癲癇清顆粒調(diào)控Sigma 1受體抑制阿爾茨海默病模型小鼠炎癥小體研究

楊彩瑜 李熒 齊越 明彩榮 董笑博 賈冬

[摘要] 目的 研究癲癇清顆粒是否通過調(diào)控Sigma 1受體的表達(dá)，抑制阿爾茨海默?。ˋD）模型小鼠炎癥小體的活性。 方法 將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、鹽酸多奈哌齊組、癲癇清顆粒組、Sigma 1受體拮抗劑（BD1047）組和BD1047+癲癇清顆粒組。除假手術(shù)組外，其余各組小鼠的左側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射淀粉樣蛋白（Aβ25-35）制作AD小鼠模型，連續(xù)給藥21 d，每日1次。第16天至第21天，Morris水迷宮試驗(yàn)檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，第22天，各組小鼠取材，HE染色觀察腦組織病理學(xué)變化，免疫組化法及免疫印跡法檢測核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1（NLRP1）、胱冬肽酶-1（caspase-1）的表達(dá)，免疫熒光法檢測Sigma 1受體的表達(dá)。 結(jié)果 與模型組相比，癲癇清顆粒組可減少AD模型小鼠的游泳總路程，降低海馬中NLRP1的表達(dá)，抑制caspase-1活性，增加Sigma 1受體表達(dá)。BD1047組與BD1047+癲癇清顆粒組小鼠中的游泳總路程與模型組小鼠相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），NLRP1和caspase-1的蛋白表達(dá)水平升高，Sigma 1受體的表達(dá)降低。 結(jié)論 癲癇清顆?？赏ㄟ^激活Sigma 1受體減少NLRP1表達(dá)，并抑制caspase-1活性，從而提高AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

[關(guān)鍵詞] 癲癇清顆粒;阿爾茨海默病;炎癥小體;Sigma1受體

[中圖分類號(hào)] R749.16? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）02-0029-05

Inhibitory effect of Dianxianqing Granule on inflammasome of Alzheimer's disease model mice by regulating Sigma 1 receptor

YANG Caiyu1? ?LI Ying1? ?QI Yue1， 2? ?MING Cairong1? ?DONG Xiaobo1? ?JIA Dong2

1.Graduate School of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang? ?110847， China; 2.The Second Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang? ?110034， China

[Abstract] Objective To study whether Dianxianqing Granule inhibit the activity of inflammasome in Alzheimer's disease （AD） model mice by regulating the expression of Sigma 1 receptor. Methods The mice were randomly divided into sham operation group， model group， donepezil hydrochloride group， Dianxianqing Granule group， Sigma1 receptor antagonist （BD1047） group， BD1047+Dianxianqing Granule group. Excepted for the sham group， the AD mouse model was made by injecting amyloid （Aβ25-35） into the left lateral ventricle of mice in the other groups once daily for 21 consecutive days. From Day 16 to Day 21， the learning and memory ability of the mice was detected by the Morris water maze. On Day 22， the mice in each group were sampled. The histopathological changes were observed by HE staining. The expression of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1 （NLRP1） and caspase-1 was detected by immunohistochemistry and immunoblotting. The expression of the Sigma 1 receptor was detected by immunofluorescence assay. Results Compared with the model group， the Dianxianqing Granule group could reduce the total swimming distance， decrease the expression of NLRP1， inhibit caspase-1 activity and increase Sigma 1 receptor expression in the hippocampus of AD model mice. There were no statistically significant differences in the total swimming distance among the BD1047 group， the BD1047+Dianxianqing Granule group， and the model group（P>0.05）. The protein expression levels of NLRP1 and caspase-1 in the BD1047 group and the BD1047+Dianxianqing Granule group were increased， and the expression of the Sigma 1 receptor was decreased. Conclusion Dianxianqing Granule can reduce NLRP1 expression and inhibit caspase-1 activity by activating the Sigma 1 receptor， thereby improving learning and memory function in AD model mice.

