超聲波協(xié)同馬克思克魯維酵母Z17胞內(nèi)粗酶處理降低乳清蛋白的致敏性

舒 琴， 趙文俊， 劉思宇， 何國(guó)慶， 陳啟和

（浙江大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系 杭州310058）

乳清是酪蛋白凝結(jié)后牛乳中剩下的液體成分，是奶酪制作中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。全球每年乳清產(chǎn)量約為1.8 億～1.9 億t[1]，每年增長(zhǎng)約2%[2]。 過去，乳清被視為廢品而排入河流， 因乳清中有機(jī)物含量高， 化學(xué)需氧量 （Chemical oxygen demand，COD）50～102 g/L， 生物需氧量（Biological oxygen demand， BOD）27～60 g/L[3-4]，故對(duì)生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成危害。隨著奶酪類產(chǎn)品的增加，乳清引起的環(huán)境問題日益嚴(yán)重。為了解決乳清的處置問題，生產(chǎn)者將乳清分離，并加以利用。從乳清中分離出的多種球狀蛋白質(zhì)總稱為乳清蛋白，占牛乳總蛋白的20%[5]。 乳清蛋白中約含65%的β-乳球蛋白 （Beta-lactoglobulin， β-LG），25%的α-乳白蛋白 （Alphalactalbumin， α-LA），8%的牛血清白蛋白（Bovine serum albumin， BSA） 以及少量的免疫球蛋白（Immunoglobulin， Igs）、 乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf）、乳過氧化物酶（Lactoperoxidase， Lp）和糖巨肽（Glymacropeptide， GMP）等，這些蛋白質(zhì)具有特定的功能、生理和營(yíng)養(yǎng)特性[6]。

食物過敏是全球主要的公共衛(wèi)生問題。 據(jù)估計(jì)， 食物過敏影響約1%～2%的成年人和5%～8%的3 歲以下兒童[7-9]。 牛乳是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）認(rèn)定的8 種主要過敏食物之一，由牛乳引起的過敏癥狀威脅著嬰幼兒的健康， 嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡。 牛乳蛋白過敏 （Cows milk protein allergy， CMPA）在臨床中是由一種或多種乳蛋白引起的免疫反應(yīng)， 包括IgE 介導(dǎo)的和非IgE 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，是嬰幼兒中最常見的過敏癥[10]，它影響全球1.9%～4.9%的嬰兒[11]，0.6%～2.5%的學(xué)齡前兒童，0.3%的5～16 歲的青少年，以及小于0.5%的成年人[12-13]。

物理、化學(xué)及生物等不同的食品加工方式，包括熱、高壓、輻射、超聲和生物化學(xué)方法被用于致敏蛋白的改性以降低牛乳蛋白的致敏性[14-15]。發(fā)酵作為一種微生物加工過程[16]，自埃及文明開始，便是保存食物（尤其是牛乳和水果）的古老加工技術(shù)[17]。 馬克思克魯維酵母 （Kluyveromyces marxianus）在酒精、酸奶和奶酪的發(fā)酵過程中多次被發(fā)現(xiàn)[18]。Li 等[19]發(fā)現(xiàn)馬克思克魯維酵母可以發(fā)酵乳清蛋白產(chǎn)生血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽。 此外，超聲波也是常見的蛋白改性的處理方式， 由于壓縮和擴(kuò)張作用， 導(dǎo)致食品體系內(nèi)劇烈震動(dòng)并形成氣泡，這些氣泡在達(dá)到臨界尺寸時(shí)發(fā)生爆炸，局部區(qū)域的溫度和壓力可能高達(dá)5 000 K 和101.325 MPa， 局部范圍內(nèi)的極端條件導(dǎo)致蛋白質(zhì)過敏原的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[20]。

本文以α-LA 和β-LG 為抗原性表征，研究超聲波協(xié)同馬克思克魯維酵母胞內(nèi)酶系降低乳清蛋白致敏性的最優(yōu)酶解條件， 探討加工過程中乳清蛋白構(gòu)象的變化機(jī)理， 為低致敏乳清蛋白產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 馬克思克魯維酵母Z17，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心； 乳清濃縮蛋白WPC 80，新西蘭恒天然集團(tuán)有限公司；0.22 μm 微孔濾膜，阿拉丁科技（中國(guó)）公司；截留分子質(zhì)量5 000 u 的透析袋， 北京索萊寶科技有限公司；偶氮酪蛋白、N，N-二甲基甲酰胺 （dmf）、N-苯甲?；?L-酪氨酸-對(duì)硝基苯胺 （NBTpNA）、L-賴氨酸對(duì)硝基苯胺二氫溴酸鹽（Lys-pNA），西格瑪集團(tuán)有限公司；木瓜蛋白酶（≥3 U/mg），上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為分析純級(jí)。

