神闕穴電針對(duì)便秘型腸易激綜合征胃腸功能障礙及腸道菌群的影響*

謝林林，趙玉粒，黃明桂，古遠(yuǎn)云

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 瀘州 646000）

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是一種功能性胃腸道疾病，以腹痛、腹脹、排便習(xí)慣改變和大便紊亂為主要臨床表現(xiàn)[1]。全球IBS的患病率約為11%，而亞洲不同地區(qū)的患病率從5%到9.9%不等，根據(jù)羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)，IBS分為腹瀉型IBS（IBS-D）、便秘性IBS（IBS-C）混合型IBS（IBS-M）和不可分型IBS（IBSU），其中IBS-C發(fā)病率約占26.7%，且發(fā)病率逐年增高，癥狀頑固，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量[2-3]。IBS-C的病理生理機(jī)制仍不清楚，因此阻礙了有效治療IBSC的發(fā)展[4]。目前，可用的IBS-C治療大致分為藥物治療和其他干預(yù)措施，如生活方式和飲食調(diào)整[5]。大多數(shù)IBS-C藥物僅限于對(duì)癥治療IBS-C的特定癥狀，對(duì)其他相關(guān)癥狀沒(méi)有顯著療效，且生活方式和飲食改變并不是對(duì)所有患者都統(tǒng)一有效[6]。在此背景下，補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué)顯示出希望，作為補(bǔ)充和替代醫(yī)學(xué)的治療方法之一，電針被認(rèn)為是治療功能性胃腸道疾病的有益替代療法[7]。研究表明電針可通過(guò)干擾軀體神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)介質(zhì)來(lái)改變內(nèi)臟感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)[8]。此外，電針可從腦-腸軸和免疫系統(tǒng)等方面干預(yù)IBS[9]。然而，這些研究還沒(méi)有提供足夠的證據(jù)來(lái)確定電針治療IBS-C的有效作用機(jī)制。因此，本研究以腸道微生物變化為切入點(diǎn)，進(jìn)而探討神闕穴電針治療IBS-C的作用機(jī)制，以期為電針治療IBS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康Sprague Dawley（SD）大鼠48只，體質(zhì)量（230±20）g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供（許可證號(hào)：SCXK（川）2018-17）。所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫（23±2）℃、相對(duì)濕度55%±5%的環(huán)境中，常規(guī)24 h晝夜循環(huán)，本研究方案經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20210010），實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2 主要試劑及儀器

西沙必利片（國(guó)藥準(zhǔn)字H20020345）購(gòu)自浙江京新藥業(yè)；蘇木素染液（批號(hào)：C200301）、伊紅染液（批號(hào)：C200403）購(gòu)自珠海貝索生物；環(huán)磷酸鳥苷（cGMP，貨號(hào)：ZC-36710）ELISA試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物；RNA Trizol Reagent（批號(hào)：vs18061730）購(gòu)自合肥博美生物；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（貨號(hào)：RR820A）購(gòu)自寶日醫(yī)生物；DNA分離試劑盒（貨號(hào)：12888-50）購(gòu)自美國(guó)Mobio；QAQUICK PCR純化試劑盒（貨號(hào)：28106）美國(guó)QIAGEN；PIKORed 96實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）儀，正置熒光顯微鏡（型號(hào)：DM3000）購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.3 便秘型腸易激綜合征大鼠模型構(gòu)建及分組

大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、西沙必利組、電針治療組，每組12只。將除空白組外的大鼠統(tǒng)稱為造模組，造模組大鼠給予普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)7天后，采用冰水灌胃法建立IBS-C大鼠模型，即每日8∶30給予大鼠0-4℃冰水混合物灌胃，共14天。每日于灌胃后更換大鼠墊料，24 h后撿取大鼠糞便，稱取糞便質(zhì)量，記錄糞便粒數(shù)，觀察糞便硬度及形態(tài)。若見大鼠糞便質(zhì)硬、形狀變小、含水量減少，大鼠性易激惹，可判斷造模成功。

