白及膠/微米三七膏含藥血清對脂多糖誘導的巨噬細胞核因子-κB 信號通路的影響

頡 玙，張 康，張金梅，張 敏，雷 霆

脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌外膜的重要組成成分，被定義為毒力因子和血清型特異免疫原[1-2]。在介導炎癥反應的過程中，巨噬細胞起最主要作用，正常時呈靜息狀態(tài)，受刺激后，能分泌出多種炎性介質[3]。因此，利用LPS 誘導RAW264.7巨噬細胞發(fā)生炎癥反應，并通過藥物干預來觀察藥物對炎癥反應的影響，已經成為實驗中常用的模型[4]。糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）是一種慢性難愈性潰瘍，該病發(fā)生發(fā)展周期較長、治療費用高、預后效果差，給患者造成了沉重的負擔。在DFU 創(chuàng)面炎癥反應中，巨噬細胞激活核因子（NF）-κB 的結合活性，上調多個相關炎性基因表達產生大量炎性因子，如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β 等。TNF-α可增加線粒體生成，加劇氧化應激，激活IκB 激酶（IKK），更進一步刺激NF-κB，使之釋放更多炎性因子，形成慢性低度炎癥信號的正反饋[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)白及膠/微米三七膏具有促進DFU 慢性潰瘍創(chuàng)面肉芽組織修復及抑制炎性細胞因子的功效[7]，但具體機制尚不明確。本研究在此基礎上應用白及膠/微米三七膏含藥血清作用于LPS 誘導的RAW264.7 細胞炎癥損傷模型，進一步探討基于NF-κB 信號通路白及膠/微米三七膏含藥血清改善炎癥反應的機制，從而為DFU 的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞 小鼠巨噬細胞RAW264.7，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物 白及膠/微米三七膏含藥血清，陜西省中藥資源產業(yè)化協(xié)同創(chuàng)業(yè)中心制作。制備方法：將水體醇沉法提取的白及膠與振動機細胞級超微粉碎機制取的微米三七粉按照1.5︰1、3︰1、6︰1比例放入燒杯，加入蒸餾水，加熱并攪拌藥液2 h，過濾藥液，將藥渣再次加熱過濾，合并兩次過濾液，濃縮至1 g（生藥）/mL，即白及膠/微米三七膏。將制備好的白及膠/微米三七膏分組給予大鼠灌胃，連續(xù)7 d 后自腹主動脈采血，抽取血清。經前期實驗證實白及膠/微米三七膏含藥血清最佳比例為6︰1，本次選用6︰1 濃度的白及膠/微米三七膏含藥血清進行實驗。

1.3 主要試劑與儀器 脂多糖，美國Sigma-Aldrich 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基，美國GIBCO 公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；CCK-8 細胞增殖-毒性檢測試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒均購自博士德生物工程有限公司；蛋白Marker、PVDF 膜，上海碧云天生物技術有限公司；ECL 顯影定影試劑，美國Thermo Fisher Scientific公司；蛋白提取試劑盒，上海貝博生物科技公司；一 抗NF-κB p65、p-IκBα、β-actin、Histone H3、二抗HRP 標記山羊抗兔IgG 為沈陽萬類生物科技有限公司產品。

1.4 檢測建立RAW264.7 細胞炎癥損傷模型的LPS 最佳濃度 將RAW264.7 細胞設置為正常對照組及不同濃度（5、10、15、20、25 μg/mL）的LPS 組，前者加入RPMI-1640 基礎培養(yǎng)基，后者依次加入不同濃度梯度的LPS 溶液，用CCK-8 法得到各組光密度（OD）值及細胞增殖率，最終篩選出LPS 的最佳濃度。

1.5 檢測白及膠/微米三七膏含藥血清最佳濃度取對數(shù)生長期的RAW264.7 細胞，設置為正常對照組、LPS 組（最佳濃度）和不同濃度梯度（50、100、150、200、250、300 μL/mL）的白及膠/微米三七膏含藥血清＋LPS 組。在對照組中加入RPMI-1640 基礎培養(yǎng)基，其他組均加入LPS（最佳濃度）溶液，培養(yǎng)2 h 后加入不同濃度梯度的白及膠/微米三七膏含藥血清，采用CCK-8 法檢測各組的OD 值，確定白及膠/微米三七膏含藥血清的最佳濃度。

1.6 細胞培養(yǎng) 將細胞分為正常對照組、空白血清組、含藥血清組、LPS 組、LPS+空白血清組和LPS+含藥血清組。前3 組中加入RPMI-1640 基礎培養(yǎng)基；后3 組中加入LPS（最佳濃度）培養(yǎng)2 h；在含藥血清組和LPS+含藥血清組中加入最佳濃度的白及膠/微米三七膏含藥血清；在空白血清組與LPS+空白血清組中加入空白血清共同干預22 h。培養(yǎng)完成經離心后，按組分裝于離心管中。

