傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白SopE對晚期沙門菌液泡穩(wěn)定性的影響

翁軼瑋，劉秀雯，石書娟，李澤宇，張盈，黃新祥

江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

傷寒沙門菌(Salmonellatyphi，S.typhi)是一種革蘭氏陰性短桿菌，也是一種食源性致病菌。人們攝入被其污染的食物和水后可能會被感染，出現(xiàn)以高熱、全身疼痛、皮膚玫瑰疹、菌血癥、腸道穿孔等為主要癥狀的傷寒熱，若未經(jīng)及時治療，則致死率較高[1]。人類是傷寒沙門菌的唯一宿主，感染病例遍布全球，尤以發(fā)展中國家最為嚴重，全球每年約有20萬人因感染傷寒沙門菌而死亡[1]。

Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)是傷寒沙門菌的重要毒力因子之一。T3SS1分泌的效應(yīng)蛋白有助于傷寒沙門菌侵入腸道上皮細胞，隨后被單核-巨噬細胞等吞噬性細胞攝取，在細胞內(nèi)的囊泡中生存和繁殖，該囊泡被稱為沙門菌液泡(Salmonella-containing vacuole，SCV)[2]。T3SS分泌的效應(yīng)蛋白對SCV的影響體現(xiàn)在以下兩方面：① T3SS是一種“針樣注射裝置”，其發(fā)揮作用時會對SCV膜產(chǎn)生不同程度的損傷，導(dǎo)致自噬蛋白LC3募集至破損的SCV，進而與自噬受體蛋白結(jié)合并泛素化，促進吞噬體與溶酶體結(jié)合，從而消滅傷寒沙門菌；② 傷寒沙門菌能利用T3SS進行SCV自噬損傷的修復(fù)，促進其自身在細胞內(nèi)的生存和復(fù)制[3-4]。

SopE屬于鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)，通過T3SS1進入宿主腸上皮細胞，激活Rho GTPase，導(dǎo)致肌動蛋白F重塑，引起上皮細胞膜褶皺，從而促進細菌入侵[5-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，SopE的存在增加了傷寒沙門菌胞質(zhì)的釋放，是早期SCV損傷的主要因素[9]；SopE除了能促進傷寒沙門菌在感染早期于上皮細胞胞內(nèi)釋放而有利于侵襲外[10]，還可定位于SCV膜表面，促進傷寒沙門菌在細胞內(nèi)的生存及復(fù)制[11]。然而，這些研究均集中于SopE對早期SCV穩(wěn)定性的影響，尚無研究報道其對晚期SCV穩(wěn)定性的影響。因此，本研究探討了傷寒沙門菌侵入巨噬細胞后SopE對其胞內(nèi)生存能力和晚期SCV穩(wěn)定性的影響，以及SopE能否通過影響自噬而調(diào)節(jié)晚期SCV的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒傷寒沙門菌GIFU10007野生株(wild type，WT)和自殺質(zhì)粒pGMB151由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)部微生物教研室饋贈；sopE突變株(ΔsopE)、突變株的回補株(ΔsopE/pBAD33-SopE，C-ΔsopE)以及表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的WT、ΔsopE和C-ΔsopE(WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP)等菌株均由本實驗室構(gòu)建和保存。

1.1.2 主要試劑配制Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基所用的NaCl、蛋白胨、瓊脂為美國Thermo公司生產(chǎn)；瓊脂糖為法國Biowest公司產(chǎn)品；蔗糖為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；BamHⅠ、XbaⅠ和Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，以及DL500、DL1000、DL2000 Marker 為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、RIPA裂解液試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、鼠抗β-actin、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；THP-1細胞購自中國科學(xué)院細胞庫；反轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR染料法熒光定量試劑、2×Taq連接酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；鼠抗LAMP 1和兔抗LC3B購自美國CST公司；兔抗Gal-8、羊抗兔IgG-Cy3、羊抗鼠IgG-TRITC購自武漢愛博泰克(ABclonal)生物科技有限公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自美國Sigma公司。

