體外模擬胃腸消化對云南苦蕎米飯抗氧化成分及其活性的影響

◎ 那 吉，張海芬，楊峰玉，馬 嬌

（1.昆明醫(yī)科大學海源學院，云南 昆明 650106；2.云南民族大學 化學與環(huán)境學院，云南 昆明 650500；3.滇西應(yīng)用技術(shù)大學，云南 大理 671000）

當人體內(nèi)自由基與抗氧化劑失衡時會加速人體衰老并誘發(fā)機體的組織器官發(fā)生病變[1-2]，若能適量攝入外源自由基清除劑可有效清除體內(nèi)過剩自由基，有助于減輕及延緩機體氧化損傷。因此，從傳統(tǒng)的日常飲食中尋求安全可靠的天然抗氧化劑已成為功能食品開發(fā)的熱點[3-4]。

苦蕎麥（Fagopyrum tataricumGaertn.）又名野蕎麥、韃靼蕎麥，在我國西南、中南、華北等省區(qū)均有分布?！侗静菥V目》記載：“苦蕎味苦，性平寒，能實腸胃，益氣力，續(xù)精神，利耳目，煉五臟渣穢”[5]。現(xiàn)代研究證實，苦蕎麥不僅含有人體所需較為全面均衡的氨基酸、蛋白質(zhì)和維生素，還因其含有其他禾谷類所缺乏的黃酮類化合物而表現(xiàn)出顯著的抗氧化、降三高、抗腫瘤和抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[6-7]，是一種非常符合現(xiàn)代人健康觀念的天然抗氧化劑。

傳統(tǒng)的蕎麥抗氧化研究方法主要集中于利用有機溶劑提取有效成分后再評價抗氧化活性大小。許剛[8]對比研究發(fā)現(xiàn)水浴法和超聲法所得蕎麥黃酮提取物對DPPH具有明顯的清除率。曹曉虹等[9]發(fā)現(xiàn)試劑盒蕎麥水提液對·OH、O2-·及DPHH·具有較強的清除作用。張國濤[10]等人發(fā)現(xiàn)蕎麥皮、蕎麥粉和蕎麥粒乙醇提取物對DPPH·自由基和ABTS·自由基均有良好的清除效果。顯然，傳統(tǒng)的蕎麥抗氧化研究方法雖能測定出苦蕎麥中抗氧化活性成分的含量，但并未考慮人體消化過程對苦蕎黃酮產(chǎn)生的影響，因此測定結(jié)果無法真實反映蕎麥黃酮在人體內(nèi)的抗氧化活性變化[11-13]。

與體內(nèi)消化模型相比，體外模擬胃腸消化模型因具備操作簡單、安全、可重復性強等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用于模擬消化實驗中[14]。目前有關(guān)云南苦蕎米飯在體外模擬胃腸消化過程中抗氧化成分及其活性的變化研究鮮有報道。鑒于此，本文以云南苦蕎米為材料，首先通過模擬人體日常飲食方式將其加工成苦蕎米飯后，通過模擬胃腸消化過程，采用水溶性ABTS法測定模擬消化液的抗氧化活性，研究云南苦蕎米飯在體外模擬胃腸消化過程中黃酮釋放量及抗氧化活性的變化規(guī)律，以期為深入研究云南苦蕎在體內(nèi)的真實消化及其抗氧化成分變化規(guī)律提供有效的理論依據(jù)，也為苦蕎新功能性食品研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南苦蕎米，2019年7月購于云南東巴客食品有限公司，常溫、避光儲藏。胃蛋白酶、胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；蘆丁標準品，購于天津市一方科技有限公司；ABTS，美國Sigma公司；無水乙醇、磷酸二氫鉀、硝酸鋁、亞硝酸鈉等其他試劑均為國產(chǎn)分析純；超純水為實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1950紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；JR05-300不銹鋼多功能料理機、蘇泊爾（SUPOR）電飯煲，浙江蘇泊爾電器有限公司；FA2004電子分析天平，上海上平儀器公司；PHS-3C酸度計，上海卓精電子科技有限公司；HA-B水浴恒溫振蕩器，天津市泰斯特儀器有限公司；TGL-60B高速離心機，上海安亭科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 苦蕎米飯樣品的加工

采用模擬人體日常飲食方式加工苦蕎米。取適量苦蕎米于電飯煲中加水煮熟，用多功能料理機搗碎至一定細度，裝入自封袋內(nèi)于-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 體外模擬胃腸消化實驗