1.7 Western blotting 法檢測細胞漿/細胞核NFκB p65 蛋白水平和細胞漿p-IκBα 蛋白水平細胞培養(yǎng)方法和分組同1.5，解凍樣品，首先將細胞用RIPA 裂解液處理，離心后取上清，根據(jù)試劑盒說明提取胞核和胞漿蛋白，制備蛋白質待測液，加入BCA 工作液，放于37 ℃環(huán)境中20 min，用酶標儀在波長為562 nm 處測其OD 值，計算樣品蛋白濃度。經過60 V、90 V、120 V 電壓SDSPAGE 凝膠電泳，在380 mA 電流中轉膜90 min，再經過封閉1 h、TBST 洗膜、一抗、二抗孵育，最終用ECL 試劑顯影、定影。對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，觀察白及膠/微米三七膏含藥血清對細胞漿/細胞核NF-κB p65 及細胞漿p-IκBα 蛋白表達的影響。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較采用t檢驗，采用GraphPad 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和制圖，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LPS最佳濃度 LPS 誘導RAW264.7 巨噬細胞24 h 后，相比正常對照組，5、15、20 及25 μg/mL 的LPS 溶液對誘導RAW264.7 細胞影響較明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常對照組OD 值 為1.072±0.102，10 μg/mL 的LPS 溶液對誘導RAW264.7 細胞影響最顯著，OD 值為2.045±0.060，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。因此，本次建模選用10 μg/mL 的LPS 溶液作為最佳濃度。見表1。

表1 LPS 作用對巨噬細胞增殖的影響

2.2 白及膠/微米三七膏含藥血清最佳濃度 不同濃度梯度的白及膠/微米三七膏含藥血清的OD 值均高于正常對照組，且低于LPS 組。在白及膠/微米三七膏含藥血清干預LPS 誘導的炎癥模型24 h后，100、150、200、300 μL/mL 的 白 及 膠/ 微米三七膏含藥血清抑制LPS 誘導的炎癥模型較為明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。正常對照組OD 值為1.111±0.113。250 μL/mL 白及膠/微米三七膏含藥血清對LPS 誘導的炎癥模型抑制最顯著（P<0.01），OD 值為1.300±0.016。因此，選擇250 μL/mL 的白及膠/微米三七膏含藥血清作為本研究含藥血清組的最佳濃度。見表2。

表2 白及膠/微米三七膏對巨噬細胞炎癥模型的影響

2.3 白及膠/微米三七膏對細胞漿和細胞核NFκB p65 蛋白表達量的影響 含藥血清組、空白血清組與正常對照組細胞漿NF-κB p65 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。LPS 組相比正常對照組顯著降低，LPS+含藥血清組相比LPS 組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1。含藥血清組、空白血清組與正常對照組細胞核NFκB p65 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。LPS 組相比正常對照組顯著增高，LPS+含藥血清組相比LPS 組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖2。

圖1 白及膠/微米三七膏對細胞漿NF-κB p65蛋白表達的影響

圖2 白及膠/微米三七膏對細胞核NF-κB p65蛋白表達的影響

2.4 白及膠/微米三七膏對細胞漿p-IκBα 蛋白表達的影響 含藥血清組、空白血清組與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。LPS 組相比正常對照組顯著增高，LPS+含藥血清組相比LPS組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖3。

圖3 白及膠/微米三七膏對細胞漿p-IκBα蛋白表達的影響

3 討論

DFU 是糖尿病患者中晚期嚴重的慢性并發(fā)癥之一[8]，目前有關DFU 的現(xiàn)代醫(yī)學治療方法尚未有新的突破，課題組研制的“白及膠/微米三七膏”作為院內制劑，用于臨床診療，效果滿意。白及可止血消腫，生肌斂瘡，消炎止痛[9]。白及膠是從白及塊莖中提煉出的，主要成分為葡萄糖和甘露糖，并通過糖苷鍵聚合而成的水溶性多糖，是一種天然高分子材料，可作為安全有效的生物醫(yī)學材料[10]。三七有化瘀生新、止血定痛的作用，三七超微粉碎后可以破壞植物細胞的細胞壁，有利于其有效成分三七總皂苷(PNS)溶出[11-12]，楊煜等[13]通過實驗證實PNS 能增加凝血的時間，降低血小板、紅細胞的聚集和黏附，使血液黏稠度降低，起到活血化瘀的作用。它還能明顯減輕因緩激肽、5-羥色氨等物質引起的毛細血管通透性增加，并通過抑制肥大細胞釋放的組織胺等活性物質減少滲出，降低早期血管通透性，故而起到抗炎作用[14]。

NF-κB 通路是炎癥反應中的經典通路，NF-κB 與起抑制作用的蛋白I-κB 相結合，在細胞漿中呈無活性狀態(tài)存在[15]。I-κB 的亞型種類繁多，其中I-κBα 抑制NF-κB 的作用最強，故I-κBα 可作為考察指標。當受到外在因子刺激時，IKK 被激活，I-κBα 在IKK 的催化下被磷酸化，致使NF-κB 二聚體與I-κBα 分離，游離狀態(tài)的NF-κB p65 轉位到細胞核后，作用于核內相應的炎性基因，促使靶基因進行轉錄和表達，引發(fā)炎癥反應[16]。本研究成功建立LPS 誘導巨噬細胞增殖、分泌炎性因子的模型，并在此基礎上進行不同方式的干預。結果顯示，加入白及膠/微米三七膏含藥血清后炎癥反應得到了明顯的改善。含藥血清組細胞漿NF-κB p65 蛋白表達量顯著增高，細胞核NF-κB p65 和細胞漿p-IκBα 蛋白表達量顯著降低。推測白及膠/微米三七膏含藥血清通過NF-κB 通路抑制NF-κB p65 進入細胞核，下調I-κBα 的磷酸化，從而減少巨噬細胞分泌炎性因子來改善LPS 誘導的炎癥反應。

綜上所述，白及膠/微米三七膏含藥血清對LPS 誘導的細胞炎癥損傷模型具有顯著的改善作用，這也為防治DFU 提供新的理論依據(jù)和思路，但由于創(chuàng)面炎癥機制復雜，且白及、三七藥理作用廣泛，其治療DFU 的具體作用機制是否存在多通路及多靶點目前尚不明確，值得進一步探究。