基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡藥理學的左右半結(jié)腸癌中醫(yī)組方用藥規(guī)律差異及作用機制研究*

莊振杰，謝靜怡，朱 泳，羅麗霞，劉展華

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 廣州 510405）

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康。流行病學數(shù)據(jù)顯示，全球結(jié)直腸癌年發(fā)病率和死亡率分別位居所有癌種的第四位和第二位，疾病負擔日趨沉重[1]。由于左右半結(jié)腸癌具有不同的生物學特性，兩者在臨床表現(xiàn)、分子生物學特征等多方面具有較大差異，因此學界有觀點認為左、右半結(jié)腸癌應被視作兩種不同類型的實質(zhì)疾病[2]。臨床上，左半結(jié)腸癌的病理類型以高度及中度分化的腺癌為主，預后相對較好；右半結(jié)腸癌病理類型多見低分化的腺癌、粘液腺癌和印戒細胞癌，預后較差?；贏IO KRK-010[3]、NCIC CO.17[4]及FIRE-3[5]等臨床研究結(jié)果，自2017年起，美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南將抗EGFR治療（西妥昔單抗和帕尼單抗）僅推薦用于KRAS/NRAS野生型的左半結(jié)腸癌，標志著左右半腸癌臨床用藥決策上進入了新階段。然而，中醫(yī)學對左右半結(jié)腸癌辨證施治的組方用藥規(guī)律尚鮮有報道，有待進一步研究。

近年來研究表明，左右半結(jié)腸癌的中醫(yī)證型特點和癥候要素具有一定的差異。王威[6]對151例結(jié)腸癌患者的中醫(yī)證型特點分析表明，左半結(jié)腸癌以痰濕內(nèi)停證為主，晚期右半結(jié)腸癌以脾腎陽虛證為主。吳桂彬[7]研究指出，左半結(jié)腸癌多見氣滯血瘀證及濕熱蘊結(jié)證，而右半結(jié)腸癌多見脾腎陽虛證及氣血兩虛證。

辨證論治是中醫(yī)的精髓，“方從法出，法隨證立”，不同的證型和癥候特點決定了左右半結(jié)腸癌在方藥使用上必然存在一定的差異。因此，左右半結(jié)腸癌的中醫(yī)組方用藥的差異及內(nèi)涵值得進一步探究。同時，由于中藥治療疾病具有“多成分-多靶點”的作用特點，中醫(yī)藥治療結(jié)腸癌的作用機制也仍有待進一步的研究。值得慶幸的是，真實世界中臨床的診療數(shù)據(jù)積累及數(shù)據(jù)挖掘技術在中醫(yī)藥領域的應用[8]及網(wǎng)絡藥理學技術的興起[9]，為透過大數(shù)據(jù)探尋中醫(yī)藥防治左、右半結(jié)腸癌的方藥規(guī)律及相關作用機制奠定了基礎。

本研究旨在基于“左右半結(jié)腸癌是兩種不同實質(zhì)性疾病”的學術觀點，應用廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院住院系統(tǒng)數(shù)據(jù)，挖掘分析左右半結(jié)腸癌組方用藥規(guī)律，同時借助生物信息學及網(wǎng)絡藥理學技術對典型的方藥進行作用機制的探索，為中醫(yī)藥對結(jié)腸癌實施精準治療及防治結(jié)腸癌的基礎研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

2017.1.1-2020.6.30于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心、胃腸外科及肛腸外科住院部被確診為結(jié)腸惡性腫瘤患者的中醫(yī)臨床診療信息。納入本研究的中藥處方數(shù)據(jù)均由腫瘤專科主任中醫(yī)師開具。數(shù)據(jù)收集經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，倫理文件編號：NO.JY【2020】129。

1.2 標準

1.2.1 納入標準

①確診為結(jié)腸惡性腫瘤患者；右側(cè)結(jié)腸標準：右側(cè)結(jié)腸包括盲腸、升結(jié)腸、結(jié)腸肝區(qū)、橫結(jié)腸；左側(cè)結(jié)腸包括結(jié)腸脾區(qū)、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸；②患者病歷資料完善者：具備患者的基本信息、中醫(yī)診斷、西醫(yī)診斷、中醫(yī)方藥信息、腫瘤分期（TMN及臨床分期）、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤病理及轉(zhuǎn)移部位。