1.1.3 主要儀器數(shù)顯恒溫水浴鍋為上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；普通聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀、大型臺式恒溫搖床、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機為湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(CFX96)、電穿孔儀Gene PulserⅩ、水平電泳槽、垂直電泳槽和電轉(zhuǎn)印槽為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；核酸紫外檢測儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；超微量分光光度計為美國NanoDrop公司產(chǎn)品；超敏化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、超高分辨活細胞成像系統(tǒng)為美國GE公司產(chǎn)品；全自動凝膠成像系統(tǒng)為上海勤翔科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1sopE缺陷變異株(ΔsopE)的構(gòu)建根據(jù)sopE序列，利用Oligo 7軟件設(shè)計構(gòu)建sopE突變株的引物對BF1/BR1和BF2/BR2(見表1)，其中BF1和BR2的5′端加入BamHⅠ酶切位點，具體如表1中下劃線所示。PCR擴增獲得上游和下游同源片段F1、F2；以F1、F2為模板，用BF1、BR2進行PCR擴增，獲得總同源片段F；用BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶切割片段F和自殺質(zhì)粒pGMB151；用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌S17，對PCR鑒定的陽性克隆進行測序驗證。將已測序驗證的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入WT菌株，進而在含氨芐青霉素的LB板上篩選含質(zhì)粒的菌株，在含5%蔗糖的LB平板上誘導(dǎo)重組，利用BF1/BR2對不同克隆子進行PCR擴增驗證，能在LB普通平板上獲得完全重組并穩(wěn)定傳3代且序列完全正確的第4代菌株，即為ΔsopE菌株。

1.2.2 C-ΔsopE菌株的構(gòu)建以WT菌株的基因組為模板，利用引物對sopE-F(5′端加入XbaⅠ酶切位點)和sopE-R (5′ 端加入HindⅢ酶切位點)進行 PCR擴增， 獲得回補片段， 用XbaⅠ和HindⅢ消化回補片段和pBAD33載體； T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α；PCR篩選出陽性克隆子，并提取重組質(zhì)粒，進行測序驗證。將已測序驗證的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入ΔsopE菌株，獲得C-ΔsopE菌株。同時，將pBAD33空載體分別轉(zhuǎn)化入WT和ΔsopE菌株，獲得對照組WT/pBAD33和ΔsopE/pBAD33，以消除添加氯霉素對實驗可能造成的影響。

表1 PCR引物

1.2.3 GFP表達菌株的構(gòu)建將GFP原核表達質(zhì)粒pET28-sfGFP電轉(zhuǎn)入WT/pBAD33、ΔsopE/pBAD33和C-ΔsopE菌株，在含硫酸卡那霉素的LB板上篩選含質(zhì)粒的菌株，用T7/T7T對不同克隆株進行PCR擴增驗證，最終能擴增出陽性條帶的菌株則為WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株。

1.2.4 巨噬細胞THP-1胞內(nèi)生存能力實驗使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，將細胞置于37 ℃、CO2體積分數(shù)5%的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。調(diào)整細胞密度至1×105cells/ mL，將細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中(每孔1 mL細胞懸液)，加入佛波醇乙酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)(終濃度150 ng/mL)誘導(dǎo)分化細胞48 h，貼壁細胞即為巨噬細胞，誘導(dǎo)率約為70%。將WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP、C-ΔsopE/pET28-sfGFP單克隆分別接種于2 mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)過夜，用作種子液。次日，按1∶100比例轉(zhuǎn)接到20 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，加入20% L-阿拉伯糖誘導(dǎo)蛋白合成，以同樣條件培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600=0.4)，以 4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用RPMI 1640重懸菌體。實驗前1 h，棄去24孔板中的舊培養(yǎng)基，用1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗去殘余PMA，每孔加入1 mL新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基。將細菌按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為10∶1加入24孔板，37 ℃、CO2體積分數(shù)5%培養(yǎng)1 h，每孔加入100 μg/mL慶大霉素，以同樣條件培養(yǎng)1 h殺死胞外菌。將全部孔數(shù)分成2等份，一半孔棄去上清液，用1×PBS洗3次，加入0.5% TritonXTM-100裂解細胞，適當(dāng)稀釋后涂于含抗生素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)平板上菌落數(shù)量并乘以稀釋倍數(shù)作為T0。余下一半孔棄去1/2培養(yǎng)液，加入1/2新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液(仍為慶大霉素環(huán)境)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用同樣的方法計數(shù)菌落數(shù)作為T24。T24/T0值代表了細菌在巨噬細胞THP-1內(nèi)的生存能力。按照此方法進行3次生物學(xué)重復(fù)實驗。

