超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中的6種鎮(zhèn)痛類化學(xué)成分

董亞蕾，喬亞森，黃傳峰，王海燕，孫 磊

（中國食品藥品檢定研究院，國家藥品監(jiān)督管理局化妝品研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

隨著化妝品市場規(guī)模的不斷擴(kuò)大，我國已成為世界上第二大化妝品消費(fèi)市場。人們對(duì)化妝品的質(zhì)量要求越來越高，同時(shí)對(duì)其安全性問題也日漸重視。為滿足不同人群的需要，化妝品品類深度細(xì)分，各種不同目的、不同功效、不同使用場景的化妝品層出不窮［1］。但為盲目追求產(chǎn)品功效，不法生產(chǎn)商向化妝品中違規(guī)添加各類化學(xué)藥物，導(dǎo)致皮膚不良反應(yīng)甚至損害人體健康的事件時(shí)有發(fā)生［2］。例如，非那西丁是解熱鎮(zhèn)痛藥，但會(huì)嚴(yán)重?fù)p害腎臟甚至誘發(fā)癌癥，已被許多國家禁售。雙氯芬酸鈉和吲哚美辛是常見的非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥物，使用不當(dāng)會(huì)引發(fā)不良反應(yīng)，甚至導(dǎo)致休克和衰竭。保泰松是吡唑酮類消炎鎮(zhèn)痛藥，具有祛痘、抗粉刺等功效，但長期使用會(huì)造成人體多器官慢性損傷。這些藥物成本低廉，能夠顯著緩解疼痛，可被添加在祛痘、舒緩、防曬和曬后修復(fù)等化妝品中，以降低皮膚痛感，消費(fèi)者在不知情的情況下長期使用，將會(huì)引起健康危害。

鎮(zhèn)痛類藥物的測定方法主要有電致發(fā)光法［3］、高效液相色譜法［4］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［5］，但已報(bào)道的研究大多集中在中成藥［6-7］、保健食品［8］。目前關(guān)于化妝品中鎮(zhèn)痛類藥物的研究較少，我國也尚未制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，高效液相色譜法被用于測定化妝品中的保泰松［9］和氯苯那敏［10］，染發(fā)劑中的非那西?。?1］以及植物精油中的雙氯芬酸鈉［12］。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-MS/MS）被用于同時(shí)測定祛痘類化妝品中的保泰松和氨基比林［13］。UHPLC-MS/MS 法高效快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度好，適合于痕量物質(zhì)檢測，在化妝品中非法添加化學(xué)藥物的檢測方面具有顯著優(yōu)勢［14-15］。目前，同時(shí)測定化妝品中多種鎮(zhèn)痛類藥物的UHPLC-MS/MS法尚未報(bào)道。

本研究選擇非那西丁、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、保泰松、氨基比林、氯苯那敏6 種鎮(zhèn)痛類化學(xué)成分作為目標(biāo)物，通過對(duì)前處理?xiàng)l件、色譜條件、質(zhì)譜條件的優(yōu)化，采用UHPLC-MS/MS 建立了同時(shí)測定膏霜、面膜、啫喱和噴霧等化妝品中6 種鎮(zhèn)痛類化學(xué)成分的方法。該方法提高了檢測靈敏度和檢測效率，為化妝品安全監(jiān)管工作提供了可靠的檢測方法和技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Triple Quad 4500 型高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；G10 型離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；Vortex-5 渦旋振蕩器（江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ-700DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AL204型電子天平（美國Sartorius公司）。

非那西丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度100.0%，北京振翔科技有限公司）；雙氯芬酸鈉（100.0%）、吲哚美辛（99.9%）、保泰松（99.8%）、氨基比林（99.7%）、氯苯那敏馬來酸鹽（99.7%）標(biāo)準(zhǔn)品均來自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、乙酸銨（質(zhì)譜純，美國Fisher公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取氨基比林、非那西丁、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、保泰松、氯苯那敏馬來酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加入甲醇溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液備用，4 ℃避光保存。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別取標(biāo)準(zhǔn)中間液適量，用50%乙腈稀釋成質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

