中性鹽和堿性鹽脅迫對蕓豆可溶性糖及鉀鈉離子含量的影響

劉本帥，于立河，2，于崧，2，楊賀麟，閆天雨，朱雪天

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點實驗室）

土地鹽堿化作為重大的全球性非生物環(huán)境脅迫因素，嚴(yán)重破壞了土地資源，制約著當(dāng)今農(nóng)業(yè)的發(fā)展，目前全世界鹽漬化土地面積約為10億hm2[1]。世界三大鹽堿土分布區(qū)的松嫩平原成為了我國最大的蘇打鹽堿土分布區(qū)[2]，僅我國東北地區(qū)的松嫩平原鹽堿化土地面積就高達(dá)373.3萬hm2[3]。由于對大農(nóng)業(yè)和生態(tài)保護(hù)的觀念的缺乏，土地鹽堿化面積和鹽堿化程度逐年增加，堿脅迫會降低土壤滲透勢、使離子失衡、打亂生理過程、抑制植物生長、降低作物的質(zhì)量和產(chǎn)量。嚴(yán)重地區(qū)甚至?xí)?dǎo)致植物死亡，土壤鹽堿化成為限制作物產(chǎn)量的重要原因[4-5]。因此鹽堿地的改良和綜合開發(fā)利用已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)急需解決的難題[6]。因此，如何加強對鹽堿地農(nóng)業(yè)高效利用，提升我國耕地的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)能力水平，進(jìn)而對增加耕地數(shù)量，促進(jìn)國家糧食安全的保障等具有重要意義[7-8]。

蕓豆作為人類主要的食用豆類和松嫩平原重要的經(jīng)濟(jì)作物，減輕鹽堿脅迫對蕓豆生長的抑制，對滿足人們?nèi)找嬖鲩L的糧食需求，促進(jìn)鹽堿地區(qū)，尤其是松嫩平原農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前對于蕓豆的研究多為病害防治方面，關(guān)于鹽堿地對蕓豆產(chǎn)量的影響也鮮有報道[9]，除此之外對蕓豆的膜脂氧化程度的影響、可溶性糖和離子含量以及膜脂過氧化程度測定的分析未見報道。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽堿脅迫下，大豆Na+/K+含量隨脅迫強度增加而上升，鹽堿脅迫下稻米中的K+、Na+、Mg2+、Ca2+含量比非鹽堿脅迫下有顯著提高，但具有明顯的品種間差異[10-11]。在鹽堿脅迫條件下，隨著脅迫時間增加，大豆葉片和根系的丙二醛濃度呈上升趨勢[12]。李姝睿[13]研究表明：葉中的可溶性糖含量在受到50 mmol·L-1和100 mmol·L-1濃度NaCl脅迫時，隨鹽濃度增長而呈上升趨勢，而在175 mmol·L-1時出現(xiàn)下降趨勢。劉建新[14]研究發(fā)現(xiàn)：鹽堿混合脅迫下裸燕麥幼苗葉片游離氨基酸、脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量顯著提高，可溶性糖含量顯著降低。研究以耐鹽堿型蕓豆品種HYD為試驗材料，用NaCl和NaHCO3溶液設(shè)置了不同濃度梯度來模擬不同程度的鹽堿脅迫，模擬中性鹽和堿性鹽環(huán)境對蕓豆進(jìn)行不同時間段的鹽堿脅迫，以探討不同濃度的鹽堿脅迫對蕓豆幼苗葉片的脂質(zhì)過氧化程度、可溶性糖和離子含量的影響，為進(jìn)一步探究蕓豆抗鹽堿機(jī)制、選育耐鹽堿蕓豆品種提供理論依據(jù)，并為解決東北地區(qū)蕓豆鹽堿脅迫問題提供思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為試驗室前期從42份蕓豆品種中篩選出的耐鹽堿性較強的蕓豆品種“HYD”[15]，該品種為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 試驗設(shè)計

種子處理：選取大小一致、籽粒飽滿的自然風(fēng)干蕓豆種子，置于30%H2O2中表面消毒10 min，然后將消毒完的種子用無菌水漂洗5～6次，25℃浸種12 h。

培養(yǎng)條件：試驗于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院智能人工氣候生長室內(nèi)進(jìn)行，采用Hoagland營養(yǎng)液水培蕓豆幼苗至第一片復(fù)葉完全展開后加入Na-Cl和NaHCO3溶液脅迫的方法，來模擬鹽堿對蕓豆幼苗的脅迫。將處理好的種子擺入裝有蛭石的育苗盤中，在人工氣候生長室內(nèi)培養(yǎng)，設(shè)定光照強度為300μmol·m-2·s-1，光照周期（14/10）h（晝/夜），溫度（25/23）℃（晝/夜），和相對濕度50%～60%，并且每天用1/2Hoagland營養(yǎng)液（pH5.7）將其澆透。待種子萌發(fā)出現(xiàn)一對真葉時，選取整齊度一致的幼苗移栽到帶有圓孔的泡沫板上，在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，然后用正常的Hoagland營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，之后每隔2 d換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)期間要注意使用電動氣泵進(jìn)行24 h的持續(xù)通氣，以避免根系無氧呼吸，保證幼苗的良好生長。于蕓豆幼苗第一片復(fù)葉完全展開后進(jìn)行鹽堿脅迫處理。