1.1.2 儀器設(shè)備 ZQLY-300 振蕩培養(yǎng)箱， 上海知楚儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化公司；MLS-3750 立式高壓滅菌鍋，日本三洋公司；5418高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf 公司；ZYCGF 常規(guī)分析型超純水機(jī)， 寧波優(yōu)普有限公司；J-1500-150S圓二色譜儀，日本JASCO 公司；SCIENTZ JY92 -ⅡD 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；JB-5A 磁力攪拌器，常州市偉嘉儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶制備 配置含有0.05 g/mL WPC 和0.04 g/100 mL 乳糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，108 ℃、15 min滅菌處理?；罨蟮鸟R克思克魯維酵母按1%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床中30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)。 30 h 后，馬克思克魯維酵母生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期， 將發(fā)酵液以12 000 r/min 離心10 min，用0.22 μm 微孔濾膜將上清液進(jìn)行過濾， 所得液體即為胞外酶液。將沉淀用蒸餾水清洗兩次，再次離心，將菌體懸浮于50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl 緩沖液中（內(nèi)含1 mmol/L 二硫蘇糖醇），冰浴中超聲波破碎（300 W，工作5 s，間隔15 s，全程10 min），4 ℃、10 000 r/min 下離心10 min， 收集上清液，所得液體即為胞內(nèi)酶液。

取100 mL 酶液加入硫酸銨達(dá)到20%飽和度，離心除去沉淀后加入硫酸銨使飽和度到達(dá)60%，離心棄上清， 將沉淀裝入透析袋， 磁力攪拌下用10 mL 10 mmol/L pH 6.4 的PBS 緩沖液透析60 h，即可分別得到分離純化后的胞內(nèi)、胞外粗酶溶液，凍干得到胞內(nèi)、胞外粗酶晶體。

1.2.2 蛋白酶活性測(cè)定 通過消化偶氮酪蛋白測(cè)量蛋白水解活性[21]。 反應(yīng)系統(tǒng)組成為：400 μL 1.25%偶氮酪蛋白（溶于100 mmol/L pH 7.0 磷酸鹽緩沖液）和100 μL 無細(xì)胞酶液，混勻后37 ℃反應(yīng)60 min，加入500 μL 10%三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)，10 000 r/min 離心10 min，取100 μL 上清液與100 μL 0.1 mol/L NaOH 混勻， 測(cè)定波長(zhǎng)440 nm 處吸光度。 試驗(yàn)重復(fù)3 次， 將10 mmol/L pH 6.4 PBS 緩沖液替代酶液作為空白對(duì)照。 在測(cè)定條件下與空白對(duì)照相比每分鐘吸光度增加0.1 所需的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.3 氨肽酶和羧肽酶活性測(cè)定 分別采用LyspNA 和NBTpNA 作為底物測(cè)定氨肽酶和羧肽酶活性[22]。 Lys-pNA 和NBTpNA 分別溶于蒸餾水和N，N-二甲基甲酸胺（DMF）配制成20 mmol/L 底物溶液。 酶反應(yīng)體系總體積為1 mL， 包括850 μL 100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl 緩沖液，50 μL 20 mmol/L 底物溶液和100 μL 無細(xì)胞酶液。 各組分混勻后37 ℃反應(yīng)10 min，然后加入0.5 mL 1 mol/L HCl 終止反應(yīng)， 混合物10 000 r/min 離心10 min，取上清測(cè)量波長(zhǎng)410 nm 吸光度，吸光度通過對(duì)硝基苯胺（p-Nitroaniline）標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到酶反應(yīng)所釋放對(duì)硝基苯胺的量。 在測(cè)定條件下與每分鐘生成1 μmol 對(duì)硝基苯胺所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3 酶解條件優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 通過對(duì)胞內(nèi)、 胞外酶活性的測(cè)定， 可以判斷馬克思克魯維酵母水解轉(zhuǎn)化乳清蛋白的主要酶系存在于胞內(nèi)或胞外。在此基礎(chǔ)上，通過單因素實(shí)驗(yàn)來確定各個(gè)條件對(duì)酶解效果的影響。酶解反應(yīng)物為：0.2 mL 乳清蛋白液（5%）和0.2 mL（1%）酶液，其余各條件設(shè)置如表1，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定蛋白質(zhì)水解度。

