針刺聯(lián)合藥物治療對腸易激綜合征療效的探索性研究*

楊 敏，李 斌，鄒 燃，鄧 薇，徐派的，李 悅

（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 武漢 430022）

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是一種持續(xù)發(fā)病或間斷發(fā)病的慢性腸道性疾病，發(fā)病癥狀通常表現(xiàn)為腹痛、腹脹、腹部不適、排便不規(guī)律、大便異常等[1]，該病的發(fā)病機(jī)制尚未有系統(tǒng)說明，其病因及誘發(fā)因素囊括了人格特性、精神心理狀態(tài)、飲食習(xí)慣、感染、家族遺傳等多個方面，病變上至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂，下至局部胃腸道神經(jīng)—內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的異常調(diào)節(jié)。在我國，IBS的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響人的正常生活及工作質(zhì)量，給社會帶來較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。IBS可分為腹瀉型、便秘型和混合型。但在某些個體中，IBS可能在感染性疾病后急性發(fā)作并發(fā)展成具有發(fā)燒、嘔吐和腹瀉等特征的綜合征，被稱為感染后腸易激綜合征（Post-infectious irritable bowel syndrome，PI-IBS）[3]。目前，因?yàn)榛瘜W(xué)試劑誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和宿主免疫激活可以在一定程度上模仿IBS的臨床特征，該方式誘導(dǎo)的IBS動物模型已廣泛用于IBS的機(jī)理研究。

在IBS發(fā)病過程的研究中，腦腸軸的重要功能作用愈加受到重視[4]，有研究證明中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)、免疫及內(nèi)分泌機(jī)制參與了腸穩(wěn)態(tài)以及腸管運(yùn)動的調(diào)節(jié)[5]。因此對該病的治療也漸漸從針對終末靶器官消化道，慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)榫裥睦碇委?，其中包含改善腦腸軸穩(wěn)態(tài)的綜合治療，達(dá)到緩解癥狀和改善生活質(zhì)量的治療目標(biāo)。5-HT便是存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的一種腦腸肽，調(diào)節(jié)許多神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，影響各種生物和神經(jīng)過程，例如攻擊、焦慮、情緒等[6-8]。因此，5-HT的穩(wěn)定能夠反映腦腸軸的穩(wěn)態(tài)，從而提示機(jī)體的精神狀態(tài)。

然而，目前IBS臨床治療方式多以對癥用藥處理為主，但存在的缺點(diǎn)較為明顯，用藥后往往出現(xiàn)較大副作用，治療效果不佳。但在中醫(yī)中，“泄瀉”與腸易激綜合征表現(xiàn)的臨床癥狀相似，中醫(yī)臨床治療研究證明針刺、推拿在腸易激綜合征的防治中具有簡、便、廉、驗(yàn)的特點(diǎn)，具有確切的療效[9-10]。因此，本課題以腸易激綜合征動物模型為研究對象，服用蒙脫石散及氟哌噻噸美利曲辛片并結(jié)合以內(nèi)關(guān)、天樞、太沖為主的針刺進(jìn)行治療，闡述針刺三大穴位的治療效果和其聯(lián)合藥物對藥物治療效果的提升作用，探索針刺對腸易激綜合征的潛在治療效果，為臨床上治療IBS的方案提供改進(jìn)方向。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠42只（雄性，6周齡，每只220 g），實(shí)驗(yàn)許可證號：SYXK（鄂）2018-0104；溫度22-26℃，相對濕度50%-60%的飼養(yǎng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，人工光照明暗各12 h。在本次實(shí)驗(yàn)過程中，按照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》等相關(guān)文件標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)與處置。

1.2 試劑

戊巴比妥鈉（貨號P3761，sigma merck公司）；三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS）（貨號C9801，sigma公司）；大鼠5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，大鼠髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（貨號分別為RA20031，RA20325，bio-swamp公司）；伊紅，蘇木素（貨號分別為C0109，C0107，碧云天公司）；Masson三色染色試劑盒（貨號G1340，Solarbio公司）；中性樹脂（貨號S30509，源葉公司）；甲苯胺藍(lán)染色液（貨號G1032，Servicebio公司）；化學(xué)發(fā)光試劑（貨號MFA5310，rongbai公司）。