脅迫條件：試驗設(shè)置0，50，100，150 mmol·L-1四個濃度梯度（其中濃度“0”作為對照處理），分別用NaCl和NaHCO3正常Hoagland營養(yǎng)液模擬鹽堿脅迫。用pH計測定脅迫液的pH值，NaCl脅迫組pH為5.7，6.57，6.66，6.79；NaHCO3脅 迫 組 的pH分 別 為5.7，8.26，8.49和8.73。

取樣部位：第一片完全展開的三出復(fù)葉。

取樣時間點：脅迫后0，24，96 h。

1.3 試驗方法

1.3.1 MDA含量的測定

MDA含量的測定參照《植物生理學(xué)試驗手冊》[16]。稱取0.5 g待測蕓豆幼苗葉片，加入5 mL 10%的三氯乙酸（TCA）在研缽中低溫研磨至勻漿狀態(tài)，放入離心機(jī)中，3 000 g下離心10 min。然后取上清液2 mL，并在其中加入2 mL硫代巴比妥酸（TBA），混和均勻后于沸水浴中加熱15 min，迅速冷卻后再次離心，取上清液分別在450，532，600 nm下比色測定吸光值。根據(jù)以下公式計算MDA濃度后進(jìn)一步算出蕓豆葉片中MDA含量：

1.3.2 可溶性糖含量測定

稱取0.5 g剪碎的樣品放入試管中，加入20 mL蒸餾水，在沸水浴中煮沸20 min，冷卻后過濾，將濾液無損的轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容至刻度搖勻。從中取1.0 mL于試管中，加入蒽酮試劑5 mL，輕搖混勻后再次進(jìn)行沸水浴時間10 min，冷卻后測定620 nm吸光值。用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 離子濃度的測定

將烘干至恒重的待測樣品進(jìn)行粉樣并過篩（0.25 mm），從中準(zhǔn)確稱取0.3 g放入消煮管中（注意盡量避免樣品粘附在管壁上），然后加入5 mL濃硫酸，搖勻后置于電爐上加熱。首先使用小火加熱，濃硫酸逐漸分解，待冒出大量白煙后再逐漸提高溫度。消煮管在溶液呈均勻的棕黑色時去下，等待片刻，將30%的H2O2在稍冷后滴加10滴（邊滴加邊不斷搖勻），再次置于電爐上加熱至微沸，消煮約5 min。然后再次將消煮管取下，重復(fù)上一步驟，稍冷后逐滴加入H2O2并繼續(xù)加熱。如此反復(fù)進(jìn)行數(shù)次，注意H2O2的用量逐漸減少，直到消化液變成無色透明清亮的液體時停止滴加H2O2。繼續(xù)加熱5 min，以去除消煮管內(nèi)殘余的H2O2。將消煮管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，并將消煮管反復(fù)用蒸餾水沖洗，沖洗體均無損地轉(zhuǎn)入容量瓶中，冷卻至室溫然后定容。最后以該溶液用原子吸收法測定蕓豆幼苗葉片中的Na+、K+含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫對蕓豆幼苗脂質(zhì)氧化程度的影響

如圖1所示，蕓豆幼苗葉片MDA含量隨著NaHCO3和NaCl脅迫的增加呈上升趨勢，相同處理時間兩種鹽脅迫差異顯著（P＜0.05），尤其高于50 mmol·L-1的處理濃度時，上限和下限更加明顯。當(dāng)溶液為150 mmol·L-1脅迫濃度條件時，與對照組相比，處理后24 h的MDA含量在NaCl和NaHCO3脅迫下分別增加59.47%和75.46%，處理后96 h分別增加70.80%和103.81%，兩種鹽溶液處理之間達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。表明堿性鹽脅迫較中性鹽對蕓豆幼苗的膜脂造成氧化損傷的程度更大。