表1 酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Single factor experimental design of enzymatic hydrolysis conditions

1.3.2 響應(yīng)曲面法試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design Expert （Version10.0.4.0）設(shè)計(jì)四因素三水平的中心組合設(shè)計(jì) （Central Composite DESIGN，CD）試驗(yàn)考察不同酶解條件對(duì)乳清蛋白致敏性的影響。 試驗(yàn)變量為超聲間歇時(shí)間（X1），超聲功率（X2），初始pH 值（X3），酶解溫度（X4）為試驗(yàn)因素，以蛋白質(zhì)水解度和致敏性（以α-LA 和β-LG 的抗原性表征）降低率為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)。 每個(gè)因素選3 個(gè)水平，以（-1，0，1）編碼，各因素編碼值和實(shí)際值如表2 所示，CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3 所示。 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析后對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，采用下列二次多項(xiàng)式描述響應(yīng)量（應(yīng)變量）和自變量關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?/p>

表2 CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 2 Factor level and coding of CCD experiment

表3 CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Design of CCD experiment

式中，Y——預(yù)測(cè)響應(yīng)值（蛋白質(zhì)水解度、致敏性抑制率）；β0——常數(shù)項(xiàng)；βi——一次項(xiàng)系數(shù)；βii和βij——二次項(xiàng)系數(shù)。

（續(xù)表3）

1.3.3 鄰苯二甲醛法測(cè)定蛋白質(zhì)水解度 在超聲處理后的的乳清蛋白樣品中加入5 000 U/mL 木瓜蛋白酶，37 ℃下反應(yīng)30 min 后， 根據(jù)Spellman等[23]描述的方法，采用鄰苯二甲醛（OPA）法測(cè)定樣品的水解度。 以L-絲氨酸溶液（0.1 g/L）作為標(biāo)準(zhǔn)品。 取400 μL 待測(cè)樣品加入到盛有3 mL OPA 溶液的試管中，振蕩混勻5 s，避光反應(yīng)2 min，以去離子水作為空白對(duì)照。 用紫外分光光度計(jì)測(cè)量樣品在340 nm 處的吸光值。 OPA 指數(shù)定義為：用OPA 法測(cè)量波長(zhǎng)340 nm 吸光度的差值所對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線絲氨酸的量（mg/mL），用于表示蛋白質(zhì)的水解程度。

1.3.4 酶聯(lián)免疫法測(cè)定產(chǎn)物致敏性 根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法原理[24]測(cè)定樣品中β-LG 以及α-LA 的含量。 將樣品稀釋至1 mg/mL，利用β-LG 以及α-LA 試劑盒檢測(cè)樣品中兩種蛋白的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。使用Excel 2016、Origin 95、SPSS Statistics 22、Design Expert 10 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，顯著水平設(shè)定為P ＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 胞內(nèi)、胞外粗酶的活性

已有文獻(xiàn)表明可以從馬克斯克魯維酵母的細(xì)胞內(nèi)、外提取出能水解蛋白質(zhì)的酶。 Foukis 等[25]從馬克斯克魯維酵母IFO 0288 培養(yǎng)物中純化了分子質(zhì)量約為45 ku 的胞外水解酶KM-IFO-0288-A，在溫度10～60 ℃、pH 6.00～10.25 范圍內(nèi)具有較高活性。Ramírez-Zavala 等[26]從分離自牛乳中的馬克思克魯維酵母中純化了分子質(zhì)量約為46 ku 的賴氨酸氨肽酶，最佳pH 值為7.0，最佳溫度為45℃。 本研究測(cè)定了從馬克思克魯維酵母Z17 發(fā)酵液中分離出的胞內(nèi)和胞外粗酶中的蛋白酶、 氨肽酶、羧肽酶活性。 結(jié)果如圖1 所示，馬克思克魯維酵母Z17 胞內(nèi)粗酶有蛋白酶、 氨肽酶和羧肽酶活性，而胞外粗酶均不具有。由此可見，蛋白質(zhì)、多肽的水解是胞內(nèi)酶系起作用， 因此選擇胞內(nèi)粗酶作進(jìn)一步研究。