[Key words] Dianxianqing Granule; Alzheimer's disease; Inflammasome; Sigma 1 receptor

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）為常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，具體表現(xiàn)在學(xué)習(xí)記憶力的減退及認(rèn)知功能損害等，除了β淀粉樣蛋白（amyloid，Aβ）作為AD的主要病理特征外，近些年，學(xué)者們在研究AD發(fā)病機(jī)制的過程中普遍關(guān)注到，炎癥小體產(chǎn)生的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是AD較為主要的病理變化特征[1]。大量研究可以發(fā)現(xiàn)，抑制炎癥小體的活化可減輕AD小鼠腦組織中β淀粉樣蛋白的沉積[2]，改善學(xué)習(xí)記憶能力[3]。

Sigma 1受體（σ1R）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在廣泛，多位于神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，是一種具有配體選擇性分子伴侶。AD患者σ1R表達(dá)減少，炎癥小體激活，并與學(xué)習(xí)記憶障礙密切相關(guān)。癲癇清顆粒為一種專利藥（專利號(hào)：ZL 2011 1 0069494），具有熄風(fēng)豁痰、通暢血脈、消散瘀滯、改善智力等療效。前期研究表明，癲癇清顆?？赏ㄟ^σ1R改善學(xué)習(xí)記憶能力，但是否與炎癥小體有關(guān)，則尚不清楚。因此，本研究利用Aβ25-35誘導(dǎo)AD小鼠模型，并使用癲癇清顆粒和σ1R拮抗劑進(jìn)行干預(yù)，觀察癲癇清顆粒是否通過抑制炎癥小體的活性改善AD，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 動(dòng)物? 選用SPF級(jí)ICR雄性小鼠[1]（動(dòng)物倫理審批號(hào)：SYYXY2020082702），共96只，體重為25～30 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號(hào)為SYXK（遼）2013-0009。

1.1.2 藥物和試劑? ①癲癇清顆粒：由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供，藥品批號(hào)為20140110，規(guī)格：每克顆粒含有生藥含量為5.31 g，劑型：顆粒劑，劑量：24 g/d、療程：3個(gè)月;②鹽酸多奈哌齊片：由衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司提供，藥品批號(hào)140 606 A，規(guī)格：5 mg/片，劑型：片劑，劑量：10 mg/d，療程：1個(gè)月;③Aβ25-35：來源于美國Sigma公司，貨號(hào);A4559;④核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1（NLRP1）抗體：由proteintech公司提供，貨號(hào)：00065275;⑤胱冬肽酶-1（caspase-1）抗體：由北京Bioss生物技術(shù)有限公司提供，貨號(hào)：AH11274428;⑥小鼠/兔IgG-免疫組化試劑盒：由BOSTER生物工程有限公司提供，貨號(hào)：15I11BD22;⑦BD1047：由TOCRIS公司提供，貨號(hào)：138356-21-5;⑧山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記：由北京ZSGB-BIO生物技術(shù)有限公司提供，貨號(hào)：ZB-2301，批號(hào)：141987;⑨Sigma受體蛋白抗體（Anti-OPRS1）：由北京Bioss生物技術(shù)有限公司提供，貨號(hào)：bs-5111R;⑩Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG：由北京Bioss生物技術(shù)有限公司提供，貨號(hào)：bs-0295G-Cy3。

1.1.3 儀器? DW-200型號(hào)腦立體定位儀（成都泰盟科技公司）;10 μl微量進(jìn)樣器（上海高鴿微量進(jìn)樣器廠）;MT-200型號(hào)Morris水迷宮（成都泰盟科技公司）;Y迷宮（遼寧中醫(yī)康復(fù)中心自制）。

1.2 方法

1.2.1 分組? 96只小鼠于沈陽醫(yī)學(xué)院適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，按照隨機(jī)體重對照表將小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、BD1047組、鹽酸多奈哌齊組、癲癇清顆粒組、BD1047+癲癇清顆粒組，每組小鼠各16只。

1.2.2 造模? 350 mg/kg的水合氯醛麻醉小鼠后，固定，消毒。手術(shù)刀切開頭部皮膚，快速找到囟門位置，以囟門為零點(diǎn)，向右移動(dòng)1 mm，后移動(dòng)0.5 mm，垂直深度為3 mm。于5 min內(nèi)緩慢注入3 μl老化的Aβ25-35（1 mg Aβ25-35溶解到940 μl生理鹽水中，37℃孵育120 h）。取適量青霉素鈉粉末涂抹于傷口，小鼠放回籠中。

