

按1.2.2 節(jié)的方法所述， 對表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行雙酶切和回收后，得質(zhì)量濃度為100 ng/μL 的產(chǎn)物。 如圖2 所示，在8 000～10 000 bp 之間有一明顯條帶b 與pPIC9K 的9 276 bp 大小符合。將目的片段與線性化載體連接，轉(zhuǎn)化入大腸后，37 ℃培養(yǎng)過夜后進(jìn)行菌落PCR，挑單菌落送測序，測序結(jié)果表明pPIC9K-TG 重組表達(dá)載體（如圖3）構(gòu)建成功。 經(jīng)Sal Ⅰ單酶切后電泳圖如圖2 的a 條帶所示， 在10 000 bp 附近有一條單一、 明亮條帶，與pPIC9K-TG 片段10 311 bp 符合，證明基因和載體在大小上基本正確，可進(jìn)行下一步酶連。

圖2 質(zhì)粒與pPIC9K-TG 重組質(zhì)粒酶切檢測Fig.2 Enzyme digestion idenfication of plasmid and pPIC9K-TG recombinantplasmid plasmid

圖3 重組質(zhì)粒pPIC9K-TG 的構(gòu)建策略Fig.3 Construction strategy of recombinant plasmid pPIC9K-TG

2.3 酵母的電轉(zhuǎn)化及重組酵母菌的構(gòu)建與驗證

將pPIC9K-TG 電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，涂布于MD 平板以篩選菌落。隨機選取篩選平板陽性菌落，用pPIC9K 通用引物α-factor primer和3'AOX1 primer 進(jìn)行菌落PCR。 菌落PCR 結(jié)果如圖4 所示， 選取的兩個樣品均在1 200～2 000 bp 之間有一條明亮條帶，與用pPIC9K-TG 通用引物PCR 獲得的tgM 片段1 528 bp 相符合， 說明隨機選取的兩個菌落均為陽性重組菌落。 陰性對照c無明顯條帶。 說明tgM 基因已成功整合到畢赤酵母GS115 的基因組中。

圖4 轉(zhuǎn)化子PCR 鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of transformants by PCR amplification

2.4 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將得到的重組菌株用BMGY 培養(yǎng)基活化至OD600nm=2～6， 收集菌體用BMMY 重懸進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在保證甲醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的情況下，誘導(dǎo)表達(dá)7 d 取發(fā)酵上清液及純化后洗脫液進(jìn)行純化后對其SDS-PAGE 分析，如圖5a 所示，2 泳道為重組酵母的發(fā)酵液， 在40 ku 附近有一明顯條帶，對應(yīng)Marker，可知條帶大小為38 ku。 而轉(zhuǎn)入pPIC9K空載體的GS115 發(fā)酵上清液的1 泳道則無此條帶，說明該條帶為酵母表達(dá)出的目的蛋白，證明目的基因在畢赤酵母GS115 中成功實現(xiàn)胞外表達(dá)。

圖5 SDS-PAGE 檢測畢赤酵母TGase 表達(dá)結(jié)果Fig.5 Expression results of TGase in Pichia pastoris detected by SDS-PAGE

取發(fā)酵上清液進(jìn)行酶活測定， 以GS115 的發(fā)酵上清液為空白對照，測定內(nèi)含pPIC9K 空載體的GS115 及重組酵母的發(fā)酵上清液的酶活。 酶活測定結(jié)果為內(nèi)含空載體的GS115 的發(fā)酵上清液無酶活，重組酵母發(fā)酵上清液的酶活為100 U/L，說明該目的基因編碼表達(dá)的目的蛋白確有酶活， 證明從蛹蟲草基因組中克隆的tgM 基因具有表達(dá)TGase 的功能。

3 討論與結(jié)論

由SDS-PAGE 分析的結(jié)果看，蛋白表達(dá)量不高，可能的原因有：1）不同種生物對于密碼子的偏好性存在差別， 蛹蟲草TGase 編碼基因與畢赤酵母常用密碼子存在偏好性差異， 若本試驗的目的基因在翻譯中用到畢赤酵母的稀有密碼子， 則可能會影響翻譯的順利進(jìn)行，使得表達(dá)產(chǎn)物減少；2）本試驗僅單拷貝表達(dá)， 也可能是表達(dá)量低的原因之一。針對蛋白表達(dá)量低可采取的解決辦法：1）確定編碼基因后對目的基因進(jìn)行重新設(shè)計， 將目的基因的密碼子優(yōu)化為GS115 偏好的密碼子， 可使該基因的蛋白表達(dá)量增加。 李洪波[16]對TGase 進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的酶活是優(yōu)化前的2.8 倍，產(chǎn)量是優(yōu)化前的3.1 倍。 2）可采用不同信號肽，與分子伴侶共表達(dá)等方法對目的基因進(jìn)行改造，進(jìn)一步提高TGase 的表達(dá)量。 Li 等[17]用食品級枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)TGase 時，換用SPsacB取代了天然信號肽，使其能分泌到胞外，對前肽進(jìn)行定點誘變后， 上清液中酶活由1.6 U/mg 上升到7.60 U/mg，且具有良好的Ca2+穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性；李鵬飛等[18]將含酶原的TGase 的Pro 序列與成熟MTG進(jìn)行共表達(dá)， 成功直接表達(dá)了成熟有活性的茂源鏈霉菌來源的TGase， 單拷貝菌株的酶活值為0.18 U/mL；3）可通過增加外源基因拷貝數(shù)來提高表達(dá)量，李鵬飛等[18]對目的基因進(jìn)行了單拷貝和多拷貝表達(dá)后發(fā)現(xiàn)， 增加拷貝數(shù)可明顯提高表達(dá)量。

由酶活試驗的結(jié)果來看，酶活性不高，可能的原因有：1）取發(fā)酵上清液進(jìn)行酶活試驗，上清液內(nèi)的酶濃度不高，導(dǎo)致酶活較低；2）當(dāng)前發(fā)酵條件不是最適發(fā)酵條件，針對酶活低可采用的解決辦法：1）對發(fā)酵上清液進(jìn)行進(jìn)一步的分離提純，提高酶濃度；2）優(yōu)化發(fā)酵條件、進(jìn)行高密度發(fā)酵、篩選合適的酵母菌株等都提高產(chǎn)酶量。 李鵬飛等[18]對多拷貝子進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化后進(jìn)行高密度發(fā)酵，TGase的產(chǎn)量達(dá)到了7.3 U/mL，比搖瓶產(chǎn)量提高了近30倍， 說明對其進(jìn)行發(fā)酵最適條件優(yōu)化可顯著提高其蛋白表達(dá)量。

本試驗驗證了基因和載體序列的正確性，從蛹蟲草CM01 中克隆得到tgM 基因片段， 構(gòu)建了重組載體pPIC9K-TG， 并在畢赤酵母成功實現(xiàn)了異源表達(dá)，SDS-PAGE 檢測試驗確定目的蛋白的大小理論值在38 Ku 左右。 酶活試驗證實該蛋白具有TGase 催化活性， 確定tgM 基因即為蛹蟲草CM01 中編碼TGase 的基因序列。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶現(xiàn)已為國際公認(rèn)的食品安全用酶， 但其來源多為霉菌，本試驗獲得了大型食用真菌來源的TGase，確保了該酶的在食品行業(yè)應(yīng)用的安全性， 豐富了TGase 的微生物來源。