天然產(chǎn)物抗病原真菌的研究進(jìn)展

吳顯偉，田麗，胡轉(zhuǎn)楠，周偉，邱磊，張順先，張少言，鹿振輝

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院呼吸疾病研究所，上海 200032

近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)(如移植醫(yī)學(xué))的進(jìn)步，越來(lái)越多的疾病可被治愈，但其導(dǎo)致的免疫抑制人群數(shù)量也迅速增加[1-2]，促進(jìn)了侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)的發(fā)病[3]，給臨床真菌感染治療帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。真菌感染可分為淺表/皮下感染(皮膚癬病、花斑癬和孢子絲菌病)和侵襲性真菌感染[假絲酵母(也稱(chēng)念珠菌)病、曲霉病和隱球菌病]，可累及任何類(lèi)型的組織或器官，導(dǎo)致骨骼、肺和神經(jīng)等損傷[3-4]。侵襲性真菌感染在免疫受損患者中尤其常見(jiàn)，如感染人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的患者，以及器官或骨髓移植和癌癥患者等[4-5]。侵襲性真菌能引起可能導(dǎo)致死亡的全身感染，死亡率高達(dá)90%，每年造成約150萬(wàn)人死亡，嚴(yán)重威脅人類(lèi)公共衛(wèi)生健康[5]。

抗真菌藥物可控制和治療真菌感染，改變真菌的自然進(jìn)化，其研發(fā)取得了重大進(jìn)展。目前，臨床上主要使用多烯類(lèi)、唑類(lèi)、烯丙胺類(lèi)、棘白菌素類(lèi)和氟胞嘧啶類(lèi)5類(lèi)抗真菌藥物，包括兩性霉素B、特比萘芬、氟康唑、5-氟胞嘧啶和卡泊芬凈等[6]。然而，最近的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，由于抗真菌藥物的濫用及免疫抑制人群數(shù)量的增加，耐藥和多重耐藥菌株的臨床檢出率顯著升高[7]，特別是念珠菌屬和曲霉屬，對(duì)唑類(lèi)藥物耐藥的非白念珠菌和煙曲霉的臨床檢出率正不斷升高[8]。近年來(lái)獲得極大關(guān)注的“超級(jí)真菌”——耳道念珠菌，其高達(dá)90%的臨床分離株對(duì)氟康唑耐藥[9]。因此，人們亟須發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)新的抗真菌藥物，更新藥物庫(kù)，以應(yīng)對(duì)新的耐藥菌株的出現(xiàn)。

抗真菌藥物的缺乏及真菌耐藥性的出現(xiàn)，使得從化學(xué)合成產(chǎn)物或天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)和篩選新的抗真菌藥物成為一項(xiàng)緊迫的任務(wù)。與化學(xué)合成產(chǎn)物相比，天然產(chǎn)物具有來(lái)源廣、結(jié)構(gòu)多樣、毒性相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)[10]，無(wú)論是以其原有形式還是作為結(jié)構(gòu)優(yōu)化的原始模板來(lái)獲得高效安全的衍生物，天然產(chǎn)物都是抗真菌藥物庫(kù)的潛在來(lái)源。中藥是天然產(chǎn)物的資源庫(kù)，從中草藥中分離得到的許多化合物被證明具有多種藥理活性，如抗細(xì)菌、抗腫瘤、抗病毒和抗真菌活性[11]。鑒于目前抗真菌藥物的缺乏和中藥的有效性，從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)抗真菌藥物具有良好的前景。本文簡(jiǎn)要回顧了抗真菌天然產(chǎn)物的研究現(xiàn)狀。

1 天然產(chǎn)物的抗真菌機(jī)制

目前，臨床上用于治療真菌感染的藥物主要是多烯類(lèi)、唑類(lèi)、烯丙胺類(lèi)、氟嘧啶類(lèi)和棘白菌素，如兩性霉素B、特比萘芬、氟康唑、5-氟胞嘧啶和卡泊芬凈等[5]，它們的作用靶點(diǎn)各不相同。與此類(lèi)似，天然產(chǎn)物的抗真菌機(jī)制也不盡相同。明確天然產(chǎn)物的抗真菌機(jī)制有利于人們針對(duì)性地開(kāi)發(fā)新一代抗真菌藥物，本文從以下幾個(gè)方面闡述天然產(chǎn)物的抗真菌靶點(diǎn)。