1.2.3 給藥? AD模型制備后的第2天，各組小鼠按照組別分別灌胃給予相應(yīng)的藥物，癲癇清顆粒組（12.48 g/kg，按生藥量計(jì)，每克顆粒含有5.31 g生藥），鹽酸多奈哌齊組（1.3 mg/kg），小鼠的給藥劑量為20 ml/kg，同時(shí)，BD1047組腹腔注射給藥，劑量為1 mg/kg。灌胃及腹腔注射給藥均為21 d，每天1次。各組小鼠均無死亡且狀態(tài)良好。假手術(shù)組和模型組同時(shí)給予等體積蒸餾水進(jìn)行灌胃，BD1047組和BD1047+癲癇清顆粒組腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)? 灌胃給藥第16天，各組小鼠開始Morris 水迷宮行為學(xué)考察實(shí)驗(yàn)。Morris 水迷宮為圓筒狀，底部直徑80 mm左右、高 33 cm左右，頂部開口，將圓筒劃分為4個(gè)象限中，并在桶壁上對4個(gè)象限區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記。把平臺(tái)放置在第一象限固定的位置。圓筒內(nèi)水溫保持在24～27℃，平臺(tái)放置的位置應(yīng)在水面1 cm以下。在實(shí)驗(yàn)過程中，記錄小鼠從進(jìn)入水中到成功登臺(tái)的總距離。每只小鼠每天需要進(jìn)行兩次測試，每兩次中間間隔的時(shí)間 3～4 h，不間斷進(jìn)行 5 d。

1.3.2 HE染色? 第22天，每組取6只小鼠，用4%的多聚甲醛將其腦組織固定，脫蠟脫水，將切片厚度切至為4～5 μm，用常規(guī)方法對切片進(jìn)行HE染色。

1.3.3 免疫組化檢測NLRP1、caspase-1及免疫熒光檢測σ1R表達(dá)? 第22天，每組隨機(jī)選6只小鼠進(jìn)行免疫組化檢測。5 μm的石蠟切片逐步進(jìn)行脫蠟直至水化，經(jīng)過3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化酶后，高壓方式進(jìn)行抗原決定簇的暴露，封閉液封閉，加入適當(dāng)濃度的一抗，4℃孵育過夜。PBS沖洗，免疫熒光實(shí)驗(yàn)加入相應(yīng)的熒光二抗;免疫組化實(shí)驗(yàn)加入生物素化二抗后，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進(jìn)行染色，陽性結(jié)果表現(xiàn)為沉淀于細(xì)胞內(nèi)棕黃色的顆粒，各組陽性細(xì)胞平均光密度值采用JEOA801D形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3.4 Western blot檢測NLRP1 及caspase-1表達(dá)? 第22天，每組取 4只小鼠快速斷頭，冰上分離出海馬，稱定質(zhì)量。海馬經(jīng)蛋白裂解液裂取后提取出總蛋白，BSA法測定出小鼠海馬組織中的蛋白濃度，灌制10%的凝膠進(jìn)行電泳，100 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2 h，5%的脫脂牛奶封閉，相應(yīng)濃度的一抗孵育后，4℃放置過夜。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（TBST）洗滌后加入對應(yīng)的二抗孵育，再次洗滌后加入特超敏 ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察相關(guān)蛋白的表達(dá)。Imaje J圖像分析軟件對目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)的組內(nèi)不同時(shí)間比較，采用單因素重復(fù)測量方差分析;不同時(shí)間的組間比較采用多變量方差分析;組間指標(biāo)變化趨勢比較及組別與時(shí)間交互作用分析采用雙因素重復(fù)測量方差分析。其余實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)雙因素重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，組間F組別=98.613，P<0.001;時(shí)間F時(shí)間=96.522，P<0.001;交互作用F組別×?xí)r間=13.466，P<0.001，時(shí)間和組別有交互作用。見表1。

2.2 HE染色結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，可見細(xì)胞水腫，細(xì)胞核淡染，核固縮。與模型組相比，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列有序，錐體細(xì)胞排列緊密，神經(jīng)元細(xì)胞層數(shù)增加，部分神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)突觸出現(xiàn)恢復(fù)。BD1047組及BD1047+癲癇清顆粒12.48 mg/kg組可見神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少，排列疏松，核固縮較明顯。見封三圖1。

2.3 NLRP1和caspase-1免疫組化染色結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠海馬區(qū)域NLRP1和caspase-1表達(dá)明顯增多;與模型組相比，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組海馬區(qū)域NLRP1和caspase-1陽性表達(dá)顯著降低;BD1047組和BD1047+癲癇清顆粒組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見封三圖2～3、表2。