1.2.5 細胞免疫熒光實驗接種細胞前，將細胞爬片放入24孔板，按1.2.4小節(jié)所述方法感染培養(yǎng)24 h，用1×PBS于搖床中清洗細胞爬片3次，每次5 min。加入300 μL 4%多聚甲醛固定和通透細胞30 min，棄去4%多聚甲醛，用1×PBS清洗4次，每次5 min。用5% BSA室溫封閉45 min，棄去封閉液，與5% BSA稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，用1×PBS清洗4次，每次10 min。與1×TBST稀釋的二抗于室溫避光搖床孵育1 h，用1×PBS清洗4次，每次10 min。用1×TBST稀釋的4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)溶液染核，1×PBS清洗4次，每次10 min。用抗熒光淬滅的封片劑封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)紅色和綠色點狀聚集。

1.2.6 RNA提取及qRT-PCR將細胞按2.5×105cells/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2.5 mL，按1.2.4小節(jié)所述方法感染培養(yǎng)24 h后，每孔加入 167 μL TRIzol，提取總RNA并定量。取1 μg總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒消化基因組DNA同時反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用自噬特異性引物(見表1)進行qRT-PCR，以β-actin為內(nèi)參基因，使用相對定量法分析不同基因的mRNA表達水平。每組設(shè)置3個平行樣，并進行3次生物學(xué)重復(fù)實驗。

1.2.7 細胞蛋白提取和蛋白免疫印跡實驗將細胞分別接種于3個細胞培養(yǎng)皿(5×105cells/皿)，培養(yǎng)體積6 mL/皿，按1.2.4小節(jié)所述方法感染培養(yǎng)24 h后，用RIPA裂解液試劑盒裂解提取蛋白質(zhì)，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮5 min，于4 ℃以 13 000 r/min離心10 min。用SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒制備凝膠，每孔加入15 μL經(jīng)處理的蛋白質(zhì)上清液樣本，電泳至目的蛋白充分分離(濃縮膠使用80 V電壓，分離膠使用120 V電壓)。將聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜在甲醇中浸泡20 min，放入1×轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡2 min，浸潤電轉(zhuǎn)所用海綿、濾紙，PVDF膜放好位置后插入電轉(zhuǎn)儀，在250 mA恒流、4 ℃下電轉(zhuǎn)1 h。電轉(zhuǎn)后PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃下與一抗孵育過夜，1×TBST洗滌3次，每次10 min，與二抗在室溫下?lián)u床孵育 1 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min。用濾紙將PVDF膜吸干，滴加增強型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑，在超靈敏化學(xué)發(fā)光凝膠顯像系統(tǒng)下進行曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用Excel表格處理原始數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建突變株和回補株

以WT菌株全基因組DNA為模板，BF1/BR1、BF2/BR2為引物對，通過PCR擴增同源重組的上、下游同源臂。結(jié)果如圖1A所示，上、下游同源臂F1和F2的片段大小均與理論一致。F1和F2經(jīng)純化、回收、等比例混合后，用作引物對BF1和BR2 擴增的模板，可擴增出理論長度為1 027 bp的DNA片段(見圖1B)。利用分子克隆技術(shù)將該DNA片段克隆入自殺質(zhì)粒pGMB151，并轉(zhuǎn)化入WT菌株，進行同源重組以敲除sopE。使用PCR技術(shù)對不同克隆子進行驗證，發(fā)現(xiàn)1株擴增出F片段且能在LB培養(yǎng)板上穩(wěn)定傳3代的菌株，表明其獲得了穩(wěn)定重組(見圖1C)。該重組子經(jīng)測序驗證，證明為ΔsopE菌株。

