噬菌體藥代動力學研究進展

于華波，張 亮，馮 超，遲 騰，齊艷玲，賈凱翔，張 洋，錢愛東，單曉楓，張 蕾 (吉林農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院/動物科學技術學院,吉林 長春 130118)

噬菌體于19世紀末被首次發(fā)現(xiàn)[1]，但由于當時對噬菌體生物學缺乏了解，再加上抗生素的出現(xiàn)及其對細菌良好的治療效果，導致噬菌體研究暫時被擱置。然而抗生素的濫用及各種耐藥細菌的出現(xiàn)使得研發(fā)新的抗生素替代品迫在眉睫，于是噬菌體重新出現(xiàn)在人們的視野中，成為治療細菌感染的新選擇。與常規(guī)抗生素和其他化學藥物相比，使用噬菌體治療細菌性感染具有很多治療優(yōu)勢，GOLKAR等[2]總結(jié)噬菌體的治療優(yōu)勢包括特異性強、只針對于宿主菌并且對其他細菌無害、與抗生素相比，噬菌體在治療過程中很少出現(xiàn)過敏反應、繼發(fā)感染及其他副作用、在宿主菌死亡后相應的噬菌體也會裂解，不會對環(huán)境造成污染、研制周期短、成本低、便于運輸和使用。藥代動力學是研究機體對藥物處置的動態(tài)變化，即包括藥物在機體內(nèi)的吸收、分布、生物轉(zhuǎn)化及排泄的過程，特別是血藥濃度隨時間而變化的規(guī)律。因此，現(xiàn)綜述噬菌體藥代動力學特征，并對比不同動物體內(nèi)藥代動力學參數(shù)，以期為噬菌體臨床治療、分析技術開發(fā)以及發(fā)展應用方面提供理論參考。

1 不同給藥途徑對噬菌體療效的影響

臨床上應用噬菌體治療細菌感染性疾病的給藥方式有許多種，不同的給藥方式對于噬菌體的治療效果有非常顯著地影響(圖 1)。

圖1 不同給藥途徑對小鼠體內(nèi)噬菌體滴度的影響

1.1 口服噬菌體口服噬菌體是臨床治療中是最常見的給藥途徑之一，其優(yōu)點是相對安全以及操作簡單，常用于靶向治療胃腸道細菌感染。EASWARAN等[3]通過試驗證明口服噬菌體pAh-1對于感染嗜水氣單胞菌的斑馬魚具有良好的治療效果，患病斑馬魚的存活率有了顯著提高。GALTIER等[4]發(fā)現(xiàn)口服噬菌體能夠減少小鼠腸道內(nèi)耐藥菌的數(shù)量。MAJEWSKA等[5]研究發(fā)現(xiàn)，口服T4噬菌體可以治療小鼠腸道大腸桿菌感染，而在治療后92 d 才出現(xiàn)耐噬菌體大腸桿菌。然而相對于其他給藥途徑，口服噬菌體在胃腸道轉(zhuǎn)運的效果較差。主要影響噬菌體胃腸道轉(zhuǎn)運的因素有以下2種：首先，大部分噬菌體對于pH敏感性很高，動物胃酸pH值小于3，這種酸性環(huán)境很容易抑制噬菌體的生長和增殖。對43株噬菌體pH偏嗜性進行統(tǒng)計(表1)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)噬菌體可生存在pH5～8之間，直接口服會造成噬菌體在酸性環(huán)境中活性降低，甚至失活；另一個影響噬菌體胃腸道轉(zhuǎn)運的因素是宿主的免疫反應。SMITH等[6]口服噬菌體治療小牛胃腸道大腸桿菌感染，在胃腸道中存在的某些特異性抗體導致腸道活性噬菌體大量減少，治療效果受到抑制。JOANNA等[5]通過對小鼠長期口腔飼喂T4噬菌體，并且檢測腸道、血液中抗體的含量,發(fā)現(xiàn)IgA含量增加，可以拮抗活性噬菌體在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)運。綜上，口服噬菌體對于胃腸道細菌感染有一定的治療效果，然而，受胃腸道pH值的影響，如果不能克服胃酸障礙，噬菌體的療效將會受到很大的影響。