1.3 儀器

電子天平（型號FB124，舜宇公司）；顯微剪，顯微鑷（型號分別為WA1020，WA3040，金鐘公司）；酶標(biāo)分析儀，酶標(biāo)洗板機(jī)（型號分別為AMR-100，APW-200，杭州奧盛公司）；正置顯微鏡（型號JZYQ，皆準(zhǔn)公司）；石蠟切片機(jī)（型號API-365，艾普公司）；攤片烤片機(jī)，生物組織包埋機(jī)-冷凍機(jī)（型號分別為TK7218，HS-B，恒松公司）；生物組織包埋機(jī)（型號KH-BL1，孝感闊海公司）；自動組織脫水機(jī)（型號ZT-12P2，亞光病理公司）；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（型號FST-I-05，普力菲爾公司）

2 方法

2.1 大鼠腸易激綜合征模型的構(gòu)建

將大鼠分為對照組（6只）和IBS模型組（36只），實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食24 h，采用2%戊巴比妥鈉按照0.2 mL·100 g-1的劑量腹腔注射麻醉深度麻醉。參照Qin等[11]的方法對模型組進(jìn)行造模，模型組大鼠于離肛門處8 cm，將細(xì)塑料導(dǎo)管進(jìn)入降結(jié)腸，大鼠頭部向下垂直放置，1 min內(nèi)緩慢給予50 mg TNBS，灌注后留置導(dǎo)管1 min后緩慢取出。對照組大鼠以相同方法給予相同體積生理鹽水灌注。造模1周后將對照組大鼠與3只IBS模型組大鼠麻醉，取結(jié)腸組織，通過結(jié)腸潰瘍和炎癥肉眼評分、結(jié)腸組織中5-羥色胺及大鼠髓過氧化物酶含量進(jìn)行模型鑒定。與對照組相比，IBS模型組結(jié)腸潰瘍評分均為4，結(jié)腸組織中5-羥色胺及大鼠髓過氧化物酶含量明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05），表明IBS模型復(fù)制成功。

2.2 分組治療

除設(shè)置6只健康大鼠為空白對照組外，將建模成功的36只大鼠隨機(jī)分為6組：IBS模型組、藥物治療A組、針刺組、藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組、藥物治療A+B+針刺組。對照組和IBS模型組每天灌胃生理鹽水；藥物治療A組每天給予蒙脫石散灌胃25 mg·kg-1·d-1，連續(xù)2周；針刺組參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位，將大鼠捆綁后，取內(nèi)關(guān)、天樞和太沖穴，每穴斜刺0.7 mm，并穴位旁開5 mm平刺，接電針。電刺參數(shù)為疏密波，頻率2-100 Hz，強(qiáng)度0.1-0.2 mA，以肌肉微微顫動為度，每次20 min，每天1次，連續(xù)2周；藥物治療A+針刺組每天給予蒙脫石散灌胃25 mg·kg-1·d-1，并以內(nèi)關(guān)、天樞、太沖電針，連續(xù)2周。藥物治療A+B組每天給予蒙脫石散灌胃25 mg·kg-1·d-1，氟 哌 噻 噸 美 利 曲 辛 片 灌 胃0.056 mg·kg-1·d-1，連 續(xù)2周。藥物治療A+B+針刺組每天給予蒙脫石散灌 胃25 mg·kg-1·d-1，氟 哌 噻 噸 美 利 曲 辛 片 灌 胃0.056 mg·kg-1·d-1，并以內(nèi)關(guān)、天樞、太沖電針，連續(xù)2周。給藥14 d后，麻醉后腹主動脈取血，取腦和結(jié)腸。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 一般行為學(xué)觀察