1.3 樣品前處理

稱取化妝品樣品0.2 g 于10 mL 具塞離心管中，加入2 mL 飽和氯化鈉，充分渦旋混勻，加入5 mL乙腈，渦旋分散，超聲提取5 min，以10 000 r/min 離心5 min。移取上清液，加入5 mL 乙腈重復(fù)提取1次，合并提取液。提取液用水稀釋2倍，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，待測定。防曬噴霧類化妝品經(jīng)超聲去除推進(jìn)劑后稱樣進(jìn)行前處理。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相A：水（含5 mmol/L 乙酸銨），流動(dòng)相B：乙腈（含5 mmol/L 乙酸銨）；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0~10 min，5%~95%B；10~12 min，95%B；12~12.5 min，95%~5%B；12.5~14 min，5%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子化模式：ESI+；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：0.17 MPa；霧化氣壓力：0.38 MPa；輔助氣壓力：0.38 MPa。6種鎮(zhèn)痛類藥物的母離子、子離子、去簇電壓（DP）、碰撞能（CE）等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 6種化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the 6 compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇向空白的膏霜、面膜、啫喱和噴霧化妝品基質(zhì)中加入6 種待測化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以該加標(biāo)樣品為研究對(duì)象，考察了甲醇、乙醇、乙腈3種常用有機(jī)試劑作為提取溶劑的效果。結(jié)果顯示，在面膜和噴霧基質(zhì)中，上述3種提取溶劑對(duì)6種化合物回收率的影響不大。但在膏霜基質(zhì)中，采用甲醇作為提取溶劑時(shí)，6 種化合物的回收率低于乙醇和乙腈（如圖1）。乙醇和乙腈作為提取溶劑時(shí)各化合物的回收率比較接近，但采用乙醇提取樣品時(shí)，提取液經(jīng)水稀釋后產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象，導(dǎo)致過膜困難。同樣的現(xiàn)象也存在于啫喱基質(zhì)中。因此，最終采用乙腈作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)膏霜基質(zhì)中6種化合物回收率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on recoveries of 6 compounds in cream sample

2.1.2 提取溶劑中甲酸含量的影響6 種待測化合物的結(jié)構(gòu)各不相同，酸堿性差別較大，為獲得更好的提取效果，考察了向提取溶劑中加入不同含量甲酸對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明，甲酸對(duì)化妝品中氨基比林的回收率影響較大。如圖2A 所示，不加甲酸時(shí)，在膏霜、面膜、啫喱和噴霧4種基質(zhì)中氨基比林的回收率為83.9%~91.5%，加入的甲酸含量越高，氨基比林的回收率越低。這可能是由于氨基比林為堿性化合物，甲酸的存在導(dǎo)致氨基比林離子化，在有機(jī)相中的分配減少，因此提取效率降低。其他5種化合物的回收率受甲酸含量的影響不大。圖2B 為不同甲酸含量（0、0.2%、0.4%、0.6%）時(shí)5 種化合物回收率的平均值。除保泰松在面膜中的平均回收率為77.4%外，4種基質(zhì)中其余5種化合物的平均回收率為97.9%~103%，標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍較小，說明甲酸含量對(duì)其余5種化合物的回收率影響不大。因此，為使6種化合物均能獲得較好的回收率，選擇不加甲酸的純乙腈作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑中甲酸（FA）含量對(duì)氨基比林（A）和其它5種化合物（B）平均回收率的影響Fig.2 Effect of formic acid（FA）in extraction solvent on the recoveries of aminopyrine（A）and other 5 compounds（B）

2.1.3 提取方式的影響對(duì)化妝品進(jìn)行液液萃?。↙L）時(shí)，基質(zhì)的充分分散有利于目標(biāo)化合物的充分提?。?6］。向化妝品加入少量飽和氯化鈉，有利于膠束破乳，促進(jìn)基質(zhì)分散，同時(shí)可促進(jìn)水相與乙腈之間分層。在加標(biāo)水平為25 μg/L，提取溶劑體積為10 mL 時(shí)，考察了提取方式對(duì)加標(biāo)回收率的影響。提取方式如下：一種是直接采用10 mL 乙腈進(jìn)行一步提取（記為LL-1）；另一種是將提取溶劑分為2 次，每次5 mL 進(jìn)行分步提?。ㄓ洖長L-2）。4 種基質(zhì)中6 種化合物采用不同提取方式的回收率見表2。由表2可知，相比一步提取，采用分步提取能獲得更高的回收率。因此，最終采用10 mL乙腈分步提取方式進(jìn)行樣品前處理。

