添加酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛腸道菌群和短鏈脂肪酸含量的影響

何利娜，敖日格樂*，王純潔，斯木吉德，阿日查，崔銀雪，張 劍，劉 波，張 晨 (.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008；.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008)

酸馬奶也稱為馬奶酒，是以新鮮的馬奶為原料，經(jīng)過傳統(tǒng)發(fā)酵工藝而制成。酸馬奶作為一種有營(yíng)養(yǎng)的乳制品不僅口味獨(dú)特而且還有很多對(duì)人體有益的作用，所以一直以來(lái)都受到人們的青睞[1]。乳酸桿菌、非乳糖發(fā)酵酵母菌、乳糖發(fā)酵酵母菌是酸馬奶的主要微生物，研究表明，抗生素類物質(zhì)可以在酵母菌生長(zhǎng)代謝、繁殖過程中產(chǎn)生[2]。本試驗(yàn)所用乳酸桿菌菌懸液是采用蒙古族傳統(tǒng)酸馬奶發(fā)酵而成的，具有無(wú)污染、無(wú)毒、無(wú)殘留、安全高效等特點(diǎn)，它不僅能夠定植在動(dòng)物腸道形成保護(hù)層，起到很好的屏障作用，從而阻止病原菌侵入，維持胃腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的效果[3]。

新生犢牛具有以下特點(diǎn)：腸道發(fā)育不完全且微生物種類少，腸道內(nèi)產(chǎn)生較少的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFAs)[4]，因此其免疫力低容易感染發(fā)生疾病。有研究表明，幼齡動(dòng)物腸道健康發(fā)育受腸道微生物和SCFAs的影響[5]。益生菌定居在腸道，通過各種方式抑制腸道致病菌。大多數(shù)益生菌通過發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。通過增加產(chǎn)生短鏈脂肪酸的有益菌群，降低腸內(nèi)的酸堿度，并且抑制對(duì)酸性環(huán)境敏感微生物的生長(zhǎng)，從而降低腸道中病原微生物的含量[6]。然而，益生菌對(duì)腸道SCFAs含量的調(diào)節(jié)決定了這些功能的發(fā)揮[7]。在腸道中，有益菌如乳酸桿菌和雙歧桿菌屬通過發(fā)酵不可消化的糖，如膳食纖維、抗性淀粉和寡糖，以產(chǎn)生SCFAs[8]。反芻動(dòng)物腸道如牦牛腸道中的擬桿菌科(Bacteroidaceae)和普雷沃氏菌科(Paraprevotellaceae)等菌群可通過在腸內(nèi)代謝碳水化合物產(chǎn)生SCFAs[9]，小尾寒羊后腸段也富集大量能夠產(chǎn)生SCFAs的菌群[10]。上述腸道菌群代謝產(chǎn)生SCFAs，為免疫細(xì)胞提供能量，促進(jìn)黏蛋白的分泌，并防止病原菌在腸黏膜上的定植[11];其中丙酸和丁酸可增加抗菌肽的分泌并維持其黏膜屏障功能[12]。因此，SCFAs含量的變化已成為研究益生菌對(duì)腸道影響的重要指標(biāo)[13]。

為此，本試驗(yàn)擬研究犢牛早期干預(yù)酸馬奶源乳酸桿菌，是否對(duì)犢牛腸道菌群以及SCFAs含量有影響，假設(shè)通過添加酸馬奶源乳酸桿菌可以增加腸道有益菌的豐度以及SCFAs的含量進(jìn)而提高免疫力使其腸道健康發(fā)育，可為乳酸菌制劑在犢牛養(yǎng)殖的推廣應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組本試驗(yàn)于2020年10月在山西河灘奶牛場(chǎng)進(jìn)行，選擇生長(zhǎng)發(fā)育正常、體況及體質(zhì)量相似(36±3) kg的3日齡內(nèi)健康荷斯坦?fàn)倥?0頭作為研究對(duì)象。隨機(jī)分為4組，每組5頭，分別為正常組、腹瀉組、抗生素組和酸馬奶組。除正常組外，其他3組均要建立腹瀉模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具體分組及飼養(yǎng)方案如表1所示。

表1 犢牛分組及飼養(yǎng)方案

1.2 主要試劑營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MRS固體和液體培養(yǎng)基均購(gòu)自廣東環(huán)凱有限公司；SCFAs標(biāo)準(zhǔn)品，包括乙酸、丙酸和丁酸購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢有限公司；2-乙基丁酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)菌株及制備將內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牛生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室從奶牛腸道中分離鑒定的致病性E.coliO1，于20%(V/V)甘油內(nèi)-80℃保存，置于37℃水浴鍋水浴融化，接種到固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中37℃有氧培養(yǎng)24 h，挑單個(gè)菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯中搖床37℃培養(yǎng)24 h，制成菌懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