圖1 胞內(nèi)及胞外蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶活性Fig.1 Activities of intracellular and extracellular protease， aminopeptidase and carboxypeptidase

2.2 不同因素對(duì)乳清蛋白水解度的影響

通過單因素實(shí)驗(yàn)研究不同因素對(duì)胞內(nèi)粗酶水解乳清蛋白的影響，結(jié)果見圖2，由試驗(yàn)組1、2 可知，超聲處理不會(huì)改變?nèi)榍宓鞍字薪z氨酸含量，不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)水解度產(chǎn)生直接影響； 由試驗(yàn)組3、4及5、6 可知， 超聲處理可以促進(jìn)木瓜蛋白酶及馬克思克魯維酵母Z17 胞內(nèi)酶對(duì)乳清蛋白的水解；由試驗(yàn)組5、7、8 可知， 發(fā)酵初始pH 值在5 左右時(shí)比pH 值為7、9 時(shí)酶解能力更強(qiáng)； 由試驗(yàn)組5、9、10 可知，發(fā)酵溫度為15 ℃時(shí)，相比25 ℃和35℃時(shí)酶解能力更強(qiáng)； 由試驗(yàn)組5、11、12、13 可知，在0～3 h 之間隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)， 蛋白質(zhì)水解度逐漸增大，3～5 h 之間變化不顯著。因此，可以選擇超聲間歇時(shí)間、超聲功率、初始pH 值和酶解溫度為試驗(yàn)因素進(jìn)一步研究最優(yōu)的超聲-酶解條件。

圖2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of single factor experiment

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

采用RSM 優(yōu)化降低乳清蛋白抗原性的超聲-酶解工藝條件，基于對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，采用二次模型描述蛋白質(zhì)水解度、α-LA 以及β-LG 致敏性降低率和不同發(fā)酵工藝條件：超聲間歇時(shí)間、超聲功率、初始pH 值、酶解溫度之間的關(guān)系（式2～4，式中各變量均為實(shí)際值）。Y1、Y2、Y3分別為蛋白質(zhì)水解度、α-LA 抗原性降低率和β-LG 抗原性降低率的預(yù)測(cè)值，X1、X2、X3、X4分別為超聲間歇時(shí)間、超聲功率、初始pH 值、酶解溫度的實(shí)際值。

2.3.1 蛋白質(zhì)水解度響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果 蛋白質(zhì)水解度模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明 （表4），該模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)（P=0.2510）不顯著，表明模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合較好。采用方差分析對(duì)模型方程的適用性進(jìn)行了評(píng)價(jià)（表5），結(jié)果表明，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合較好，適合于預(yù)測(cè)響應(yīng)值蛋白質(zhì)水解度。 預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)R2=0.9523）， 表明95.23%試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值對(duì)應(yīng)， 有4.77%的變異不能被該模型解釋（校正系數(shù)RAdj2=0.8411）。 變異系數(shù)（CV=2.28%）值較低表明試驗(yàn)結(jié)果的可靠性較高。

表4 蛋白質(zhì)水解度響應(yīng)面二次系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Response surface fitting quadratic coefficient significance test of protein hydrolysis

表5 蛋白質(zhì)水解度響應(yīng)面二次模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of quadratic model of response surface experiment for protein hydrolysis degree

由模型方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)（表4）可知，試驗(yàn)中初始pH 值（X3）、酶解溫度（X4）對(duì)蛋白質(zhì)水解度線性效應(yīng)顯著（P＜0.05），初始pH 值（X3）二次項(xiàng)的P 值小于0.05， 說明對(duì)響應(yīng)值的曲面效應(yīng)顯著，而超聲間歇時(shí)間（X1）、超聲功率（X2）線性效應(yīng)不顯著（P 均大于0.05），超聲間歇時(shí)間（X1）、超聲功率（X2）、酶解溫度（X4）二次項(xiàng)的P 值均大于0.05，說明對(duì)響應(yīng)值的曲面效應(yīng)不顯著。蛋白質(zhì)水解度受酶活性影響，而初始pH 值、酶解溫度能夠?qū)γ傅幕钚栽斐芍苯拥挠绊憽?在試驗(yàn)的溫度范圍內(nèi)，初始pH 值從5 逐漸增加到7，溫度從15 ℃逐漸增加至25 ℃，水解度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，酶解溫度（X4）的一次項(xiàng)回歸系數(shù)（-0.022）在4 個(gè)因素中絕對(duì)值最大， 表明在試驗(yàn)范圍內(nèi)溫度對(duì)響應(yīng)值的影響最大， 這可能歸因于溫度增加提高了酶的活性，從而促進(jìn)了蛋白水解。