2.4 σ1R表達(dá)結(jié)果

模型組小鼠海馬區(qū)σ1R表達(dá)下降;與模型組相比，癲癇清顆粒組小鼠海馬區(qū)域σ1R表達(dá)明顯增加，BD1047組明顯降低，BD1047+癲癇清顆粒組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見封三圖4。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠海馬NLRP1與caspase-1的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，鹽酸多奈哌齊（1.3 mg/kg）組和癲癇清顆粒組小鼠腦內(nèi)NLRP1與caspase-1表達(dá)明顯降低，BD1047組明顯升高，BD1047+癲癇清顆粒組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1、表3。

3 討論

AD是一種破壞性神經(jīng)退行性疾病，其特征在于神經(jīng)元細(xì)胞的死亡和進(jìn)行性癡呆的發(fā)生。目前的研究普遍認(rèn)為，神經(jīng)元細(xì)胞外Aβ的沉積和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成是AD發(fā)病的主要機(jī)制，但導(dǎo)致神經(jīng)元功能異常的具體機(jī)制則尚不清楚。Martinon等[6]于2002年首次報(bào)道炎癥小體后，炎癥小體在AD中的作用引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。組成炎癥小體的受體蛋白大部分來自Nod樣受體家族，包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、NLRP7和NLRP12。其中NLRP1是首個(gè)報(bào)道的炎癥小體。NLRP1在機(jī)體內(nèi)的功能主要涉及細(xì)胞程序性死亡、慢性炎癥和免疫應(yīng)答反應(yīng)等多方面，是機(jī)體內(nèi)慢性炎癥的主要參與者[7-10]，并與AD神經(jīng)元功能異常密切相關(guān)。NLRP1為在細(xì)胞中表達(dá)的多蛋白復(fù)合物，由細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體及caspase-1前體蛋白組裝而成，受外源物質(zhì)刺激后，組裝后的炎癥小體可促使NLRP1發(fā)生自身寡聚化，激活 caspase-1，引發(fā)炎癥反應(yīng)[4];因此，抑制炎癥小體的活化可改善AD神經(jīng)元細(xì)胞的功能異常，進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶障礙。在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)，NLRP1活化后，可形成NLRP1-caspase-1級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路，加速學(xué)習(xí)記憶損害[11-12]，使用NLRP1炎癥小體抑制劑則具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的作用[2，3，13]。本研究結(jié)果表明，癲癇清顆?？山档秃ｑR中NLRP1的表達(dá)，抑制caspase-1活性，增加神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量，減少AD模型小鼠的游泳總路程，具有改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。

σR最初歸類于阿片類受體的亞型，因其不能與阿片受體拮抗劑（如納洛酮）結(jié)合，這種觀點(diǎn)隨后得到了修正。隨著科學(xué)家們對σR受體的深入研究，人們對σR受體有了全新的認(rèn)識(shí)和理解。σR存在兩種亞型：σ1R和σ2R。其中，σ1R有223個(gè)氨基酸，分子量為25.3 kDa，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個(gè)區(qū)域的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，在細(xì)胞中分布于核膜、線粒體膜和質(zhì)膜區(qū)域，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)富集。σ1R參與調(diào)節(jié)與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制，具有延緩記憶減退、神經(jīng)保護(hù)與再生的作用，近年來得到了廣泛關(guān)注。研究人員使用SA4503正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)對AD患者腦中的σ1R定位發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，AD患者腦內(nèi)σ1R密度顯著降低，激活σ1R則可改善學(xué)習(xí)記憶障礙[3]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因AD模型鼠腦中σ1R表達(dá)下降[16-17]，神經(jīng)元損傷，學(xué)習(xí)記憶功能障礙。σ1R作為一種具有配體選擇性的分子伴侶，可通過NF-κB途徑，誘導(dǎo)NLRP1活化[15]。由此可推測，增加σ1R的表達(dá)，可抑制NLRP1活化，保護(hù)神經(jīng)元，改善學(xué)習(xí)記憶能力。在本研究給予AD模型小鼠σ1R拮抗劑BD1047后發(fā)現(xiàn)，BD1047組中NLRP1與caspase-1表達(dá)增強(qiáng)，說明σ1R與AD模型中NLRP1炎癥小體活性有關(guān)。給予癲癇清顆粒后，σ1R表達(dá)增加，NLRP1與caspase-1活性降低，說明癲癇清顆?？赏ㄟ^σ1R抑制AD模型小鼠中的炎癥小體的活性，保護(hù)神經(jīng)元，改善其學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)揮抗AD作用。

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（收稿日期：2021-05-25）