酸馬奶是從內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟阿巴嘎旗牧戶家采集，試驗(yàn)所添加酸馬奶源乳酸桿菌是從新鮮酸馬奶樣品中篩選出的乳酸桿菌，經(jīng)鑒定為L(zhǎng)actobacillus.P。將20%(V/V)的甘油中-80℃保存的乳酸桿菌Lactobacillus.P置于37℃水浴融化，再分別劃線接種到MRS固體培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種好的乳酸菌置于37℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，選出單個(gè)菌落分別接種到MRS液體培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)24 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定D600值來(lái)確定菌濃度，調(diào)整至試驗(yàn)所需濃度的菌懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品采集試驗(yàn)開始時(shí)，除正常組外，其他3組犢牛通過口服致病性E.coliO1菌懸液(2.5×1011CFU /mL,100 mL)來(lái)建立犢牛腹瀉模型。觀察犢牛腹瀉癥狀，在建立腹瀉模型3 d后，按照表1所示飼養(yǎng)方案進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期15 d。在試驗(yàn)15 d采集每頭牛的直腸糞樣，置于離心管，放入液氮罐，帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃冷凍保存。

1.5 犢牛腸道菌群的測(cè)定將試驗(yàn)15 d采集的糞便樣品于干冰保存送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司經(jīng)16S rDNA V34區(qū)擴(kuò)增測(cè)序。

1.6 犢牛腸道糞便SCFAs含量的測(cè)定樣品前處理：取0.5 g糞樣，置于10 mL離心管中，在離心管內(nèi)加入8 mL酸稀釋液(酸稀釋液：15 mL 100 mmol/L 2-乙基丁酸和50 mL 5 mmol/L鹽酸的混合液)，旋渦振蕩儀上混勻3 min，使糞樣與酸稀釋液充分混合，制成糞便混懸液。在4℃ 15 000 r/min離心20 min，離心后取1 mL上清，經(jīng)有機(jī)相0.22 μm 微孔過濾膜過濾后，置于進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)待檢。

標(biāo)準(zhǔn)品前處理：SCFAs的測(cè)定采用內(nèi)標(biāo)法，分別取標(biāo)準(zhǔn)品乙酸330 μL、丙酸400 μL、丁酸160 μL置于100 mL容量瓶?jī)?nèi)，將其混勻，用超純水定容，制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再在離心管中分別加混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.200，0.150，0.100，0.050，0.025 mL，再于對(duì)應(yīng)的離心管內(nèi)加超純水0.000，0.050，0.100，0.150，0.175 mL 配置成5個(gè)不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)液，用2-乙基丁酸作為內(nèi)標(biāo)，取200 μL置于各濃度標(biāo)準(zhǔn)液中，混勻，用氣-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。氣-質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定SCFAs程序設(shè)計(jì)如表2所示。

儀器自動(dòng)檢測(cè)并分析樣本數(shù)據(jù)，最后可得到相應(yīng)的樣本信息質(zhì)譜圖。將所得質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比即可知道質(zhì)譜圖中各峰所代表的物質(zhì)，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各物質(zhì)的含量。

表2 氣-質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定SCFAs程序設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 犢牛臨床癥狀變化除正常組外，其他3組口服致病性E.coliO1菌懸液12 h后均陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉癥狀。糞便呈水樣，由淺黃色逐漸變?yōu)榛野咨?，有惡臭味，并有眼球凹陷、食欲不振等現(xiàn)象。試驗(yàn)期間，與腹瀉組相比，抗生素組腹瀉情況有效改善。酸馬奶組犢牛添加酸馬奶源乳酸桿菌菌懸液后，不再出現(xiàn)腹瀉癥狀。

2.2 添加酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛腸道菌群的影響

2.2.1序列分析 基于序列的97%相似性(identity)進(jìn)行OTUs聚類，每組分別共得到：正常組340個(gè)、腹瀉組276個(gè)、抗生素組254個(gè)、酸馬奶組892個(gè)OTUs。其中每組特有的OTUs個(gè)數(shù)分別為正常組47個(gè)、腹瀉組13個(gè)、抗生素組8個(gè)、酸馬奶組567個(gè)(圖1)。