表2 6種化合物在一步提取（LL-1）和分步提?。↙L-2）時(shí)的加標(biāo)回收率（%）Table 2 Recoveries of six compounds with one step extraction（LL-1）and step by step extraction（LL-2）（%）

2.1.4 超聲提取時(shí)間的影響在加標(biāo)濃度為25 μg/L時(shí)，考察了超聲時(shí)間對(duì)6 種化合物回收率的影響。如圖3 所示，膏霜基質(zhì)中保泰松的回收率受超聲時(shí)間的影響較大，超聲5 min 時(shí)的回收率最高，此后隨著超聲時(shí)間的延長，回收率顯著下降。氨基比林的回收率也從92.2%降至78.0%，其他化合物的回收率隨超聲時(shí)間的延長而略有降低。面膜、啫喱和噴霧3種基質(zhì)中，6種化合物的回收率受超聲時(shí)間的影響不大，且均能達(dá)到80%以上。因此，選擇最佳超聲提取時(shí)間為5 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)膏霜化妝品中6種化合物加標(biāo)回收率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the recoveries of six compounds in cream

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇根據(jù)6種化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/L）比較了BEH Shield RP18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、CORTECS C8（2.1 mm ×100 mm，2.7 μm）和BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）3 種色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，采用前兩種色譜柱時(shí)，大部分化合物出現(xiàn)峰拖尾、峰形差等現(xiàn)象。而采用BEH C18柱時(shí)，6種化合物的保留時(shí)間有所區(qū)分，分離度較好，且能夠獲得較好的峰形。因此，最終采用BEH C18柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化比較了甲醇-水和乙腈-水2 種流動(dòng)相體系對(duì)6 種化合物分離效果的影響，結(jié)果表明2 種流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響不大。考慮到提取溶劑為乙腈，因此流動(dòng)相采用乙腈-水體系?？疾炝思姿?、甲酸銨和乙酸銨3 種流動(dòng)相添加劑對(duì)分離效果的影響。結(jié)果顯示，在相同的梯度洗脫條件下，采用甲酸為流動(dòng)相添加劑時(shí)保泰松的峰分叉嚴(yán)重，氨基比林的峰形較差；采用甲酸銨時(shí)，大部分化合物不出峰；以5 mmol/L 乙酸銨為添加劑時(shí)，6 種化合物均能獲得較好的峰形和分離效果。這可能是由于乙酸銨體系可以改善含堿性基團(tuán)化合物的峰形。因此，選擇最佳流動(dòng)相為含5 mmol/L 乙酸銨的乙腈和水。

2.2.3 進(jìn)樣溶劑的優(yōu)化由于提取溶劑為純乙腈，而初始流動(dòng)相中含有大量水，流動(dòng)相的洗脫能力弱于樣品溶劑，導(dǎo)致色譜分離過程中溶劑效應(yīng)顯著［17-18］，6種化合物的峰形展寬嚴(yán)重。為克服溶劑效應(yīng)，采用稀釋劑對(duì)樣品提取液進(jìn)行稀釋后再進(jìn)樣。以6 種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/L）為研究對(duì)象，考察了進(jìn)樣溶劑中乙腈比例分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%時(shí)對(duì)分離效果的影響。結(jié)果顯示，采用30%~60%乙腈作為進(jìn)樣溶劑，6 種化合物的色譜峰均峰形尖銳，峰面積相差不大，但乙腈比例為50%時(shí)能夠獲得更大的峰面積。繼續(xù)增大乙腈的比例，6 種化合物的保留時(shí)間均縮短，但峰形變差。因此，進(jìn)樣溶劑中最佳乙腈比例為50%。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用合適質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在MS Only模式下，通過針泵注射將單標(biāo)溶液進(jìn)入質(zhì)譜，調(diào)整質(zhì)譜條件獲得各化合物的母離子信息。將母離子打碎，尋找合適的特征子離子，再通過優(yōu)化碰撞能、去簇電壓等條件，得到各化合物的特征碎片離子及相應(yīng)的質(zhì)譜條件。最終，在正離子模式及MRM模式下對(duì)6種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，能獲得穩(wěn)定的母離子和子離子。最佳實(shí)驗(yàn)條件下，6種化合物（質(zhì)量濃度為50 μg/L）的提取離子色譜圖如圖4所示。

