多酶分步水解法提高豌豆纖維純度的研究

◎ 張樹成，武世敏，鄒振宇，楊進潔，趙 收

（1.煙臺雙塔食品股份有限公司，山東 招遠 265400；2.招遠市檢驗檢測中心，山東 招遠 265400）

粗纖維是豌豆的主要組成成分之一，根據(jù)品種的不同，豌豆中的粗纖維含量在6.36%～9.43%[1]。研究表明，粗纖維可預(yù)防腸憩室病、心血管病、糖尿病等[2]疾病，能夠提高進食后排泄的糞便質(zhì)量，預(yù)防便秘、結(jié)腸癌等[3]，具有改善人體健康狀況的功效[4]。豌豆纖維在人和動物的飲食中可以作為一種優(yōu)質(zhì)的纖維補充劑使用[5-6]。廣泛應(yīng)用于面包、面條或其他營養(yǎng)食品中，以改善食品膨松性，促進人體消化[7]。

除了粗纖維以外，豌豆中還含有52%～55%的淀粉和23%～25%的蛋白質(zhì)。在豌豆粉絲加工過程中，一部分粗纖維在磨漿、過濾工序中作為濾渣過濾出去，還有一部分進入淀粉漿中，并在淀粉沉淀過程中與淀粉分開，和蛋白質(zhì)一起進入排放廢水中。為了提高資源利用率，提升效益，將豌豆粉絲廢水進一步分離提純，以分離出豌豆纖維。

豌豆粉絲廢水經(jīng)過第2次和第3次提取，干渣中的蛋白質(zhì)殘留量在5.43%，淀粉含量在63.2%，粗纖維的含量26.6%，灰分4.55%左右?？梢姡矸凼瞧渲械闹饕煞?。另外，蛋白質(zhì)的存在也會影響纖維的純度，若想獲得純度較高的纖維，必須先將其中的淀粉和蛋白質(zhì)去除。本研究旨在采用α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶多酶分步水解，提高豌豆膳食纖維的純度，為工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆粉絲廢水分離渣原料，由煙臺雙塔食品股份公司提供。耐高溫α-淀粉酶（活力單位200 000 U·mL-1），無錫賽德生物工程有限公司；糖化酶（活力單位100 000 U·mL-1），無錫賽德生物工程有限公司；木瓜蛋白酶（活力單位800 000 U·g-1）、堿性蛋白酶（活力單位200 000 U·g-1）、中性蛋白酶（活力單位200 000 U·g-1）、風味酶（活力單位200 000 U·g-1），均為南寧龐博生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

GZX-9097ME型數(shù)顯鼓風干燥箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；JB90-D型強力電動攪拌機：上海標本模型廠；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；FZ102型微型植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；TD5M型離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；90型恒溫磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠；LY15-9140A型恒溫干燥箱：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；ME204型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

豌豆粉絲廢水分離渣水洗2次，3 000 r·min-1離心5 min后，取沉淀烘干，粉碎，過60目篩，備用。按照以下步驟進行處理：豌豆粉絲廢水分離渣→耐高溫α-淀粉酶水解→糖化酶水解→蛋白酶水解→加熱滅酶→洗滌→離心脫水→熱風干燥→粉碎→豌豆膳食纖維粉。

1.3.1 耐高溫α-淀粉酶最佳反應(yīng)參數(shù)的確定

根據(jù)生產(chǎn)工藝需求，將料液比固定在1∶8，調(diào)pH為7.0，對加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間進行單因素試驗，使用水浴鍋進行保溫，試驗結(jié)束后取反應(yīng)液與碘液反應(yīng)，以不變藍為反應(yīng)終點。并根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗，以提取率為衡量指標，獲得耐高溫α-淀粉酶的最佳反應(yīng)參數(shù)。

1.3.2 糖化酶最佳反應(yīng)參數(shù)的確定

根據(jù)生產(chǎn)工藝需求，在耐高溫α-淀粉酶的最佳反應(yīng)參數(shù)下，進行糖化酶的添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和pH的單因素試驗，試驗過程使用水浴鍋進行保溫，淀粉經(jīng)兩步水解后分解為還原糖，測定反應(yīng)后干基還原糖含量即可反映酶解效果。根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計正交試驗，以反應(yīng)結(jié)束后干基還原糖的含量作為衡量指標，確定糖化酶的最佳反應(yīng)參數(shù)。

1.3.3 蛋白酶的種類比較與確定

稱取一定量的原料，使用耐高溫α-淀粉酶和糖化酶處理后，分別加入相同比例的木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味酶，并在該酶最適溫度、pH條件下水解相同的時間，通過檢測游離氨基酸含量來確定水解效果最佳的酶。