NCC.正常組糞便；ECC.腹瀉組糞便;CIPC.抗生素組糞便;MLPC.酸馬奶組糞便

2.2.2添加酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛直腸微生物α多樣性的影響 酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛直腸微生物α多樣性的影響如表3所示。4組樣品覆蓋率為99.88%～99.92%。酸馬奶組Sobs、Shannon、Ace 和Chao指數(shù)均顯著高于正常組、腹瀉組和抗生素組(P<0.05)，酸馬奶組Simpson指數(shù)低于正常組、腹瀉組和抗生素組，差異不顯著(P>0.05)。微生物豐富度與Ace 和Chao指數(shù)成正比。微生物多樣性與Shannon成正比，與Simpson指數(shù)成反比。說明酸馬奶組犢牛直腸微生物豐富度與多樣性顯著高于其他3組(P<0.05)。結(jié)果表明，酸馬奶源乳酸桿菌可以有效改善犢牛直腸微生物α多樣性。

表3 犢牛直腸內(nèi)容物α多樣性指數(shù)分析 %

2.2.3添加酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛直腸微生物門水平的影響 酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛直腸微生物門水平的影響如表4所示。與正常組相比，腹瀉組Firmicutes(厚壁菌門)的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，酸馬奶組顯著提高(P<0.05)，抗生素組Firmicutes(厚壁菌門)的相對(duì)豐度增加，但差異不顯著(P>0.05)。Fusobacteria(梭桿菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)的相對(duì)豐度，與正常組相比，腹瀉組顯著提高(P<0.05)，酸馬奶組與抗生素組降低，差異不顯著(P>0.05)。Proteobacteria(變形菌門)和Actinobacteria(放線菌門)的相對(duì)豐度4組間差異不顯著(P>0.05)，但與正常組相比，腹瀉組和抗生素組呈升高趨勢(shì)，酸馬奶組呈減少趨勢(shì)。結(jié)果表明，酸馬奶源乳酸桿菌干預(yù)后顯著提高了Firmicutes(厚壁菌門)的豐度，降低了Bacteroidetes(擬桿菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Fusobacteria(梭桿菌門)和Actinobacteria(放線菌門)的相對(duì)豐度，說明添加酸馬奶源乳酸桿菌可增加直腸內(nèi)容物中有益菌的豐度，降低有害菌的豐度。

表4 犢牛直腸微生物門水平豐度 %

2.2.4添加酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛直腸微生物科水平的影響 酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛直腸微生物科水平的影響如表5所示。與正常組相比，酸馬奶組Fusobacteriaceae(梭桿菌科)的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，Prevotellaceae(普雷沃菌科)的相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)。

表5 犢牛直腸微生物科水平豐度 %

2.2.5添加酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛直腸微生物屬水平的影響 酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛直腸微生物屬水平的影響如表6所示。與正常組相比，腹瀉組Fusobacterium(梭桿菌屬)的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)。與腹瀉組相比，抗生素組和酸馬奶組梭桿菌屬的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。酸馬奶組unidentified_Lachnospiraceae和Alloprevotella(擬普雷沃菌屬)的相對(duì)豐度顯著高于其他3組(P<0.05)。

表6 犢牛直腸微生物屬水平豐度 %

2.3 添加酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛糞便中SCFAs含量的影響由表7可知，與正常組相比，酸馬奶組乙酸、丙酸和丁酸含量顯著升高(P<0.05)，腹瀉組乙酸含量顯著降低(P<0.05)，丙酸和丁酸有減少趨勢(shì)，但差異不顯著。與酸馬奶組相比，抗生素組乙酸、丙酸和丁酸含量顯著降低(P<0.05)。說明添加酸馬奶源乳酸桿菌可顯著增加犢牛糞便中SCFAs含量。

表7 犢牛糞便中SCFAs含量 %

3 討論

3.1 添加酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛腸道菌群的影響幼齡動(dòng)物由于其免疫系統(tǒng)不發(fā)達(dá)[14]和缺乏免疫能力[15]，特別容易受到感染。越來(lái)越多的證據(jù)表明早期腸道微生物群的重要性，因?yàn)樗谒茉焖拗髅庖呦到y(tǒng)中發(fā)揮重要作用[16]，并對(duì)成年以后的腸道健康產(chǎn)生長(zhǎng)期影響[17]。據(jù)報(bào)道，在小鼠和人類嬰幼兒時(shí)期，抗生素對(duì)早期微生物群的干擾會(huì)對(duì)宿主免疫功能帶來(lái)長(zhǎng)期負(fù)面影響，包括免疫缺陷或?qū)Σ≡w定植的敏感性增加[18-19]。研究表明，宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化代謝、免疫功能和機(jī)體健康等方面都與腸道菌群有緊密聯(lián)系[20]，益生菌可以促進(jìn)腸道發(fā)育和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[7]。據(jù)報(bào)道，用干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)和其他益生菌治療奶牛乳腺炎，發(fā)現(xiàn)益生菌可以使腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變，抑制病原菌的感染，減輕奶牛乳腺炎的癥狀[21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，酸馬奶組犢牛腸道微生物豐富度與多樣性顯著高于其他3組。酸馬奶源乳酸桿菌干預(yù)后顯著提高了腸道內(nèi)厚壁菌門、普雷沃菌科、毛螺菌科未確定菌屬和擬普雷沃菌屬的相對(duì)豐度，降低了擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門、放線菌門的相對(duì)豐度。說明添加酸馬奶源乳酸桿菌后，犢牛腸道內(nèi)有益菌增多，有害菌減少。