1.2 局部應用噬菌體局部應用噬菌體是將噬菌體通過噴灑、涂抹等方式應用皮膚或黏膜等處。在臨床上，通常利用吸入、鼻內(nèi)和氣管內(nèi)給藥治療呼吸系統(tǒng)疾病。ANDRZEJ等[7]研究發(fā)現(xiàn)吸入、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)給藥對于噬菌體治療效果沒有顯著差異，都可以有效緩解小鼠肺部細菌感染。LIU等[8]通過超聲霧化吸入噬菌體D29的方式治療小鼠結(jié)核分枝桿菌感染，試驗組治療效果良好，肺部炎癥消失，并且噬菌體在肺部的停留時間達到72 h。除小鼠模型外，吸入噬菌體對于由銅綠假單胞菌引起的水貂出血性肺炎具有很好的治療作用。顧敬敏等[9]通過鼻內(nèi)給藥噬菌體YH30治療水貂出血性肺炎，顯著改善由出血性肺炎引起的肺部損傷，且感染水貂的存活率明顯升高，具有很大的潛力。同樣，噬菌體噴霧療法對于治療由大腸桿菌引起的雞呼吸道感染也有著可觀的治療效果[10-11]。

表1 噬菌體分類及其適合生長的pH范圍

1.3 注射噬菌體給藥注射噬菌體給藥途徑包括腹腔注射、肌肉注射、皮下注射以及靜脈注射，其特點是噬菌體可以通過血液循環(huán)到達機體幾乎所有器官和組織。研究表明，注射噬菌體的給藥效果明顯優(yōu)于其他給藥途徑。在注射噬菌體后，通常1 h內(nèi)就可以在小鼠血液循環(huán)中檢測到活性噬菌體。HUFF等[12]比較霧化噴霧劑和肌內(nèi)注射噬菌體治療鳥大腸桿菌感染的治療效果，在肌內(nèi)注射噬菌體后鳥的存活率以及血液內(nèi)噬菌體的含量都遠遠高于吸入噬菌體給藥。MATSUZAKI等[13]發(fā)現(xiàn)，腹腔注射純化的噬菌體phi MR11(MOI≥0.1)可以有效抑制由耐藥性金黃色葡萄球菌引起的小鼠敗血癥，且腹腔注射噬菌體1 h后，小鼠血液中的噬菌體滴度較低，但在6 h后急速增加。研究人員對這種現(xiàn)象的解釋是細菌最初結(jié)合了原本體內(nèi)存在的自由噬菌體，從而阻止了phi MR11在整個系統(tǒng)中的快速傳播。而6 h后，噬菌體phi MR11隨著細菌的擴增而逐漸增多，其在血液中的效價也隨之增加。JIA等[14]和張洋等[15]發(fā)現(xiàn)通過腹腔注射噬菌體可以有效保護鯽魚，從而減少嗜水氣單胞菌對鯽魚的侵害，提高了鯽魚存活率。噬菌體通過注射給藥方式最容易克服身體防御屏障，已被證明是噬菌體遞送最有效途徑。

表2 針對不同動物應用噬菌體治療的給藥途徑

2 噬菌體在機體內(nèi)的循環(huán)

進入血液循環(huán)中的噬菌體的濃度很大程度上與噬菌體給藥劑量有關。由于噬菌體在進入機體循環(huán)過程中會被體液稀釋，所以這種計量依賴性關系與實驗動物的體積和血容量有關。然而早在1957年科學家們就發(fā)現(xiàn)，靜脈注射噬菌體2.5 min后，兔血液中的實際噬菌體濃度比根據(jù)噬菌體劑量在血容量中計算出的假定滴度低100倍左右[1]。KRYSTYNA等[16]通過計算，得出小鼠經(jīng)靜脈注射噬菌體1～5 min內(nèi)，噬菌體滴度應該為0.4，0.5 h后為0.068。但在實際試驗中發(fā)現(xiàn)靜脈注射噬菌體1～5 min后，血液中噬菌體的滴度值為0.02，而注射0.5 h后的滴度值約為0.003。研究發(fā)現(xiàn)噬菌體實際滴度值明顯低于假設值，這是由于當噬菌體進入體循環(huán)時，不僅會被血液稀釋，還可以被單核吞噬細胞捕獲或過濾。