1.3.4 蛋白酶最佳反應(yīng)參數(shù)的確定

根據(jù)生產(chǎn)工藝需求，將料液比固定在1∶8，通過蛋白酶的選擇試驗以及查找資料，以蛋白酶的加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和pH設(shè)計正交試驗，以反應(yīng)結(jié)束后干基總膳食纖維的含量作為衡量指標，確定蛋白酶的最佳反應(yīng)參數(shù)。

1.3.5 檢測方法及計算

①膳食纖維提取率的計算。提取率=處理后的膳食纖維制品干基質(zhì)量/處理前的豌豆粉絲廢水分離渣干基質(zhì)量×100%。②干物質(zhì)含量計算。干物質(zhì)含量=1-水分含量。③蛋白質(zhì)含量的計算。參照《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）進行測定。④還原糖含量的計算。參照《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》（GB 5009.7—2016）進行測定。⑤淀粉含量的計算。參照《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》（GB 5009.9—2016）進行測定。⑥水分含量的計算。參照《食品安全國家標準 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）進行測定。⑦灰分含量的計算。參照《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）進行測定。⑧總膳食纖維含量的計算。參照《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》（GB 5009.88—2014）進行測定。⑨氨基酸態(tài)氮的計算。參照《食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》（GB 5009.235—2016）進行測定。

1.3.6 耐高溫α-淀粉酶正交試驗設(shè)計

根據(jù)加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的單因素試驗結(jié)果，進行耐高溫α-淀粉酶添加量（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時間（C）這3個因素的正交試驗，在料液比為1∶8，反應(yīng)pH為7的條件下，采用正交試驗來研究這3個因素對豌豆粉絲廢水分離渣的膳食纖維提取率的影響，該試驗采用L9(33)正交表，因素水平見表1。

表1 耐高溫α-淀粉酶正交試驗各因素及水平設(shè)計表

1.3.7 糖化酶正交試驗設(shè)計

以糖化酶的加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和pH進行4因素3水平正交試驗。耐高溫α-糖化酶因素水平見表2。

表2 糖化酶正交試驗各因素及水平設(shè)計表

1.3.8 蛋白酶正交試驗設(shè)計

以堿性蛋白酶的加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和pH進行4因素3水平正交試驗。因素水平見表3。

表3 蛋白酶正交試驗各因素及水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫α-淀粉酶的最佳反應(yīng)參數(shù)確定

耐高溫α-淀粉酶添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的單因素試驗結(jié)果，分別見表4、表5和表6。

由表4可知，在固定反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的基礎(chǔ)上，通過反應(yīng)液和碘的變色反應(yīng)可以看出，在加酶量為1.2%時即可充分完成酶解反應(yīng)，之后隨著酶的添加量增加，反應(yīng)液顏色不變。由表5可知，在固定加酶量和反應(yīng)時間時，酶解反應(yīng)在92 ℃時達到最佳，溫度過高或過低，酶解過程均效果不佳。由表6可知，在固定加酶量和反應(yīng)溫度時，60 min即可完成酶解反應(yīng)，隨著時間延長，酶解效果無變化。

表4 耐高溫α-淀粉酶添加量單因素試驗結(jié)果表

表5 耐高溫α-淀粉酶反應(yīng)溫度單因素試驗結(jié)果表

表6 耐高溫α-淀粉酶反應(yīng)時間單因素試驗結(jié)果表

2.2 耐高溫α-淀粉酶正交試驗結(jié)果

耐高溫α-淀粉酶正交試驗結(jié)果見表7。

表7 耐高溫α-淀粉酶正交試驗結(jié)果表

從表7可知，各因素對提取率的影響的主次順序是：加酶量（A）＞反應(yīng)時間（C）＞反應(yīng)溫度（B）。理論條件下最優(yōu)的酶解條件為A2B2C3，即耐高溫α-淀粉酶添加量1.2%，反應(yīng)溫度為90 ℃，反應(yīng)時間為60 min。在此參數(shù)下進行3次驗證試驗，得到此時提取率分別為65.8%、66.6%和66.5%，均高于其他試驗組。