2.2 鹽堿脅迫對可溶性糖含量的影響

由圖2可以看出，蕓豆幼苗葉片中的可溶性糖含量隨著脅迫濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且在處理（P<0.05）中達(dá)到顯著水平，在50 mmol·L-1較低濃度溶液處理時，可溶性糖含量顯著高于對照。NaHCO3脅迫下可溶性糖含量的變化范圍較NaCl脅迫高，隨著濃度的增加，增加量也會隨著增加但增長緩慢，可溶性糖含量在處理濃度為100 mmol·L-1時達(dá)到最大值。在脅迫后24 h的NaCl和NaHCO3脅迫相比對照分別升高了119.15%和207.19%；脅迫后96 h分別升高131.36%和142.74%。在150 mmol·L-1的脅迫濃度時，可溶性糖含量逐漸減少。從整體上分析可以看出，隨著處理濃度的遞增及脅迫時間的延長，可溶性糖含量變化表現(xiàn)為實驗組顯著高于對照組，且NaHCO3溶液脅迫下的變化范圍較NaCl溶液脅迫大。

圖2 兩種鹽脅迫對蕓豆幼苗可溶性糖含量的影響Fig.2 Effects of two kinds of salt stress on soluble sugar content of common bean seedlings

2.3 鹽堿脅迫對Na+含量的影響

蕓豆幼苗葉片中的Na+的濃度隨著NaCl和NaHCO3脅迫強度的增加呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢，150 mmol·L-1鹽溶液處理濃度時達(dá)到最高值，各處理之間（P＜0.05）差異達(dá)到顯著水平。NaCl和NaHCO3脅迫的Na+含量最大值在處理后24 h分別比對照高225.90%和289.04%；處理后96 h分別比對照高出201.60%和348.29%。在NaHCO3脅迫作用下觀察到的Na+累積量較NaCl脅迫更高，說明NaHCO3脅迫對蕓豆生長的不利影響更大。

2.4 鹽堿脅迫對K+含量的影響

由圖4可知，蕓豆幼苗葉片中的K+含量隨著Na－Cl和NaHCO3兩種鹽溶液脅迫濃度的增加而逐漸下降，即使在較低濃度（50 mmol·L-1）脅迫下也達(dá)到顯著水平（P＜0.05），在150 mmol·L-1的最低濃度下，與對照相比，脅迫后24 h NaCl和NaHCO3脅迫下蕓豆幼苗葉片中的K+最低含量分別減少19.58%和43.33%；脅迫后96 h分別降低31.30%和47.22%。在100 mmol·L-1處理濃度時，K+含量降低的表現(xiàn)得最明顯。在同一時間點，各濃度處理均表現(xiàn)為NaHCO3脅迫下蕓豆幼苗葉片中的K+低于NaCl脅迫。

圖3 兩種鹽脅迫對蕓豆幼苗Na+含量的影響Fig.3 Effects of two kinds of salt stress on Na+content of common bean seedlings

圖4 兩種鹽脅迫對蕓豆幼苗K+含量的影響Fig.4 Effects of two kinds of salt stress on K+content of common bean seedlings

2.5 鹽堿脅迫對K+/Na+的影響

由圖5可知，隨著處理濃度的增加兩種鹽脅迫下蕓豆幼苗葉片中的K+/Na+顯著降低（P＜0.05）。在脅迫后24 h，150 mmol·L-1NaCl和NaHCO3脅迫下處理組相比對照組分別下降75.32%和85.43%；脅迫后96 h分別下降77.22%和88.23%。在相同濃度下，碳酸氫鈉處理的K+/Na+處理少于NaCl。NaHCO3處理的KK+/Na+降低較多。

圖5 兩種鹽脅迫對蕓豆幼苗K+/Na+的影響Fig.5 Effects of two kinds of salt stress on K+/Na+content of common bean seedlings

3 討論

植物生活在鹽逆境中，最先接觸到鹽分并受到傷害的是細(xì)胞質(zhì)膜[17]，鹽脅迫會導(dǎo)致植物細(xì)胞膜脂過氧化和細(xì)胞膜間透性增大，因此會對植物細(xì)胞質(zhì)膜造成傷害。細(xì)胞內(nèi)大量的電解質(zhì)和一些小的有機(jī)分子會滲出。膜脂過氧化產(chǎn)物對植物防御系統(tǒng)的破壞再次加劇膜脂過氧化[18-19]，破壞了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)交換平衡，由于細(xì)胞脂膜的特殊性，所以在研究可溶性糖和離子含量的同時也對細(xì)胞脂膜這一指標(biāo)進(jìn)行了測定。研究中，蕓豆幼苗葉片MDA含量隨著NaCl和NaHCO3兩種鹽溶液脅迫的加重呈增加趨勢，且相同處理時間兩種鹽脅迫之間差異顯著，尤其是當(dāng)處理濃度高于50 mmol·L-1時，上升變化更為明顯，隨著處理時間的遞增MDA含量也逐漸遞增，處理時間為96 h時達(dá)到最大值，表明堿性鹽脅迫較中性鹽對蕓豆幼苗的膜脂造成氧化損傷的程度更大。