1.1 靶向細(xì)胞膜

細(xì)胞膜是許多代謝過(guò)程發(fā)生的場(chǎng)所，同時(shí)它能將細(xì)胞內(nèi)容物與周?chē)h(huán)境分隔開(kāi)，以維持細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)態(tài)。因此，細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性對(duì)真菌細(xì)胞的生存和生長(zhǎng)至關(guān)重要。提取自接骨木的松脂醇能破壞白念珠菌的細(xì)胞膜，且對(duì)人紅細(xì)胞沒(méi)有溶血活性，具有潛在的抗真菌活性[12-13]。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要成分，能調(diào)節(jié)真菌細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞分裂[5]。厚樸酚是厚樸的主要單體之一，研究顯示其可顯著降低白念珠菌中麥角甾醇的含量，還可減少細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)氟康唑的外排，從而增強(qiáng)氟康唑的抗真菌作用[14]。薄荷精油中的化合物，如薄荷醇、薄荷酮和香芹酮，可通過(guò)降低細(xì)胞膜中麥角甾醇的含量來(lái)抑制白色念珠菌的生長(zhǎng)[15]。香芹酚和百里酚也可降低麥角甾醇的水平，影響抗氧化防御系統(tǒng)，增加膜通透性，阻斷外排泵，從而恢復(fù)唑類(lèi)的抗真菌敏感性[14,16]。

1.2 靶向細(xì)胞壁

真菌細(xì)胞壁具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，能為細(xì)胞提供保護(hù)性屏障，抵抗各種環(huán)境壓力，如冷、熱、滲透壓力等[17]。真菌細(xì)胞壁主要由葡聚糖、甘露糖和幾丁質(zhì)等組成，其中幾丁質(zhì)維持真菌細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度，保持細(xì)胞壁的完整性。從地錢(qián)科提取出來(lái)的羽苔素E能抑制幾丁質(zhì)合成酶1(chitin synthase 1，CHS1)基因的表達(dá)，阻止真菌合成幾丁質(zhì)，從而達(dá)到破壞真菌細(xì)胞壁的目的[18]。真菌細(xì)胞壁的另一組分葡聚糖是宿主識(shí)別的病原相關(guān)分子模式，而棘白菌素能抑制真菌β-1,3-葡聚糖的合成，獲得殺菌效果[19]。最近一項(xiàng)研究顯示，魚(yú)腥草素鈉可能通過(guò)干擾β-1,3-葡聚糖的合成和運(yùn)輸而與氟康唑聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同作用[20]。

1.3 靶向線粒體

能量供應(yīng)和代謝產(chǎn)物對(duì)于真菌的生存和生長(zhǎng)及主要細(xì)胞事件(如白念珠菌從酵母態(tài)到菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變)不可或缺。小檗堿能誘導(dǎo)真菌線粒體功能障礙和增加活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，與氟康唑聯(lián)用具有協(xié)同作用[10,21]。此外，小檗堿能破壞白念珠菌細(xì)胞壁的完整性[22]，還可抑制白念珠菌耐藥基因CDR1的過(guò)度表達(dá)[23]。從姜黃中提取的姜黃素對(duì)許多真菌具有抗真菌活性[24-25]，且其可單獨(dú)或與唑類(lèi)和多烯類(lèi)藥物聯(lián)用發(fā)揮協(xié)同作用，增加白念珠菌細(xì)胞的活性氧生成并促使其凋亡[26-27]。有報(bào)道稱(chēng)，從水飛薊中分離的最著名和最有效的化合物——水飛薊賓，可誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞中與線粒體Ca2+內(nèi)流相關(guān)的凋亡[28]，且其安全性已通過(guò)臨床試驗(yàn)證明，水飛薊賓成為抗真菌感染的一個(gè)非常有希望的候選藥物。

1.4 靶向真菌毒力因子

真菌通過(guò)眾多毒力因子來(lái)幫助其對(duì)宿主的定植和感染[29]。白念珠菌從酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)化是主要毒力因子之一，是其在宿主組織中定植、入侵/滲透、毒力釋放、免疫逃避和存活的主要影響因素[19]。厚樸酚可誘導(dǎo)白念珠菌Ras1-cAMP-Efg1信號(hào)通路的成分(如RAS1、EFG1、TEC1和CDC35)下調(diào)，以及菌絲特異性基因ECE1、HWP1和ALS3的表達(dá)水平下降，進(jìn)而抑制白色念珠菌從酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)化[30-31]。姜黃素可通過(guò)靶向轉(zhuǎn)錄抑制因子TUP1而抑制白念珠菌從酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)化[32]。