1.4 治療方法

造模成功后，電針治療組每日9∶00將大鼠仰臥固定，電針大鼠神闕穴（胸腹正中線上，劍突至恥骨聯(lián)合上緣上2/3與下1/3交界處），進(jìn)針5 mm左右，每日1次，每次30 min，每天1次，5次為一個(gè)療程，療程中間休息2天，共治療4個(gè)療程。參照《大鼠穴位圖譜的研制》以及李忠仁版的《實(shí)驗(yàn)電針學(xué)》進(jìn)行穴位定位[10]，電針參數(shù)參考曹洋等[11]研究結(jié)果：強(qiáng)度2 mA，疏密波（疏波4 Hz，密波50 Hz）。為了避免由于強(qiáng)制固定時(shí)所引起的應(yīng)激反應(yīng)誤差，空白組、模型組大鼠每日只采取固定并給予等體積生理鹽水灌胃，西沙必利組大鼠每日固定給予西沙必利片0.9 g·L-1混懸液，按劑量為3.6 mg·kg-1灌胃，每日1次，持續(xù)28天。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 炭末推進(jìn)實(shí)驗(yàn)及糞便含水量測(cè)定

治療結(jié)束后，每組取6只大鼠灌胃墨汁，40 min后采用戊巴比妥鈉（35 mg·kg-1）麻醉大鼠，打開腹腔，分離腸系膜。剪取幽門至回盲部的腸管，測(cè)量腸管長(zhǎng)度為小腸總長(zhǎng)度，炭末在小腸中推進(jìn)距離為幽門至炭末前沿的距離，炭末推進(jìn)率=炭末在小腸中的推進(jìn)距離/小腸總長(zhǎng)度×100%。治療結(jié)束當(dāng)天，收集各組大鼠（n=12）24 h糞便，先后稱取大鼠糞便的濕重及干重（糞便濕重（A），糞便烘干后糞便重量（B）），糞便含水量=（A-B）/A×100%。

1.5.2 腹部撤退反射（AWR）評(píng)分

將蘸取液體石蠟的氣囊導(dǎo)管經(jīng)大鼠肛門插入直腸（一般4.5 cm）并固定，后將大鼠放在透明觀察箱，待其適應(yīng)并安靜休息時(shí)，連接實(shí)驗(yàn)用血壓計(jì)，通過(guò)加壓球緩慢向?qū)Ч芗皻饽覂?nèi)注氣使腸道擴(kuò)張，觀察大鼠腹壁的回縮反射，每個(gè)壓力測(cè)定3次，每只大鼠重復(fù)測(cè)量3次，每次間隔5 min。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：無(wú)明顯反應(yīng)；1分：輕微扭動(dòng)頭部；2分：腹背部肌肉輕微緊張；3分：腹背部肌肉較明顯聚攏；4分：腹部肌肉急劇收縮。

1.5.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

給藥結(jié)束后，收集各組剩余6只大鼠的結(jié)腸組織，用4%多聚甲醛固定，將固定組織經(jīng)脫水、包埋、切片（厚度5 μm），用HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封固、鏡檢觀察。

1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)

各組取剩余6只大鼠的結(jié)腸組織，PBS沖洗，剪成小塊，5 mL PBS冰上用玻璃勻漿器勻漿，反復(fù)凍融，進(jìn)一步破碎細(xì)胞膜，勻漿物以5000 r·min-1離心20 min，取上清液，按照ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織cGMP的含量。

1.5.5 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織C-fos mRNA表達(dá)

各組取剩余6只大鼠的結(jié)腸組織，使用TRIzol試劑盒按照制造商說(shuō)明從結(jié)腸組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用Takara TB Green ?PreMix Ex Taq?定量基因表達(dá)水平，引物序列：C-fos：5’-GTGGACCTGTC TGGTTCCTTCTATGC-3’（正向），5’-CTCGTTGCTGCT GCTGCCCTTT-3’（反向）；β-actin：5’-CTCCATCGTCC ACCGCAAATGCTTCT-3’（正向），5’-GCTCCAACCGA CTGCTGTCACCTTC-3’（反向）。以β-actin內(nèi)參。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)，記錄CT值，采用2-ΔΔCT分析相對(duì)表達(dá)水平。