以sopE-F/sopE-R為引物，通過PCR擴增獲得同源片段S2。利用分子克隆技術(shù)將該DNA片段克隆入蛋白表達質(zhì)粒pBAD33，并轉(zhuǎn)化入ΔsopE菌株。使用PCR技術(shù)對不同克隆子進行驗證，發(fā)現(xiàn)1株擴增出S2片段(見圖1D)，測序驗證結(jié)果表明C-ΔsopE菌株構(gòu)建成功。同時，電泳結(jié)果顯示W(wǎng)T/pBAD33和ΔsopE/pBAD33菌株均構(gòu)建成功(見圖1E、1F)。

M: DNA marker; +: recombinant plasmid as template; -: deionized water as template;

2.2 成功構(gòu)建GFP表達菌株

將pET28-sfGFP直接電轉(zhuǎn)入WT/pBAD33、ΔsopE/pBAD33、C-ΔsopE菌株，以T7/T7T為引物進行PCR擴增。電泳結(jié)果顯示，pET28-sfGFP成功電轉(zhuǎn)(見圖2)，表明GFP表達菌株WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP構(gòu)建成功。

M: DNA marker; 1-3: PCR products of positive wild strains; 4-6: PCR product of positive defective strain; 7-8: PCR product of positive complement strain; -: pure water as negative control; +: pure pET28-sfGFP plasmid.

2.3 SopE促進傷寒沙門菌的胞內(nèi)生存能力

為了研究傷寒沙門菌sopE基因缺失對其在巨噬細胞THP-1內(nèi)生存能力的影響，用WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株進行THP-1胞內(nèi)生存實驗。結(jié)果顯示，感染24 h后，ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株的胞內(nèi)生存能力比WT/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株明顯降低，而C-ΔsopE/pET28-sfGFP 菌株的胞內(nèi)生存能力與ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株相比有所回升(見圖3)，表明SopE能夠提高傷寒沙門菌在巨噬細胞內(nèi)的生存能力。

2.4 SopE可能增強晚期SCV的穩(wěn)定性

為了研究sopE基因缺失對巨噬細胞內(nèi)晚期SCV穩(wěn)定性的影響，在WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株感染巨噬細胞24 h時進行免疫熒光實驗，將LAMP1和GAL8與菌株共定位。結(jié)果顯示，感染24 h時WT/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株在巨噬細胞內(nèi)形成的SCV膜上的LAMP1蛋白熒光強度，較于ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株增強不明顯，但GAL8蛋白熒光強度顯著減弱(見圖4)。應(yīng)用qRT-PCR對WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株中的目的基因LAMP1、GAL8進行檢測，目的基因mRNA水平的變化與其在蛋白水平的熒光檢測結(jié)果一致(見圖5A)。結(jié)果表明，sopE缺陷株SCV的穩(wěn)定性下降，SopE可能增強了晚期SCV的穩(wěn)定性。

Ⅰ: WT/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅱ: ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅲ: C-ΔsopE/pET28-sfGFP strain.

Ⅰ: WT/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅱ: ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅲ: C-ΔsopE/pET28-sfGFP strain. Blue fluorescence represents nuclear, red fluorescence represents LAMP1 and GAL8, and green fluorescence represents bacteria. The magnification is 600×.

2.5 SopE可能在感染晚期抑制自噬

LC3在自噬的成核和延伸階段發(fā)揮作用，是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白。自噬受體蛋白與LC3結(jié)合，通過泛素化使自噬體與溶酶體結(jié)合[10]。為了研究sopE基因缺失對巨噬細胞內(nèi)晚期SCV穩(wěn)定性的影響是否與自噬相關(guān)，提取WT/pBAD33∷pET28-sfGFP、ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株感染巨噬細胞24 h時的總RNA進行qRT-PCR，并提取總蛋白進行蛋白免疫印跡實驗。qRT-PCR結(jié)果顯示，WT/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株感染巨噬細胞24 h后，LC3B在mRNA水平的表達顯著低于ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株感染組(見圖5A)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，WT/pBAD33∷pET28-sfGFP和C-ΔsopE/pET28-sfGFP菌株感染細胞后，LC3B蛋白的表達水平也顯著低于ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP菌株感染組(見圖5B)。結(jié)果提示，SopE可能在感染晚期抑制自噬。

Ⅰ: WT/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅱ: ΔsopE/pBAD33∷pET28-sfGFP strain; Ⅲ: C-ΔsopE/pET28-sfGFP strain.