（1）體外模擬胃消化。參照文獻[11-13]中方法并改進，稱取5 g苦蕎米飯，加入50 mL生理鹽水混勻后搗碎3 min制成勻漿液。模擬胃消化實驗共有3個平行組，模擬胃消化組：取50 mL勻漿液用水浴加熱至37 ℃，用1.0 mol·L-1的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0，加入20 mL模擬胃液（1.0 g胃蛋白酶溶于50 mL水）。胃酸對照組：胃蛋白酶消化液用等體積的0.01 mol·L-1HCl溶液進行替代。胃空白對照組：50 mL勻漿液中加入20 mL生理鹽水。避光后沖入氮氣，于37 ℃恒溫水浴搖床中振搖，分別在消化0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h和4 h時取定量消化液4 500 r·min-1離心兩次，收集上清液儲存于-20 ℃，備用。

（2）體外模擬腸消化。按照上述方法先將苦蕎米飯模擬胃消化過程1.5 h后，在此消化液中繼續(xù)模擬腸消化。模擬腸消化實驗中有2個平行組。①模擬腸消化組：50 mL勻漿液于37 ℃經(jīng)過模擬胃消化1.5 h后用1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)至pH為7.0，加入20 mL人工模擬腸液（0.68 g磷酸二氫鉀中加入50 mL蒸餾水后加入1.0 g胰蛋白酶）。②腸空白對照組：用等體積的NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液替代模擬腸液進行試驗。兩組模擬消化液均于37 ℃恒溫水浴搖床中避光振搖，分別在消化0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h和4 h時取定量消化液4 500 r·min-1離心10 min，收集上清液儲存于-20 ℃。

1.3.3 蘆丁濃度與吸光度標準曲線制作

參考繆園欣等[15]的研究方法稍做改進，準確稱取干燥至恒重的蘆丁標準品13 mg于25 mL容量瓶中，加乙醇完全溶解后定容；將上述溶液稀釋至質(zhì)量濃度為0.104 mg·mL-1，裝入棕色容量瓶中備用。分別準確吸取蘆丁標準溶液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL于10 mL比色管中，加入0.5 mL 5%NaNO2溶液，反應(yīng)靜置5 min后再加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL反應(yīng)5 min。加入4%NaOH溶液4.0 mL，搖勻靜置15 min后于波長510 nm處測量吸光度值，以吸光度值對蘆丁標準溶液的質(zhì)量濃度繪制標準曲線。

1.3.4 模擬消化液中總黃酮含量的測定

將模擬消化液適當稀釋后準確移取1.0 mL樣品溶液，按1.2.3的操作方法測得樣品模擬消化液中總黃酮的含量。以蘆丁為標準品，總黃酮含量以每百克苦蕎米飯中所含蘆丁當量表示，單位為mg/100 g，根據(jù)模擬胃腸消化液中黃酮含量計算苦蕎米飯中總黃酮的釋放量?？傸S酮的釋放量按下式計算：

式中：ρ1為模擬胃腸消化液中總黃酮含量，mg·mL-1；V1為模擬胃腸消化液的總體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為苦蕎米飯樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 模擬胃腸消化液清除ABTS自由基能力測定

參照李培源等[16]的實驗方法并做改進：將7.4 mmol·L-1的 ABTS 儲 備 液 和 等 量 2.6 mmol·L-1的K2S2O8儲備液于室溫下混合避光保存12～16 h后，使用前用磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.40）稀釋，使其吸光度值為0.7±0.02，上述溶液需于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

向200 μL模擬消化液中加入4.0 mL ABTS溶液，于室溫下避光反應(yīng)8 min后測定其吸光度值（λmax=734 nm），樣品的清除率（%）計算如下：

式中：Ai為樣品與ABTS自由基溶液的吸光度；Aj為樣品與緩沖溶液的吸光度；A0為ABTS自由基溶液與蒸餾水的吸光度。）

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2012軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算相對標準偏差（X—±RSD）和顯著性水平（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標準曲線及回歸方程

蘆丁標準曲線的線性方程為A=11.192C+0.007 3，R2=0.999 0，表明在該濃度范圍內(nèi)蘆丁與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 體外模擬胃腸消化液中總黃酮的釋放量