可溶性糖是植物生長和基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)劑。在植物的生命周期中起著重要的作用，并且也具有信號功能。在調(diào)節(jié)植物生長的同時，它可以與植物激素等其他信號形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，還可以為植物生長和發(fā)育提供能量和代謝中間體，隨著鹽堿濃度的增大，植物可溶性糖含量呈先增多后減少的趨勢[20]，耐鹽性強的在較高鹽堿濃度下可溶性糖含量仍顯著增加。檢測植物體內(nèi)的可溶性糖含量可以體現(xiàn)植物的生長發(fā)育情況。試驗中采用加入蒽酮試劑后再進(jìn)行沸水浴的方法測定620 nm處的吸光值繪制了可溶性糖含量的曲線，隨著脅迫濃度的增加，蕓豆幼苗葉片中可溶性糖含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并在各處理間達(dá)到顯著水平。在50 mmol·L-1較低濃度時，可溶性糖含量緩慢增加，且增加幅度隨著濃度的增加而增大。可溶性糖含量在100 mmol·L-1時達(dá)到最大值，脅迫處理24 h的可溶性糖含量顯著上升，且脅迫處理96 h后，可溶性糖含量仍持續(xù)增加。當(dāng)150 mmol·L-1鹽脅迫時，可溶性糖含量逐漸減少。從整體上分析可以看出，隨著兩種鹽溶液處理濃度的遞增和脅迫時間的延長，可溶性糖含量顯著升高，兩種鹽脅迫下NaHCO3的變化程度較NaCl大。

鹽脅迫嚴(yán)重影響著種子萌發(fā)和幼苗生長過程，蕓豆萌發(fā)期和幼苗期對鹽分的響應(yīng)反映了其適應(yīng)逆境的生態(tài)機(jī)制[21]。一般情況下，鹽脅迫下非鹽生植物的生長會受到抑制，鹽生植物則在一定濃度的鹽環(huán)境下可以正常生長，并且只有當(dāng)外界鹽濃度超過其生長最適鹽度時才會減緩其生長[22-24]，尤其是在缺Na+時其生活史不能完成[25]。所以Na+對植物生長具有刺激作用，導(dǎo)致Na+對植物生長刺激作用的主要因素是細(xì)胞伸展效應(yīng)和植物水分的平衡效應(yīng)。蕓豆幼苗葉片中的Na+的濃度隨著NaCl和NaHCO3脅迫強度的增加呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢，在150 mmol·L-1鹽濃度時達(dá)到最高，且兩種鹽處理間差異均達(dá)到顯著水平。

在植物的生長發(fā)育過程中不僅Na+對生物體的生理功能具有影響，K+對生物體的生理功能有一定的影響。K+是植物細(xì)胞中含量最豐富的陽離子之一，可促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)酶的活性，且K+是平衡電荷的主要陽離子，不同濃度的K+在細(xì)胞內(nèi)外分布可形成細(xì)胞跨膜電勢，促進(jìn)陰離子的長距離運輸，對生物體的生理功能具有一定的影響。蕓豆幼苗葉片中K+含量隨著NaCl和NaHCO3兩種鹽溶液脅迫濃度的增加而逐漸下降，在50 mmol·L-1較低濃度脅迫下達(dá)到顯著水平（P＜0.05），且在濃度為150 mmol·L-1時K+含量達(dá)到最低，在同一時間點，各濃度處理均表現(xiàn)為NaHCO3脅迫下蕓豆幼苗葉片中的K+低于NaCl脅迫。試驗結(jié)果表明隨著處理濃度的增加兩種鹽脅迫下蕓豆幼苗葉片中的K+/Na+顯著降低。在脅迫后24 h，150 mmol·L-1NaCl和NaHCO3脅迫下處理組相比對照組下降明顯，脅迫后96 h分別下降情況相同。在相同濃度下，NaHCO3處理的K+/Na+較NaCl處理更低。NaHCO3處理的K+/Na+降低更快。

4 結(jié)論

試驗在不同濃度的NaCl和NaHCO3脅迫下進(jìn)行，研究了蕓豆在不同時間和不同脅迫濃度下的膜脂氧化傷害程度、可溶性糖含量和離子含量。結(jié)果表明，膜脂造成氧化損傷的程度隨著兩種鹽溶液處理濃度的遞增和脅迫時間的延長而增大，堿性鹽脅迫較中性鹽對蕓豆幼苗的膜脂造成氧化損傷的程度更大。隨著兩種鹽溶液處理濃度的遞增和脅迫時間的延長，與對照相比，可溶性糖含量顯著增加，在NaHCO3脅迫作用下觀察到蕓豆幼苗葉片中的Na+累積量較NaCl脅迫更高，NaHCO3脅迫下蕓豆幼苗葉片中的K+低于NaCl脅迫，兩種鹽脅迫下蕓豆幼苗葉片中的K+/Na+變化相同，隨著脅迫濃度的增加而顯著降低。