密切觀察大鼠的精神、活動變化、毛發(fā)潤澤度及體重增長變化等。

2.3.2 結(jié)腸潰瘍和炎癥肉眼評分

按照表1中的標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠的臨床表現(xiàn)進(jìn)行評分。

表1 結(jié)腸潰瘍和炎癥肉眼評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3.3 AWR評分

參照Elie等[9]的方法進(jìn)行檢測，2周治療后，大鼠禁食24 h、不禁水，麻醉后固定，用PTCA固定橡膠球囊，插入肛門6 cm并固定。大鼠蘇醒后給球囊充氣加壓，初壓約20 mmHg，壓力遞升20 mmHg直至80 mmHg，每個壓力觀察20 s，期間休息至少5 min，根據(jù)大鼠腹部回縮反射（見表2）進(jìn)行AWR評分。

表2 AWR評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3.4 生化檢測結(jié)腸組織中5-HT、MPO含量

根據(jù)大鼠5-HT酶聯(lián)免疫分析試劑盒和大鼠MPO酶聯(lián)免疫分析試劑盒的說明書，以空白組大鼠作為對照，對IBS模型組大鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行檢測。

2.3.5 蘇木精-伊紅染色法及Masson觀察結(jié)腸組織變化

將固定好的結(jié)腸組織切取0.3 cm的厚度，按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋，切片厚度為3 μm，水浴展片，撈片，將切片小心貼附于載玻片上，控片，然后將切片放入展片器展片，貼平粘緊后烤片。根據(jù)蘇木精-伊紅染色法及Masson三色染色試劑盒的步驟對組織切片進(jìn)行染色，通過顯微鏡拍照，Leica Application Suite 圖象系統(tǒng)采集樣本相關(guān)部位。

2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較使用單因素方差分析，P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況比較

在造模過程中，空白組的大鼠精神食欲良好、活動正常、毛色光滑潤澤；模型組在造模后逐漸出現(xiàn)精神狀態(tài)差、食欲減退、毛色干燥。造模結(jié)束后，對照組的體重增長良好，而模型組的體重不斷下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05）（見表3和圖1）。結(jié)束造模后開展治療，藥物治療A組、針刺組、藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組、藥物治療A+B+針刺組各組在治療后精神狀態(tài)、活動情況以及毛色得到好轉(zhuǎn)。與對照組相比，IBS模型組體重增長z值低，差異顯著（P〈0.05）；藥物治療A組、針刺組、藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組體重增長值與對照組相比較低，但比IBS模型組要高；藥物治療A+B+針刺組體重增長值明顯高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05）。

表3 各組大鼠體重增長值比較

圖1 各組大鼠體重增長值比較

3.2 各組大鼠治療后結(jié)腸潰瘍和炎癥肉眼評分比較與AWR評分比較

結(jié)果（表4、圖2和圖3）顯示，IBS模型組的肉眼評分顯著高于空白對照組（P〈0.05）；藥物治療A組、針刺組、藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組的肉眼評分高于空白對照組，但顯著低于IBS模型組；藥物治療A+B+針刺組的肉眼評分與空白對照組相同，顯著低于IBS模型組（P〈0.05）。IBS模型組的AWR評分顯著高于空白對照組（P〈0.05）；藥物治療A組、針刺組、藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組的AWR評分高于空白對照組，但顯著低于IBS模型組；藥物治療A+B+針刺組的肉眼評分與空白對照組相同，顯著低于IBS模型組（P〈0.05）。

表4 各組大鼠治療后肉眼評分與AWR評分比較

圖2 各組大鼠結(jié)腸潰瘍和炎癥肉眼評分比較

圖3 各組大鼠治療后AWR評分比較

3.3 治療后結(jié)腸組織中5-HT及MPO含量的比較

如表5、圖4和圖5結(jié)果所示，與空白對照組相比，IBS模型組中5-HT和MPO含量顯著升高，約為3倍和4倍；藥物治療A組和針刺組顯著高于空白組，低于IBS模型組；藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組顯著高于對照組，低于IBS模型組、藥物治療A組和針刺組；藥物治療A+B+針刺組高于對照組，但顯著低于其余各組。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織中5-HT含量