肝臟和脾臟是噬菌體聚集的主要場所，相比于血液，肝臟、脾臟中所含噬菌體的效價相對較高，并且停留時間相對較長[17-18]。噬菌體經(jīng)全身循環(huán)后，可在幾分鐘內(nèi)到達脾臟和肝臟，并在1～3 h內(nèi)達到相對較高的滴度[19]。脾臟是檢測到活性噬菌體存在時間最長的器官，甚至在給藥后多日仍能檢測到噬菌體的存在。INCHLEY等[20]發(fā)現(xiàn)，通過靜脈注射，在小鼠肝臟和脾臟中都能檢測到噬菌體，但噬菌體在肝臟中的滴度下降更快。推測是肝臟中存在枯否氏細胞能夠迅速地捕獲和吞噬噬菌體從而使噬菌體滴度下降。

腎臟在許多藥物的清除中起著重要作用，主要反映藥物排入尿液的情況。體外研究表明，噬菌體在人和動物的尿液中都能穩(wěn)定存在。然而由于個體差異，研究人員并非在所有動物或人類的腎臟或尿液中都能檢測到活的噬菌體。噬菌體在尿液中的滴度甚至比在血液中還要低幾個數(shù)量級，且在腎臟中的滴度也遠遠低于肝臟和脾臟。

噬菌體也可以穿透血腦屏障治療由某些敏感菌引起的腦內(nèi)感染。研究人員將不同形態(tài)的噬菌體(肌尾、長尾、短尾)注入血液，在動物大腦中發(fā)現(xiàn)了活躍的噬菌體。MLLER等[21]證明噬菌體可以治療腦內(nèi)的大腸桿菌感染，通過治療，在感染細菌的動物大腦內(nèi)，噬菌體的滴度逐漸增高，表明噬菌體在大腦中能有效增殖。影響噬菌體進入大腦的主要因素包括劑量、噬菌體的形態(tài)和給藥途徑[22-23]。FRENKEL等[24]通過研究發(fā)現(xiàn)當小鼠發(fā)生腦內(nèi)感染時，通過鼻內(nèi)注入的絲狀噬菌體能夠有效進入小鼠大腦。然而對同一噬菌體進行化學誘導使其從絲狀變?yōu)榍驙?，采用相同的給藥途徑時發(fā)現(xiàn)噬菌體不能進入大腦。

另外，經(jīng)全身循環(huán)后能夠檢測到噬菌體的器官還有骨骼肌、心臟、胸腺、骨髓和膀胱(圖2)。雖然這些器官不能聚集噬菌體，但噬菌體可以到達這些器官從而有效地控制這些器官發(fā)生感染。

圖2 噬菌體在不同組織器官中的含量

3 影響噬菌體在體內(nèi)清除的因素

影響噬菌體在體內(nèi)清除速率因素一方面在于噬菌體本身，包括給藥劑量、噬菌體顆粒大小以及噬菌體的修飾和包裝，另一方面在于機體的免疫系統(tǒng)對噬菌體清除速率。MICROBIOLOGICA等[25]對比T2噬菌體(肌尾病毒科，90 nm× 200 nm)與phiX174噬菌體(微病毒科，頭部直徑30 nm)在乳豬體內(nèi)清除速率發(fā)現(xiàn)，T2噬菌體在機體內(nèi)的清除速率比phiX174噬菌體快，表明在體內(nèi)體積大的噬菌體顆粒比小的噬菌體更容易被過濾掉。噬菌體的包裝和修飾也可以顯著改變噬菌體的藥代動力學。COLOM等[26]利用海藻酸鈉/CaCO3膠囊包裝噬菌體以避免其活性被胃液強酸環(huán)境破壞。海藻酸鈉/CaCO3膠囊包裝確保了噬菌體在腸道存活的時間。此外，小尺寸膠囊(125～150 μm)也方便噬菌體口服給藥。SALONI等[27]通過試驗發(fā)現(xiàn)，噬菌體經(jīng)過納米脂質(zhì)體包裝，可以有效降低體內(nèi)酸堿、離子因素對其活性的影響，也可以降低免疫系統(tǒng)對噬菌體的識別，對預防由肺炎克雷伯菌引起的小鼠大葉性肺炎有很大潛力。對比發(fā)現(xiàn)，采用脂質(zhì)體包裝的噬菌體在肺炎克雷伯菌感染后3 d內(nèi)都能提供有效保護，而非脂質(zhì)體包裝的噬菌體有效時間只有24 h。