2.3 糖化酶最佳反應(yīng)參數(shù)確定

糖化酶的不同反應(yīng)參數(shù)（酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和pH）對反應(yīng)后干基還原糖含量的影響分別見圖1、圖2、圖3和圖4。由圖1可知，在酶添加量由2.0%提升到4.0%后，還原糖含量有了大幅度提升，當酶添加量超過4.0%以后，還原糖含量趨于穩(wěn)定。由圖2可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，還原糖含量先上升再下降，并且在60 ℃左右還原糖含量達到了最高值。由圖3可知，隨著反應(yīng)時間的延長，還原糖含量穩(wěn)步上升，當反應(yīng)時間在100 min左右時，還原糖含量達到峰值，之后趨于穩(wěn)定。由圖4可知，在pH為4.5左右時，還原糖濃度達到了最高，pH過高和過低，都會影響還原糖的生成。

2.4 糖化酶正交試驗結(jié)果

糖化酶正交試驗結(jié)果見表8。

表8 糖化酶正交試驗結(jié)果表

由表8中極差分析結(jié)果可以看出，4個因素的影響主次順序為：加酶量（A）＞反應(yīng)時間（C）＞pH（D）＞反應(yīng)溫度（B）。最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C3D3，即糖化酶加酶量為4.5%，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時間為110 min，pH為5.0。由于該條件組合在試驗中沒有出現(xiàn)，所以在該條件下做了3次驗證試驗，還原糖含量分別為69.3%、69.5%、69.7%，確實高于表中其他試驗組的還原糖含量。

2.5 蛋白酶種類的比較與確定

稱取一定量的原料，使用耐高溫α-淀粉酶和糖化酶處理后，分別加入相同比例的木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味酶，并在該酶最適溫度、pH條件下水解相同的時間，將物料水洗3次后烘干，通過檢測游離氨基酸含量，來確定效果最佳的酶種類，即游離氨基酸含量越高，酶解效果越好。蛋白酶種類的比較見表9。

表9 蛋白酶種類比較表

由表9可知，在各種蛋白酶的最適條件下，添加同樣比例的酶，堿性蛋白酶組樣品中游離氨基酸含量最高，即堿性蛋白酶的酶解效果最好。

2.6 堿性蛋白酶的最佳參數(shù)確定

堿性蛋白酶正交試驗結(jié)果，見表10。

表10 堿性蛋白酶正交試驗結(jié)果表

由表10中極差分析結(jié)果可以看出，4個因素的影響主次順序為pH（D）＞反應(yīng)時間（C）＞加酶量（A）＞反應(yīng)溫度（B）。最佳提取工藝參數(shù)為A2B2C3D2，即加酶量為1.0%，反應(yīng)溫度為55 ℃，反應(yīng)時間為80 min，pH為8.5。由于該條件組合在試驗中沒有出現(xiàn)，所以在該條件下做了3次驗證試驗，膳食纖維含量分別為94.7%、95.0%、94.7%，確實高于表中其他實驗組的膳食纖維含量。

3 結(jié)論

由于豌豆粉絲廢水分離渣都含有大量的淀粉類物質(zhì)，因此淀粉的去除是提高膳食纖維純度的重要環(huán)節(jié)。在淀粉的去除過程中，采用耐高溫α-淀粉酶和糖化酶結(jié)合的方式進行處理。耐高溫α-淀粉酶使物料中的淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖、糊精等，其特征反應(yīng)就是使底物濃度下降，和碘的特征反應(yīng)減弱直至消失[8]。耐高溫α-淀粉酶添加量1.2%，反應(yīng)溫度為90 ℃，反應(yīng)時間為60 min的條件下，豌豆膳食纖維的提取率最高。

使用糖化酶對豌豆粉絲廢水分離渣中的淀粉以及耐高溫α-淀粉酶的水解產(chǎn)物徹底水解，達到100%轉(zhuǎn)化為葡萄糖的效果，方便后期通過水洗的方法將淀粉水解的葡萄糖去除。取糖化酶加酶量為4.5%，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時間為110 min，pH為5.0，可達到良好的水解效果。

在去除豌豆粉絲廢水分離渣蛋白質(zhì)的過程中，選擇了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味酶這4種常用的酶，測試對豌豆粉絲廢水分離渣中蛋白質(zhì)的分解結(jié)果。堿性蛋白酶作為工業(yè)使用廣泛的一種酶，比中性蛋白酶的活性更高[9]，且在試驗過程中對蛋白質(zhì)的分解效果較其他3種酶有明顯優(yōu)勢。經(jīng)優(yōu)化后，蛋白酶的加酶量為1.0%，反應(yīng)溫度為55 ℃，反應(yīng)時間為80 min，pH為8.5，此參數(shù)下酶解效果最佳。

研究表明，在耐高溫α-淀粉酶、糖化酶和堿性蛋白酶的多酶分步水解下，豌豆粉絲廢水分離渣的纖維含量可達到94%以上，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。