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織中MPO含量

表5 各組大鼠治療后5-HT與MPO含量評分比較

3.4 結(jié)腸組織HE染色及Masson染色結(jié)果

HE染色結(jié)果（圖6）顯示，與空白對照組相比，IBS模型組的結(jié)腸組織中有明顯的致密炎性細(xì)胞浸潤，各治療組在治療后炎性細(xì)胞明顯減少；Masson染色結(jié)果（圖7）顯示，與空白對照組相比，IBS模型組及其余各組的結(jié)腸組織粘膜下層和平滑肌中有大量膠原蛋白，細(xì)胞發(fā)生了纖維化。

圖6 HE染色結(jié)果

圖7 馬松染色結(jié)果

4 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球人群的IBS患病率估計(jì)值在7%-21%，而我國普通人群IBS總體患病率為1.4%-11.5%[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，中青年患病率最高，且IBS患者中焦慮、抑郁發(fā)生率較健康人群明顯升高，猜測是受到不斷加快的生活節(jié)奏與不斷增加的社會壓力的影響[14-15]。因此，對IBS有效的治療方法的研究具有重要作用。

IBS在中醫(yī)理論研究中，其發(fā)病位于大腸，病理因素主要是濕，病變臟腑主要在脾，與肝、胃關(guān)系較為密切，脾虛濕盛是導(dǎo)致其發(fā)病的關(guān)鍵因素，患者極易因飲食寒涼或情緒抑郁時(shí)發(fā)病，屬于“泄瀉”、“腹痛”和“郁證”的范疇[16-17]。從中醫(yī)角度來說“泄瀉”包含了IBS，而泄瀉常常與腸道、胃部密切相關(guān)。在中醫(yī)臨床診斷治療“泄瀉”時(shí)，并非采取服用藥物的方式，而是通過調(diào)理腸胃這兩大臟器使“泄瀉”能得到有效的控制。目前中醫(yī)針對“泄瀉”已有較多的研究，其中針灸是其有效且便利的方式[18]。針灸屬于中醫(yī)的一部分，在針灸的過程中對穴位進(jìn)行針刺，針刺產(chǎn)生疼痛感覺并通過作用到皮膚下的穴位將機(jī)體的疼痛集中于一點(diǎn)，對局部的穴位刺激，最終將直接導(dǎo)致局部血管的擴(kuò)張的目的，促使機(jī)體產(chǎn)生自愈反應(yīng)，以調(diào)節(jié)臟腑功能[19]。針灸的基礎(chǔ)是機(jī)體的自適應(yīng)能力，而氣穴就在這當(dāng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。祖國醫(yī)學(xué)的研究里，內(nèi)關(guān)穴主治胃、心、胸疾病，有益心安神、理氣和胃之功；天樞穴為足陽明經(jīng)要穴、大腸募穴，是臟腑經(jīng)氣輸注和匯聚于胸腹部的腧穴，有理氣調(diào)中，健脾和胃功效；太沖穴可使脾陽得助，升清降濁，胃腸氣機(jī)調(diào)暢，泄瀉乃止[20-21]。本研究則是根據(jù)針灸的治療理論中針刺的部分進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用電針內(nèi)關(guān)、天樞、太沖三個穴位進(jìn)行針刺治療。