真菌生物膜是黏附在固體表面的由不同類(lèi)型細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的群落，是真菌抵抗化學(xué)和物理?yè)p傷的重要毒力因子[33]。真菌生物膜通常形成于植入的醫(yī)療設(shè)備(如導(dǎo)管、起搏器等)上以及宿主表面。許多植物的提取物具有抑制白念珠菌生物膜形成的能力，如茶多酚[34]、桂皮醇提物[35]、芫荽和羅勒屬植物精油[36-38]等。小檗堿、百里酚、黃芩素等許多天然產(chǎn)物活性單體都可單獨(dú)或與氟康唑等抗真菌藥物協(xié)同抑制真菌生物膜的形成[10, 39-41]。

1.5 與現(xiàn)有抗真菌藥物的協(xié)同作用

由于耐藥和多重耐藥真菌的出現(xiàn)，現(xiàn)有抗真菌藥物的治療效果有限，而增加藥物濃度則會(huì)導(dǎo)致毒副作用加重和治療成本升高[42]。鑒于目前新的抗真菌藥物研發(fā)進(jìn)展緩慢，現(xiàn)有抗真菌藥物聯(lián)用成為有效且實(shí)用的替代方法。許多研究報(bào)道了天然產(chǎn)物與現(xiàn)有抗真菌藥物具有協(xié)同效應(yīng)，包括植物精油(薄荷屬、天竺葵屬、蔥屬、牛至屬、百里香屬等)[43]，以及天然產(chǎn)物單體(小檗堿、姜黃素、百里酚、丁香酚、厚樸酚、大蒜素等)，它們與唑類(lèi)、多烯類(lèi)藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用[44]。最近一項(xiàng)研究探討了5種天然產(chǎn)物單體(魚(yú)腥草素鈉、肉桂醛、小檗堿、藥根堿和巴馬汀)聯(lián)用對(duì)白念珠菌和耳道念珠菌的抑制作用[22]。其結(jié)果顯示，魚(yú)腥草素鈉+巴馬汀、肉桂醛+小檗堿、肉桂醛+藥根堿組合對(duì)白念珠菌的協(xié)同效果最好，肉桂醛+巴馬汀、肉桂醛+藥根堿組合對(duì)耳道念珠菌的協(xié)同效果最好，這種抗真菌協(xié)同作用可能是由于組合內(nèi)的藥物針對(duì)不同的藥物靶標(biāo)而獲得的。還有研究發(fā)現(xiàn)，血根堿和白屈菜紅堿聯(lián)用能抑制白念珠菌和新生隱球菌的生長(zhǎng)，且具有協(xié)同作用[45]。兩者聯(lián)用能破壞真菌細(xì)胞膜的完整性，抑制生物膜的形成，因此具有開(kāi)發(fā)為抗真菌藥物的潛能。

2 天然產(chǎn)物單體成分

目前，從天然產(chǎn)物中提取了20多種結(jié)構(gòu)新穎、活性強(qiáng)、不良反應(yīng)小的活性單體成分，包括醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)和生物堿等，這些單體成分經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明具有體內(nèi)或體外抑制真菌生長(zhǎng)或殺菌的能力(見(jiàn)表1)。體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估抑菌效果大多采用微量稀釋法，實(shí)驗(yàn)對(duì)象大多為白念珠菌或臨床分離的耐氟康唑白念珠菌，少數(shù)為新生隱球菌或曲霉。體外研究大多聚焦于天然產(chǎn)物單體成分對(duì)真菌毒力因子的影響，如：大黃素、姜黃素、厚樸酚、小檗堿、苦參堿等能抑制白念珠菌從酵母態(tài)到菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)換；紅紫素、丁香酚、土荊皮乙酸、百里酚、薄荷醇等能抑制真菌生物膜的形成；香芹酚、薄荷醇、芳樟醇、血根堿、沒(méi)食子酸等能破壞細(xì)胞膜等。然而，評(píng)估天然產(chǎn)物單體成分體內(nèi)抑菌效果的報(bào)道相對(duì)較少。有研究使用秀麗隱桿線蟲(chóng)模型來(lái)測(cè)試天然產(chǎn)物單體成分的潛在抗真菌活性，結(jié)果顯示2種皂苷能提高被白念珠菌感染的線蟲(chóng)的存活率，具有體內(nèi)抗真菌活性[46]。大部分活性單體成分提取自中藥藥用植物，如提取自姜黃的姜黃素[47]和提取自水飛薊的水飛薊賓[48]等，提示傳統(tǒng)中藥依然是開(kāi)發(fā)抗真菌感染藥物的巨大寶庫(kù)。