1.5.6 腸道微生物區(qū)系分析

治療結(jié)束后，無(wú)菌收集各組大鼠糞便（〉0.5 g），分裝于無(wú)菌凍存管，對(duì)糞便樣本進(jìn)行16S rDNA基因測(cè)序，使用DNA分離試劑盒提取糞便樣本DNA，并使用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量。使用針對(duì)V4區(qū)的引物集進(jìn)行16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增，用QAQUICK PCR純化試劑盒從未摻入的核苷酸和引物中提純最終的PCR產(chǎn)物，將純化的樣品歸一化到相同的DNA濃度，并使用Illumina MiSeq測(cè)序儀PE250進(jìn)行測(cè)序。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），除腸道微生物區(qū)系分析外，所有其他數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），當(dāng)方差齊性時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，否則采用Tamhane's檢驗(yàn)，對(duì)于所有分析，P〈0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。16S rDNA序列數(shù)據(jù)利用QIIME分析。

2 結(jié)果

2.1 神闕穴電針對(duì)便秘型腸易激綜合征大鼠糞便含水量及糞便粒數(shù)的影響

與空白組比較，模型組大鼠糞便顆粒數(shù)、糞便重量、糞便含水量均明顯降低（P〈0.01）；與模型組比較，電針治療組大鼠糞便顆粒數(shù)、糞便重量、糞便含水量均明顯升高（P〈0.01），見圖1。

圖1 各組大鼠糞便顆粒數(shù)、糞便重量、糞便含水量變化

2.2 神闕穴電針對(duì)便秘型腸易激綜合征大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張的影響

與空白組比較，模型組大鼠AWR評(píng)分明顯升高，炭末推進(jìn)率明顯降低（P〈0.01）；與模型組比較，西沙必利組、電針治療組大鼠AWR評(píng)分明顯降低，炭末推進(jìn)率明顯升高（P〈0.01），見圖2。

圖2 各組大鼠AWR評(píng)分、炭末推進(jìn)率變化

2.3 神闕穴電針對(duì)便秘型腸易激綜合征大鼠組織病理學(xué)的影響

空白組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜分層明顯，未見明顯變性壞死。模型組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)被破壞，黏膜層全層溶解壞死較為明顯，黏膜上皮脫落缺失，固有層內(nèi)腸腺溶解基本消失，壞死區(qū)域及腸腔內(nèi)可見壞死細(xì)胞碎片聚集，局部區(qū)域固有層輕微出血。西沙必利組大鼠局部結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)被破壞，黏膜淺表壞死較為明顯，形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊，上皮脫落，腸腺溶解壞死。電針治療組大鼠局部結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)被破壞，部分區(qū)域黏膜上皮壞死脫落，固有層內(nèi)腸腺淺表溶解壞死，壞死區(qū)域染色較淺，結(jié)構(gòu)模糊。見圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織病理變化（HE）

2.4 神闕穴電針對(duì)便秘型腸易激綜合征大鼠胃腸功能障礙的影響

與空白組比較，模型組大鼠cGMP含量、C-fos mRNA表達(dá)明顯升高（P〈0.01）；與模型組比較，西沙必利組、電針治療組大鼠cGMP含量、C-fos mRNA表達(dá)明顯降低（P〈0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠cGMP含量、C-fos mRNA表達(dá)變化

2.5 神闕穴電針對(duì)便秘型腸易激綜合征大鼠微生物區(qū)系A(chǔ)lpha及Beta多樣性的影響

Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果顯示，Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)及觀察到的物種指數(shù)各組間均無(wú)明顯差異，電針治療對(duì)便秘型腸易激綜合征大鼠腸道菌群的豐富度及均勻度沒(méi)有明顯影響（圖5A）。使用PCA、PCoA以及NMDS圖分析了腸道微生物區(qū)系Beta多樣性的影響，Beta多樣性顯示各組間無(wú)明顯交疊趨勢(shì)，聚類現(xiàn)象較弱（圖5B）。