為了檢測針刺對IBS的治療效果，我們進(jìn)行了對實(shí)驗(yàn)小鼠的AWR評分與5-HT和MPO的濃度檢測。AWR評分在許多研究中被用于檢測IBS模型大鼠的內(nèi)臟敏感程度及內(nèi)臟平滑肌收縮情況[22]。本研究顯示針刺治療組能減少回撤反射，在與藥物同用時(shí)能發(fā)揮最佳效果，說明針刺內(nèi)關(guān)、天樞、太沖穴位治療IBS效果良好。這和先前報(bào)導(dǎo)的能通過類似的方法對天樞、關(guān)元、足三里等穴位改善IBS大鼠腹瀉癥狀的研究相一致[23]。5-HT作為調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動的神經(jīng)遞質(zhì)，能夠顯示腸道的運(yùn)動狀態(tài)[24]。有研究表明，經(jīng)TNBS誘導(dǎo)的大鼠IBS模型中，大鼠結(jié)腸組織的EC細(xì)胞數(shù)量增多，其血漿中的5-HT含量也隨之增多[25]。MPO是一種在嗜中性粒細(xì)胞中表達(dá)的含血紅素的過氧化物酶，是組織損傷和各種炎性疾病的炎癥局部介質(zhì)，能夠反映腸道結(jié)腸組織的炎癥狀況[26-27]。因此，結(jié)腸組織內(nèi)的5-HT和MPO濃度能夠反應(yīng)結(jié)腸組織的腸易激綜合癥的狀況[28]。本研究中采用ELISA方法對各組大鼠結(jié)腸組織中5-HT和MPO的含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示各治療組能有效降低結(jié)腸組織中5-HT和MPO含量，針刺與藥物治療同時(shí)進(jìn)行時(shí)二者含量降低明顯。同時(shí)，在結(jié)腸組織的病理切片HE染色檢測中，也能明顯觀察到IBS模型組中的炎性細(xì)胞明顯增多，在經(jīng)過分組治療后，炎性細(xì)胞減少；Masson染色則顯示與對照組相比，模型組與治療組的結(jié)腸組織中膠原蛋白明顯增多。已有研究顯示，類似的許多針刺手法能夠顯著改善患者血清5-HT、VIP、SP水平及臨床癥狀，其中包括：穴位埋線治療、電溫針療法、局部與遠(yuǎn)端取穴治療和眼針治療等[29-30]。

近年來的研究表明，腦腸肽如5-HT、SP、血管活性腸肽（Vasoactive intestinal peptide，VIP）、胃動素（Motilin，MTL）、膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK）等的異常表達(dá)可導(dǎo)致內(nèi)臟的高度敏感性，進(jìn)而引起胃腸動力紊亂，促使IBS的發(fā)病，對腦腸肽等進(jìn)行調(diào)節(jié)干預(yù)則是治療腸易激綜合征的一個重要方向。陳祥林等[31]研究發(fā)現(xiàn)針刺治療IBS的療效機(jī)制之一是通過神經(jīng)內(nèi)分泌途徑影響神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，即通過腦腸軸有效調(diào)節(jié)腦腸肽的分泌。在我們的研究結(jié)果中也顯示，針刺和針刺聯(lián)合藥物處理后，腦腸肽5-HT含量也穩(wěn)定下來，驗(yàn)證了針刺能夠通過影響腦腸軸發(fā)揮作用，能夠猜測針刺及其聯(lián)合藥物的治療方法能夠從神經(jīng)和心理方面起到一定的治療作用。

盡管本研究能夠初步展示針刺及其聯(lián)合藥物的干預(yù)方式能夠起到一定的治療作用，但在后續(xù)的應(yīng)用探究實(shí)驗(yàn)中我們也會開展更多的相關(guān)研究，并添加設(shè)置假藥物組、假針刺組等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，更為詳盡與嚴(yán)謹(jǐn)?shù)貙︶槾碳奥?lián)合藥物這一治療方式的治療效果進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，電針內(nèi)關(guān)、天樞、太沖穴位配合藥物治療能有效改善腸易激綜合征所致的結(jié)腸炎癥和內(nèi)臟敏感性，提示針刺聯(lián)合藥物治療可能有能夠提高腸易激綜合征療效的作用，啟發(fā)針刺聯(lián)合藥物治療對腸易激綜合征的臨床應(yīng)用。