參數(shù)間的交互效應(yīng)也會(huì)對(duì)響應(yīng)值蛋白質(zhì)水解度產(chǎn)生影響，超聲間歇時(shí)間（X1）與超聲功率（X2）、超聲功率（X2）與初始pH 值（X3）交互作用對(duì)響應(yīng)值的曲面效應(yīng)影響極顯著（（P ＜0.01）。 如圖3 所示，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，當(dāng)超聲間歇時(shí)間和超聲功率、超聲功率與初始pH 值向最優(yōu)點(diǎn)增加時(shí)， 蛋白質(zhì)水解度顯著增加，通過最優(yōu)點(diǎn)后繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)水解度則顯著降低。

圖3 交互作用對(duì)蛋白質(zhì)水解度影響的三維曲面圖Fig.3 3D surface plots of interaction effect on proteins hydrolysis degree

2.3.2 α-LA 抗原性降低率的響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果 α-LA 抗原性降低率模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明（表6），該模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)（P=0.2874）不顯著，表明模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合較好。采用方差分析對(duì)模型方程的適用性進(jìn)行了評(píng)價(jià)（表7），結(jié)果表明，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合較好，適合于預(yù)測(cè)響應(yīng)值α-LA 抗原性的降低率。 預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有高度的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)R2=0.9872），表明98.72%試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值對(duì)應(yīng)，只有1.28%的變異不能被該模型解釋（校正系數(shù)RAdj2=0.9574）。 變異系數(shù)（CV=6.88%）值較低表明試驗(yàn)結(jié)果的可靠性較高。

表7 α-LA 抗原性降低率降低率響應(yīng)面二次模型的方差分析Table 7 Analysis of variance of quadratic model of response surface experiment for α-LA antigenicity reduction rate

由模型方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)（表6）可知，試驗(yàn)中初始pH 值（X3）及其二次項(xiàng)的P 值均小于0.01， 說明初始pH 值對(duì)響應(yīng)值的線性和曲面效應(yīng)極顯著；超聲功率（X2）二次項(xiàng)的P 值小于0.01，說明超聲功率對(duì)響應(yīng)值的曲面效應(yīng)顯著；而超聲間歇時(shí)間（X1）、超聲功率（X2）、酶解溫度（X4）線性效應(yīng)不顯著，超聲間歇時(shí)間（X1）、酶解溫度（X4）曲面效應(yīng)不顯著（P 值均大于0.05）。

表6 α-LA 抗原性降低率響應(yīng)面二次系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 6 Response surface fitting quadratic coefficient significance test of α-LA antigenicity reduction rate

超聲間歇時(shí)間（X1）和超聲功率（X2）之間、超聲功率（X2）和初始pH 值（X3）的相互作用對(duì)α-LA抗原性降低有極顯著影響（P＜0.01），超聲間歇時(shí)間（X1）和酶解溫度（X4）對(duì)α-LA 抗原性降低有顯著影響（P＜0.05）。 如圖4 所示，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，當(dāng)超聲間歇時(shí)間、超聲功率、初始pH 值、酶解溫度向最優(yōu)點(diǎn)增加時(shí)，α-LA 抗原性顯著降低； 通過最優(yōu)點(diǎn)后繼續(xù)增加，α-LA 抗原性升高。

圖4 交互作用對(duì)α-LA 抗原性降低率影響的三維曲面圖Fig.4 3D surface plots of interaction effect on α-LA antigenicity reduction rate