值得一提的是，隨著抗真菌藥物研發(fā)的深入，海洋來(lái)源的天然產(chǎn)物活性單體作為新的抗真菌候選藥物獲得了極大關(guān)注[4]。其中，海綿被認(rèn)為是具有抗真菌特性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要來(lái)源。從斐濟(jì)海綿Hippospongiasp.中分離出的一種倍半萜醌epi-ilimaquinone，能抑制耐兩性霉素B的白念珠菌的生長(zhǎng)[49]，從隋氏蒂殼海綿(Theonellaswinhoei)中分離的多肽Aurantoside則對(duì)白念珠菌和新生隱球菌都有抑制作用，具有良好的廣譜抗真菌活性[4]。

3 天然產(chǎn)物提取物

采用植物制備粗提取物是發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物的第一步，一般通過(guò)水提或醇提的方式獲得，也可通過(guò)蒸餾從植物中分離精油[50]。國(guó)內(nèi)外均報(bào)道了一些在植物不同部位經(jīng)水提或乙醇提取的粗提物具有抗真菌活性[51](見(jiàn)表2)。吳晶[52]采用75%乙醇超聲提取中藥有效成分，篩查了1 557味中藥的粗提物對(duì)白念珠菌、新生隱球菌和煙曲霉等常見(jiàn)侵襲性真菌的抑制作用，共發(fā)現(xiàn)453味中藥的粗提物具有抗真菌活性，并發(fā)現(xiàn)重樓、粉萆薢、白薇、穿山龍、藜蘆、羌活等提取物在低濃度下即能完全抑制白念珠菌的菌絲生長(zhǎng)，具有很強(qiáng)的抗真菌作用。宮毓靜等[90]采用半固體藥基混合法測(cè)試了164種單味藥的95%乙醇提取物的抗真菌活性，結(jié)果顯示牡丹皮、土荊皮等9種單味藥的粗提物對(duì)白念珠菌具有明顯的抑制作用。

表1 天然產(chǎn)物活性單體成分對(duì)病原真菌的抑制作用

(續(xù)表1)

表2 不同植物來(lái)源提取物的抗真菌研究

通過(guò)蒸餾分離的植物精油具有更強(qiáng)的抗真菌活性，有學(xué)者對(duì)其組成和抗真菌活性進(jìn)行了深入研究[91]。從丁香、牛至、百里香和肉桂中提取的精油對(duì)真菌具有顯著的抑制作用，這些植物精油中的酚類(lèi)化合物(香芹酚和百里香酚)能破壞真菌的細(xì)胞膜，抑制真菌生長(zhǎng)[25]。植物精油可能通過(guò)破壞真菌細(xì)胞壁和質(zhì)膜來(lái)達(dá)到殺菌效果，有研究表明精油可用來(lái)治療淺表真菌感染，但對(duì)侵襲性真菌感染療效不佳，這可能是由植物精油在人體腸道中吸收較差導(dǎo)致的[92]。因此，將植物精油與現(xiàn)有抗真菌藥物聯(lián)用以治療侵襲性真菌感染可能有更好的治療效果。

通過(guò)天然產(chǎn)物提取物篩選抗真菌藥物是經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的初步方法，對(duì)進(jìn)一步的研究工作具有一定的指導(dǎo)意義。然而，由于粗提取物中的化學(xué)成分不同，提取物的生物活性可能無(wú)法在實(shí)驗(yàn)中重現(xiàn)。此外，獲得提取物的溶劑和提取方法也可能導(dǎo)致某些化合物的損失。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，許多天然化合物可通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮抗真菌活性，成為開(kāi)發(fā)抗真菌藥物的巨大資源庫(kù)。盡管針對(duì)天然產(chǎn)物活性單體成分已有眾多深入的研究，但針對(duì)天然產(chǎn)物粗提物的研究大多只局限于用體外藥敏試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)抗真菌活性，未深入研究其抗真菌機(jī)制，且大多數(shù)研究?jī)H有體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究較少，已開(kāi)展的臨床研究主要為治療淺部真菌病，研究范圍小，周期較短。因此，基于天然產(chǎn)物的抗真菌藥物研發(fā)須更加深入。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步和人們不斷的關(guān)注，基于天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)新型抗真菌藥物的進(jìn)程會(huì)越來(lái)越快。