免疫系統(tǒng)在噬菌體清除過程中起到關鍵作用，即使沒有產(chǎn)生針對噬菌體的特異性抗體，固有免疫系統(tǒng)也會清除外源性噬菌體顆粒。吞噬細胞在體內(nèi)循環(huán)，同時也大量存在于脾臟和肝臟中，該細胞捕獲吞噬噬菌體，已被證明是體內(nèi)主要的“噬菌體陷阱”。KATARZYNA等[28]研究發(fā)現(xiàn)在細菌感染期間，固有免疫會得到增強，研究人員利用綠色熒光標記的噬菌體，檢測巨噬細胞對噬菌體的吞噬作用，結(jié)果在巨噬細胞中檢測到大量噬菌體，表明巨噬細胞對噬菌體有吞噬作用。吞噬細胞除了可使噬菌體直接失活外，也是抗原提呈細胞處理和提呈噬菌體抗原的第一步。針對機體產(chǎn)生噬菌體特異性抗體的研究非常廣泛，在大多數(shù)情況下，噬菌體特異性抗體降低了體循環(huán)中活性噬菌體的濃度，然而，并非在所有試驗中都會觀察到預期的抗體形成或噬菌體具有控制細菌感染的能力。DENOU等[29]、JING等[30]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠口服或靜脈注射噬菌體，在治療結(jié)束后3周才檢測到特異性抗體的存在。小鼠口服高劑量T4噬菌體才可以刺激機體產(chǎn)生特異性抗體。

研究表明，外來噬菌體不會影響機體腸道菌群的豐度。程夢珺等[31]通過研究發(fā)現(xiàn)，在應用噬菌體治療由屎腸球菌引起的小鼠腸道感染時，噬菌體可以緩解腸道菌群不平衡，使腸道內(nèi)菌群恢復到正常值。當應用大劑量噬菌體進行治療時，雖然會對腸道菌群造成短時間的失衡，但是在治療過后對試驗小鼠的健康和體質(zhì)量不會造成影響。RASMUSSEN等[32]總結(jié)得出，噬菌體群落在不同機體的腸道存在是高度穩(wěn)定的，外來噬菌體很難在腸道中定植從而影響腸道菌群的豐度，所以在應用外源噬菌體治療時，外源噬菌體對腸道菌群的影響微乎其微。噬菌體可以將腸道上皮細胞當作轉(zhuǎn)運的介質(zhì)，從而達到進入機體的目的。NGUYEN等[33]通過研究發(fā)現(xiàn)腸道上皮細胞可以吸收并轉(zhuǎn)運噬菌體，從而使噬菌體得以進入機體的其他組織器官。

4 總結(jié)

噬菌體對細菌裂解具有特異性，不會殺死真核細胞，也不會破壞機體的正常菌群，其不僅是一種具有應用潛力的新概念藥物，在開發(fā)新型疫苗方面也具有很大潛力[34-35]。本文從噬菌體的給藥方式、體內(nèi)分布以及體內(nèi)清除等方面，總結(jié)了噬菌體在機體內(nèi)的藥代動力學特征。目前階段對于噬菌體藥代動力學的檢測方法主要包括涂板法、同位素標記示蹤法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[36]，尚未形成一套系統(tǒng)、準確的檢測方法，這是制約噬菌體藥代動力學參數(shù)準確性的一個方面。另一方面，目前階段對于噬菌體藥代動力學的研究主要集中在哺乳動物尤其是小鼠，禽類則大多數(shù)是圍繞著雞來進行，水生生物只有14例是研究魚類噬菌體治療的特點，尚未有關于爬行動物和兩棲類動物的研究。且不同物種、不同性別、年齡的個體即便用同一種給藥方式，噬菌體藥代動力學參數(shù)都會不同，因此急需更多相關研究，為噬菌體在臨床應用提供更多的幫助。綜上所述，在對噬菌體藥代動力學研究的動物樣本進行分析時，應制定一套系統(tǒng)準確的檢測方法，以獲得噬菌體在不同動物體內(nèi)吸收、分布、代謝排泄的全面信息，為噬菌體藥物在今后的研發(fā)和臨床應用提供更多的理論依據(jù)。