圖4 6種化合物的提取離子色譜圖（50 μg/L）Fig.4 Extract ion chromatograms of 6 compounds（50 μg/L）

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，以兩者斜率之比考察了方法的基質(zhì)效應(yīng)。比值越接近1，說明基質(zhì)效應(yīng)越小。結(jié)果表明，氯苯那敏在4種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)為150%左右，說明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其它5 種化合物在4 種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)為30.5%~50.1%，說明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)?？朔|(zhì)效應(yīng)常用的方法有采用同位素內(nèi)標(biāo)、改進(jìn)色譜分離、采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校正等［19］。其中，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正的效果良好，且具有廉價(jià)、操作簡便的特點(diǎn)［20］。因此，實(shí)驗(yàn)分別選用膏霜、面膜、啫喱和噴霧作為4種代表性基質(zhì)，采用基質(zhì)加標(biāo)法定量，以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 線性關(guān)系與檢出限分別采用膏霜、面膜、啫喱和噴霧樣品為空白基質(zhì)，配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本方法進(jìn)行前處理和測定，以6 種化合物定量子離子的峰面積對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，6種化合物的線性范圍為5~200 μg/L，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計(jì)算檢出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10），6 種化合物的LOD 均為0.15 μg/g，LOQ 均為0.50 μg/g（見表3）。該方法適用于膏霜、面膜、啫喱和噴霧類化妝品中6種化合物的同時(shí)測定。

表3 6種化合物在不同基質(zhì)中的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限Table 3 Linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of 6 compounds in different matrix

2.5.2 精密度采用上述4種基質(zhì)的空白加標(biāo)樣品，在相同條件下平行處理6份并采用本方法進(jìn)行測定，以測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評(píng)估方法的日內(nèi)精密度。在相同條件下連續(xù)測定3 d，計(jì)算得到方法的日間精密度（見表4）。結(jié)果顯示，該方法在處理不同基質(zhì)類型的化妝品時(shí)，日內(nèi)RSD 均不大于7.9%，日間RSD均不大于9.7%，說明方法的精密度良好。

表4 不同基質(zhì)中6種化合物的精密度（%）Table 4 Precisions of 6 compounds in different matrix（%）

2.5.3 回收率為驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度，在膏霜、面膜、啫喱和噴霧4種空白樣品中進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行6 份，計(jì)算平均回收率和RSD（見表5）。結(jié)果表明，6 種化合物在4 種基質(zhì)中的回收率為75.0%~120%，RSD 為0.72%~8.6%。該方法靈敏、準(zhǔn)確、有效，能夠用于多種類型化妝品中6種鎮(zhèn)痛類藥物的同時(shí)測定。

表5 不同基質(zhì)中6種化合物的平均回收率和RSD（%）Table 5 Average recoveries and RSDs of 6 compounds in different matrix（%）

2.6 實(shí)際樣品的分析

采用該方法測定10批膏霜、6批乳液、4批啫喱和4批防曬噴霧等具有祛痘和曬后修復(fù)功效的化妝品中6種目標(biāo)化合物的含量，結(jié)果均未檢出。圖5為某款啫喱加標(biāo)樣品的總離子流圖，在該圖基礎(chǔ)上提取6個(gè)化合物的色譜圖，峰形尖銳，無基質(zhì)干擾，證明該方法可用于實(shí)際樣品的分析。

圖5 某款啫喱加標(biāo)樣品的總離子流圖（加標(biāo)濃度：5 μg/L）Fig.5 Total ion chromatogram of 6 components（added 5 μg/L）spiked in a gel sample

3 結(jié) 論

本文建立了UHPLC-MS/MS 測定膏霜、面膜、啫喱和防曬噴霧類化妝品中非那西丁、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、保泰松、氨基比林和氯苯那敏含量的方法。該方法前處理簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可用于化妝品中6 種鎮(zhèn)痛類化學(xué)成分的測定，為祛痘和曬后修復(fù)類化妝品中非法添加鎮(zhèn)痛類化學(xué)成分的檢測提供了技術(shù)支撐。