3.2 添加酸馬奶源乳酸桿菌對(duì)犢牛糞便中SCFAs含量的影響SCFAs也稱作揮發(fā)性脂肪酸，是由1～6個(gè)碳原子組成的有機(jī)脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸及丁酸等。SCFAs可以讓腸黏膜細(xì)胞增殖能力變強(qiáng)，維持腸上皮細(xì)胞完整性；SCFAs在腸道免疫中有重要作用，宿主抗菌肽的分泌可以通過丙酸和乙酸調(diào)節(jié)，達(dá)到抗菌效果；SCFAs還有抗炎作用和抗腫瘤的作用。有研究顯示，SCFAs之所以能促進(jìn)犢牛胃腸道健康發(fā)育，是由于SCFAs可以對(duì)犢牛腸道微生物的定植產(chǎn)生影響，其可以使腸道黏膜屏障保持完整并可以提高腸道的抗炎能力[22]，進(jìn)而對(duì)犢牛的健康生長(zhǎng)產(chǎn)生積極的影響。腸道中SCFAs的含量可以反映腸道細(xì)菌的活性，也顯著影響腸道上皮細(xì)胞的代謝[23]。乙酸主要來(lái)自盲腸，被腸上皮吸收，然后進(jìn)入門靜脈，參與肌肉、脾臟、心臟和大腦的代謝。該途徑是動(dòng)物機(jī)體從小腸不能吸收的碳水化合物中獲取能量的重要途徑。丙酸不僅是肝臟代謝的能量來(lái)源，還能抑制膽固醇合成[24]。丁酸主要由厚壁菌門代謝產(chǎn)生，可以被結(jié)腸上皮細(xì)胞吸收和利用，也是結(jié)腸和盲腸的主要能量來(lái)源，對(duì)細(xì)胞分化和生長(zhǎng)有重要作用，能抑制腸上皮細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子[6]。丁酸鹽是通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[25]和維持腸上皮屏障[26]來(lái)維持腸道健康的主要SCFAs之一。因此，SCFAs能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，改善腸道功能，腸道健康與體內(nèi)SCFAs的含量密切相關(guān)。

據(jù)報(bào)道，飼喂從犢牛腸道分離的益生菌菌株減少了斷奶前犢牛腸道中致病性大腸桿菌的定植。在出生后第1周給新生犢牛施用雙歧桿菌和乳酸桿菌可以增加體質(zhì)量及其飼料轉(zhuǎn)化率，同時(shí)降低了腹瀉發(fā)生率[27]。這些影響在斷奶前的犢牛中比斷奶后的犢牛更明顯，這表明腸道建立微生物群落時(shí)，益生菌補(bǔ)充劑效果更佳，而當(dāng)微生物群落穩(wěn)定時(shí)，效果較差[28]。SCHNEIDER等[29]發(fā)現(xiàn)腸道疾病患者糞便中的丁酸含量低于健康人。將布拉氏酵母菌連續(xù)給藥6 d，發(fā)現(xiàn)患者糞便中丁酸含量顯著增加，總SCFAs含量也增加，可有效預(yù)防腹瀉的發(fā)生。SAKATA等[30]在豬飼料中添加了4種益生菌，飼喂豬一段時(shí)間后，測(cè)定盲腸內(nèi)容物中的SCFAs含量，結(jié)果表明SCFAs和乳酸含量顯著增加。本研究結(jié)果顯示給腹瀉犢牛日糧中添加酸馬奶源乳酸桿菌菌懸液可顯著增加犢牛糞便中乙酸、丙酸和丁酸的含量。推測(cè)其原因是因?yàn)槿占Z中添加酸馬奶源乳酸桿菌菌懸液促進(jìn)了犢牛腸道中乳酸菌的增殖，導(dǎo)致腸道中乳酸含量增加，為丁酸產(chǎn)生菌提供了底物來(lái)源，從而促進(jìn)了丁酸含量增加。而抗生素組中SCFAs濃度低于酸馬奶組，其原因可能是抗生素抑制了腸道內(nèi)產(chǎn)SCFAs菌和乳酸菌的增殖，從而使SCFAs含量降低。