模擬胃腸消化液中總黃酮釋放量的變化結(jié)果見圖1和圖2。由圖1可知，在模擬胃消化過程的4 h內(nèi)，空白對照組中黃酮釋放量變化不明顯，但胃酸對照組和模擬胃液消化組中黃酮釋放量隨模擬時間的延長而逐漸上升。當模擬消化1.5 h時，兩組中黃酮釋放量均已達最大值（p＜0.05），具有顯著性差異，之后變化趨于穩(wěn)定。1.5 h時空白對照組的黃酮釋放量僅為（58.6±2.69）mg Rutin/100 g，此時模擬胃液組中黃酮釋放量為（111.8±3.5）mg Rutin/100 g，釋放量比空白組增加1.91倍，胃酸對照組中黃酮釋放量（73.6±2.86）mg Rutin/100 g比空白組增加1.26倍。由圖2可知，消化液中黃酮釋放量在模擬腸消化階段呈下降的趨勢（p＜0.05），并于消化1 h后逐漸趨于穩(wěn)定。模擬消化1 h時，模擬腸液組中黃酮釋放量為（64.20±2.45）mg Rutin/100 g，空白對照組中黃酮釋放量為（44.20±2.38）mg Rutin/100 g，相比增加1.45倍，實驗結(jié)果可表明胃蛋白酶、胃酸和胰蛋白酶均可促進苦蕎米飯中黃酮的釋放。

通過對比圖1和圖2可知，苦蕎米飯中黃酮釋放量在胃消化過程中總體增加，模擬腸消化過程中總體有降低的趨勢，但與空白組相比仍有明顯增加，與李貽等[11]人的研究結(jié)果基本一致。這可能與2個原因有關(guān)。①苦蕎黃酮主要成分為蘆丁、槲皮素、山奈酚等，各主要成分之間的基團作用力會在模擬胃液消化環(huán)境較低pH中有所減弱，有利于黃酮類物質(zhì)的釋放。②在模擬消化溫度37 ℃時，苦蕎米飯中易水解的黃酮類物質(zhì)可能因發(fā)生水解而被釋放。

圖1 苦蕎米飯體外模擬胃消化過程中黃酮釋放量的變化圖

圖2 苦蕎米飯體外模擬腸消化過程中黃酮釋放量的變化圖

2.3 模擬胃腸消化對ABTS自由基清除率的影響

圖3、圖4表示了苦蕎米飯在體外模擬胃腸消化過程中ABTS自由基清除率大小的變化，通過ABTS自由基的清除率大小可反映出苦蕎米飯抗氧化活性的大小。

圖3 苦蕎米飯體外模擬胃消化中ABTS自由基的清除率變化圖

圖4 苦蕎米飯體外模擬腸消化中ABTS自由基清除率的變化圖

在模擬胃消化階段，空白對照組對ABTS自由基的清除率變化不明顯。與空白對照組相比，模擬胃液消化組和胃酸對照組1.5 h內(nèi)ABTS自由基的清除率有明顯增加的趨勢（p＜0.05）。1.5 h時空白對照組ABTS自由基的清除率為（41.60±0.06）%，1.5 h時模擬胃液消化組ABTS自由基的清除率可達（70.17±0.08）%，比空白對照組增加了1.67倍。1.5 h時胃酸對照組ABTS自由基的清除率達（56.41±0.06）%，增加1.36倍。在模擬腸消化過程中，ABTS自由基的清除率總體呈下降趨勢（p＜0.05），1.5 h后趨于穩(wěn)定。1.5 h空白對照組ABTS自由基的清除率為（31.68±0.05）%，1.5 h腸消化組ABTS自由基的清除率為（35.32±0.06）%，比腸空白組增加1.11倍，由此說明胰蛋白酶有利于苦蕎米飯抗氧化活性的增加。

3 結(jié)論

本研究表明，苦蕎米飯中黃酮主要在模擬胃消化中釋放，黃酮釋放量在胃消化階段總體增加、在腸消化過程中總體降低。與空白對照組相比，苦蕎米飯模擬胃液消化組1.5 h內(nèi)黃酮釋放量、ABTS自由基清除率具有明顯的上升趨勢（p＜0.05），最大值分別為（111.8±3.5）mg Rutin/100 g、（70.17±0.08）%，增加了1.91倍、1.67倍，之后趨于穩(wěn)定；胃酸組1.5 h內(nèi)黃酮釋放量、ABTS自由基清除率明顯上升（p＜0.05），最大值分別為（73.6±2.86）mg Rutin/100 g及（56.41±0.06）%，增加了1.26倍、1.36倍，之后趨于穩(wěn)定。苦蕎米飯模擬腸消化組1.5 h內(nèi)黃酮釋放量及其ABTS自由基的清除率明顯高于空白對照組（p＜0.05），最大值分別為（64.20±2.45）mg Rutin/100 g、（35.32±0.06）%，比空白對照組增加1.45倍、1.11倍，之后變化基本穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明，胃蛋白酶、胃酸和胰酶能促進云南苦蕎米飯中抗氧化成分的釋放及其抗氧化活性的增加，為苦蕎新功能性食品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。