3 討論

傷寒沙門菌通過沙門菌毒力島1(Salmonellapathogenicity island 1，SPI-1)編碼的T3SS1效應(yīng)蛋白入侵腸道上皮細胞，被單核-巨噬細胞吞噬后在巨噬細胞內(nèi)形成SCV，利用SPI-2編碼的T3SS2效應(yīng)蛋白在SCV中生存和復(fù)制[12]。傷寒沙門菌被吞噬包裹后，迅速募集Rab5、PI3P、EEA1等早期膜標(biāo)記形成初期SCV，進而棄去早期標(biāo)記并募集晚期膜標(biāo)記Rab7、LAMP1等形成晚期SCV，同時近核移動并酸化，促進T3SS2效應(yīng)蛋白的產(chǎn)生，通過囊泡運輸，不斷與無水解酶的晚期內(nèi)體及溶酶體融合，形成成熟的SCV，從而促進傷寒沙門菌在細胞內(nèi)的生存和復(fù)制[13-16]。LAMP1不僅是晚期SCV的標(biāo)記，還與SCV膜的完整性相關(guān)。晚期SCV會不斷募集無水解酶的內(nèi)體和溶酶體與之融合，確保SCV的穩(wěn)定性，但此動態(tài)變化也會導(dǎo)致SCV的破損。一旦破損，GAL8會迅速識別并在破損處聚集，通過自噬消滅傷寒沙門菌[17-18]。SCV的穩(wěn)定性對傷寒沙門菌在巨噬細胞內(nèi)的生存和復(fù)制至關(guān)重要。被傷寒沙門菌感染后，機體可以誘導(dǎo)自噬，這在消除細菌中起關(guān)鍵作用。SCV中的傷寒沙門菌能夠通過T3SS將效應(yīng)蛋白注入宿主細胞胞質(zhì)中，使SCV膜產(chǎn)生大小不一的小孔，導(dǎo)致SCV膜破損甚至破裂，從而導(dǎo)致傷寒沙門菌進入胞質(zhì)。這些傷寒沙門菌和破損的SCV會被泛素化，招募自噬相關(guān)蛋白，被溶酶體吞噬消滅[19-20]。與此同時，傷寒沙門菌也進化出了逃逸自噬的能力。研究發(fā)現(xiàn)，T3SS1效應(yīng)蛋白SopB 能募集Rab5和PI3P至SCV膜，促進LAMP1及Rab7的募集，并降低早期SCV膜表面的負電荷，抑制SCV與溶酶體融合，增強早期SCV的穩(wěn)定性[21-22]。T3SS1效應(yīng)蛋白SopF可與ATP6V0C結(jié)合，從而阻斷v-ATPase-ATG16L1的相互作用，抑制機體異體自噬，但不影響非選擇性自噬[23-25]。

本研究制備了傷寒沙門菌SPI-1效應(yīng)蛋白SopE的缺陷株和回補株，通過胞內(nèi)生存能力實驗發(fā)現(xiàn)SopE在感染晚期能夠提高傷寒沙門菌在巨噬細胞THP-1內(nèi)的生存能力。通過細胞免疫熒光和qRT-PCR實驗，發(fā)現(xiàn)sopE缺陷株的SCV穩(wěn)定性下降，提示SopE可能促進晚期SCV的穩(wěn)定性。巨噬細胞內(nèi)自噬相關(guān)基因的mRNA表達水平和蛋白表達水平的實驗結(jié)果顯示，SopE可能在感染晚期抑制自噬。綜上所述，傷寒沙門菌SPI-1效應(yīng)蛋白SopE可能通過影響自噬而調(diào)節(jié)晚期SCV的穩(wěn)定性。以往研究發(fā)現(xiàn)，SopE是早期SCV損傷的主要因素，能夠促進傷寒沙門菌在感染早期于上皮細胞胞內(nèi)釋放，從而有利于侵襲[9]。因此，SopE在感染早期和晚期發(fā)揮的作用可能不盡相同，這為研究傷寒沙門菌效應(yīng)蛋白的作用提供了新思路，也為后續(xù)深入研究其調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。