2.3.3 β-LG 抗原性降低率響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果

β-LG 抗原性降低率模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明（表8），該模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)（P=0.4696）不顯著，表明模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合較好。采用方差分析對(duì)模型方程的適用性進(jìn)行了評(píng)價(jià)（表9），結(jié)果表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合較好，適合于預(yù)測(cè)響應(yīng)值β-LG 抗原性降低率。 預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間具有較高的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)R2=0.9851），表明98.51%試驗(yàn)結(jié)果的實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值對(duì)應(yīng)，有1.49%的變異不能被該模型解釋（校正系數(shù)RAdj2=0.9504）。變異系數(shù)（CV=6.47%）值較低表明試驗(yàn)結(jié)果的可靠性較高。

表9 β-LG 抗原性降低率響應(yīng)面二次模型的方差分析Table 9 Analysis of variance of quadratic model of response surface experiment for β-LG antigenicity reduction rate

由模型方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)（表8）可知，試驗(yàn)中初始pH 值（X3）及其二次項(xiàng)P 值均小于0.05，說明初始pH 值對(duì)β-LG 抗原性降低率的線性及曲面效應(yīng)顯著；超聲間歇時(shí)間（X1）和酶解溫度（X4）的二次項(xiàng)的P 值均小于0.01，說明對(duì)響應(yīng)值的曲面效應(yīng)極顯著。 超聲功率（X2）及其二次項(xiàng)的P 值均大于0.05，說明對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著。

表8 β-LG 抗原性降低率響應(yīng)面二次系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 8 Response surface fitting quadratic coefficient significance test of β-LG antigenicity reduction rate

超聲間歇時(shí)間（X1）和超聲功率（X2）、超聲間歇時(shí)間（X1）和初始pH 值（X3）、初始pH 值（X3）和酶解溫度（X4）間的交互效應(yīng)對(duì)響應(yīng)值β-LG 抗原性降低率影響極顯著（P＜0.01）。 如圖5 所示，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，當(dāng)超聲間歇時(shí)間、超聲功率、初始pH 值和酶解溫度向最優(yōu)點(diǎn)增加時(shí)，β-LG 抗原性顯著降低， 通過最優(yōu)點(diǎn)后繼續(xù)增加時(shí)，β-LG 抗原性則顯著升高。

圖5 交互作用對(duì)β-LG 抗原性降低率影響的三維曲面圖Fig.5 3D surface plots of interaction effect on β-LG antigenicity reduction rate

2.3.4 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證 為了獲得馬克思克魯維酵母Z17 胞內(nèi)酶水解乳清蛋白的最優(yōu)酶解條件，即使得蛋白質(zhì)水解度、α-LA 抗原性降低率和β-LG抗原性降低率協(xié)同達(dá)到最大值時(shí)的超聲-酶解條件， 利用Design Expert 軟件對(duì)模型方程求解，得到曲面的極值點(diǎn)即α-LA 抗原性、β-LG 抗原性降低率的最大值分別為65.56%和57.96%時(shí)，對(duì)應(yīng)的超聲間歇時(shí)間為16 s，功率為400 W，初始pH 值為6.16，酶解溫度為18.48 ℃。 按照模型預(yù)測(cè)極值點(diǎn)的條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)， 結(jié)果和預(yù)測(cè)值吻合較好，說明該模型能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。

3 結(jié)論

以超聲預(yù)處理的乳清蛋白為酶解底物， 研究馬克思克魯維酵母Z17 粗酶轉(zhuǎn)化乳清蛋白的主要酶解條件。 經(jīng)提取、 分離得到馬克思克魯維酵母Z17 的胞內(nèi)、胞外粗酶，測(cè)定后發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)粗酶具有蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶活性，而胞外粗酶不具有以上活性。為了研究胞內(nèi)粗酶系水解乳清蛋白、降低乳清蛋白致敏性（以α-LA 和β-LG 的抗原性表征）的最優(yōu)超聲預(yù)處理-酶解條件，設(shè)計(jì)了四因素三水平的CCD 試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乳清蛋白水解度受初始pH 值、酶解溫度影響顯著，α-LA、β-LG 抗原性受初始pH 值影響顯著， 超聲間歇時(shí)間和超聲功率的交互作用對(duì)α-LA、β-LG 抗原性影響也顯著。通過對(duì)模型方程求解得到最優(yōu)條件： 超聲間歇時(shí)間16 s，超聲功率400 W，初始pH 6.16，酶解溫度18.48 ℃時(shí)，預(yù)測(cè)α-LA 抗原性、β-LG 抗原性的降低率達(dá)到最大，分別為65.56%和57.96%。