圖5 各組大鼠腸道微生物區(qū)系A(chǔ)lpha多樣性及Beta多樣性

2.6 神闕穴電針對(duì)便秘型腸易激綜合征大鼠微生物區(qū)系門、屬水平的影響

在門水平上，在空白組中，糞便樣本中菌群門水平最豐富的是擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicuts）；與空白組比較，模型組糞便微生物區(qū)系組成有明顯的變化，以擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicuts）為主，擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度下降，而厚壁菌門（Firmicuts）豐度增加；與模型組相比，西沙必利組擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度增加，電針治療組厚壁菌門（Firmicuts）豐度增加（圖6A）。在屬的水平上，糞便成分的個(gè)體差異增強(qiáng)，空白組以副普氏菌屬（Paraprevotella）、普氏桿菌（Prevotella）豐度較高；模型組以乳酸桿菌（Lactobacillus）、異桿菌屬（Allobaculum）為主；西沙必利組以乳酸桿菌（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）為主；而電針治療組以乳酸桿菌（Lactobacillus）和梭菌屬（Clostridium）為主；其比例在各組間具有可比性。普氏桿菌（Prevotella）豐度在模型組降低，而在西沙必利組豐度升高，電針治療組可增加乳酸桿菌（Lactobacillus）及梭菌屬（Clostridium）豐度（圖6B）。

圖6 各分組門、屬水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖

3 討論

IBS-C是功能性胃腸道疾病之一，給個(gè)人和社會(huì)造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[12]。中醫(yī)認(rèn)為IBS-C為壓抑的情緒和擔(dān)憂會(huì)導(dǎo)致肝氣郁滯，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟對(duì)脾胃的攻擊，由此導(dǎo)致的脾虛會(huì)影響消化問(wèn)題。此外，肝氣郁結(jié)會(huì)阻塞經(jīng)絡(luò)氣血，引起腹痛[13]。IBS-C的主要癥狀是腹痛、便秘和乏力，這些都是脾虛證的常見表現(xiàn)[14]。電針被認(rèn)為具有改善肝郁脾虛的作用，神闕穴位于臍中，為任脈要穴，與腸腑相隔，具有調(diào)胃理腸的功效，于該穴治療可健運(yùn)脾胃，因此，本實(shí)驗(yàn)采用了神闕穴電針治療IBS-C[7,15]。研究制備了IBS-C大鼠模型，結(jié)果顯示模型組大鼠糞便粒數(shù)、糞便含水量及炭末推進(jìn)率明顯降低，符合IBS-C模型特征。報(bào)道指出IBS-C大鼠腸黏膜有壞死、糜爛，且有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[4]，本結(jié)果顯示與其一致。通過(guò)電針神闕穴治療后，大鼠的糞便粒數(shù)、糞便含水量及炭末推進(jìn)率明顯升高，結(jié)腸組織部分區(qū)域黏膜壞死，結(jié)腸炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，組織病理形態(tài)變化明顯低于模型組，此外，結(jié)腸組織cGMP含量較模型組明顯降低。提示神闕穴進(jìn)行電針治療可以有效地延緩結(jié)腸組織病變程度。

腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其代謝可能影響腸道免疫反應(yīng)、養(yǎng)分吸收及能量調(diào)節(jié)[16]。此外，細(xì)菌修飾腸道是腸道菌群研究的重要領(lǐng)域之一，已被證明其有益于治療癌癥、炎癥性腸病、結(jié)腸炎、肥胖或其他疾病[17-19]。IBS-C的確切病因可能是多因素的，近年來(lái)越來(lái)越多的研究集中到胃腸道微生物區(qū)系對(duì)IBS-C的影響上[20]。而關(guān)于腸道微生物區(qū)系的變化及其影響目前仍知之甚少。研究指出微生物因素在IBS病理生理學(xué)中起作用。然而，IBS腸道微生物改變的證據(jù)目前有限[21]。研究報(bào)道Alpha多樣性和Beta多樣性指數(shù)分別表征物種在生境內(nèi)和生境間的多樣性，以綜合評(píng)價(jià)其總體多樣性，Alpha多樣性以Chao1、Observed species指數(shù)表征豐富度，以Shannon、Simpson指數(shù)表征多樣性，Chao1值越大代表物種總數(shù)越多，Simpson、Shannon指數(shù)越大，說(shuō)明群落多樣性越高；Beta多樣性指數(shù)聚焦于不同生境間多樣性的比較，也就是樣本間的差異，隨著樣本數(shù)的增加，距離矩陣的維度也不斷增大[22]。既往研究表明紫甘薯多糖能增加小鼠Alpha多樣性指數(shù)，增強(qiáng)免疫功能，改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)[23]。本研究結(jié)果顯示Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)及觀察到的物種指數(shù)于各組間均無(wú)明顯差異，提示神闕穴電針治療對(duì)IBS-C大鼠腸道菌群多樣性的改變不明顯。然而，傳統(tǒng)腸道微生物區(qū)系向無(wú)菌大鼠轉(zhuǎn)移的研究表明嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）可以促進(jìn)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。Shen等[25]研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌（Lactobacillus）增加了小鼠糞便菌群中有益細(xì)菌的相對(duì)豐度，改善了糞便菌群的結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示神闕穴電針治療改善了腸道菌群失調(diào)，增加了乳酸桿菌（Lactobacillus）及梭菌屬（Clostridium）豐度，維持了腸道菌群的平衡，促進(jìn)了一些潛在益生菌屬（乳桿菌屬）的出現(xiàn)。本研究與鹽酸洛普酰胺模型大鼠與正常大鼠在腸道菌群多樣性和組成上存在顯著差異的結(jié)果一致[26]。

研究認(rèn)為腸道微生物區(qū)系與腸道通透性增加密切相關(guān)，根據(jù)腦-腸軸理論，當(dāng)腦屏障被破壞時(shí)腸屏障也被破壞，從而影響腸道營(yíng)養(yǎng)吸收及動(dòng)力[27]。C-fos是即刻早期基因的一種，C-fos的基因功能是通過(guò)其所編碼的核蛋白Fos實(shí)現(xiàn)的，多種刺激誘導(dǎo)可使Fos快速表達(dá)[28]。研究表明IBS-C由于內(nèi)臟高敏感性，經(jīng)常有腹痛、腹脹等刺激，使C-fos處于高表達(dá)狀態(tài)[29]，本研究結(jié)果中模型組大鼠C-fos mRNA表達(dá)明顯升高，與其報(bào)道一致。此外，報(bào)道證實(shí)IBS-C大鼠腦干上行轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上多個(gè)部位的C-fos表達(dá)升高，提示IBS-C發(fā)病過(guò)程中高級(jí)神經(jīng)中樞可通過(guò)C-fos參與刺激信號(hào)調(diào)控[30]。Muller等[31]研究顯示腸道微生物群可以調(diào)節(jié)腸道外交感神經(jīng)元，雖然微生物區(qū)系消耗導(dǎo)致C-Fos表達(dá)增加，但用短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌對(duì)無(wú)菌小鼠進(jìn)行定植可以抑制c-Fos在腸道交感神經(jīng)節(jié)的表達(dá)。本研究結(jié)果表明神闕穴電針治療后大鼠C-fos mRNA表達(dá)明顯降低，提示電針治療可能影響C-fos參與腸腦連接，可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)改善IBS-C，而IBS-C大鼠腸菌群的這些變化表明電針治療方法可能是較有效的治療方向。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)電針治療可以調(diào)節(jié)IBS-C大鼠腸道微生物區(qū)系，促進(jìn)有益菌屬如乳酸桿菌的豐度，進(jìn)而可能調(diào)節(jié)胃腸功能障礙以及增加糞便含水量來(lái)緩解IBS-C進(jìn)展。