1.2.2 排除標準

符合以下條件之一者則排除研究對象：①不符合原發(fā)性結(jié)腸癌診斷標準的患者；②所需觀察的臨床病歷信息記載不完整；③合并有嚴重心腦血管、肝、腎疾病及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的患者；④確診但是為結(jié)腸外雙原發(fā)（及以上）腫瘤患者；⑤確診但于外院接受過放化療、靶向及免疫治療的患者。

1.3 統(tǒng)計方法與數(shù)據(jù)分析

1.3.1 臨床數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫構建

篩選后共錄入383首處方，由兩名研究者對住院病歷系統(tǒng)進行錄入，并參照《中華人民共和國藥典》（2015版）進行藥物規(guī)范化處理（如熟黨參統(tǒng)計為黨參；人參片統(tǒng)一為人參）。另一研究者對數(shù)據(jù)進行核查校對。

1.3.2 中藥頻次計算

將方藥數(shù)據(jù)庫中所有藥物進行匯總，計算各藥物出現(xiàn)的頻次，篩選出頻次前15的藥物進行展示。應用R軟件4.0 base包的table函數(shù)進行頻次計算。

1.3.3 方藥聚類分析

通過對左、右半結(jié)腸癌方藥數(shù)據(jù)進行整理清洗，分別篩選使用頻次大于整體中藥平均頻次的藥物，使用R軟件包apcluster[10]評估最佳聚類數(shù)，使用R軟件包cluster[11]進行K-means聚類分析，迭代10 000次以確定最佳聚類種子數(shù)。最后使用R軟件包factoextra①* Kassambara A, Mundt F（2020). _factoextra: Extract and Visualize the Results of Multivariate Data Analyses_. R package version 1.0.7 （未出版）*進行聚類結(jié)果可視化。

1.3.4 藥物關聯(lián)性分析

應用R語言arules包[12]進行關聯(lián)規(guī)則分析?；赼rules包interestMeasure函數(shù)對關聯(lián)規(guī)則結(jié)果行卡方檢驗，同時結(jié)合Apriori關聯(lián)規(guī)則算法中如下指標對中藥組合關聯(lián)度進行綜合評價，并使用Cytoscape 3.7.2[13]進行關聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡可視化。

①支持度（support）：

支持度即支持的程度，在本研究中，指在所有的藥物中同時出現(xiàn)中藥X和中藥Y的概率，即P(XY)。支持度揭示了藥物X和藥物Y同時出現(xiàn)的頻率，如果X和Y一起出現(xiàn)的頻率非常小，則表明了X和Y之間的關聯(lián)并不大；反之則說明X和Y總是相關聯(lián)性強。

②置信度（confidence）：

置信度也稱為可靠度，在本研究中，置信度表示藥物之間關聯(lián)的可信度，指在所有中藥中在中藥X出現(xiàn)的情況下中藥Y出現(xiàn)的概率，即P(Y|X)。

③提升度（lift）：

在本研究中，提升度表示關聯(lián)規(guī)則在出現(xiàn)中藥X的條件下，同時出現(xiàn)中藥Y的概率，提升度體現(xiàn)的是中藥X和Y之間的關聯(lián)關系強度, 提升度大于1則表明X→Y是有效的強關聯(lián)規(guī)則，提升度小于等于1則表明X→Y是無效的強關聯(lián)規(guī)則。

本研究篩選同時滿足以下標準的方藥關聯(lián)規(guī)則作為左右半結(jié)腸癌方藥矩陣的核心關聯(lián)規(guī)則：①關聯(lián)規(guī)則經(jīng)卡方檢驗，所得P〈 0.01；②關聯(lián)規(guī)則支持度 〉 矩陣平均支持度；③關聯(lián)規(guī)則置信度 〉 矩陣平均置信度；④關聯(lián)規(guī)則提升度 〉 1。

1.4 網(wǎng)絡藥理學分析

1.4.1 研究對象

通過藥物關聯(lián)規(guī)則算法分析得到治療左、右半結(jié)腸癌的關聯(lián)參數(shù)均值最優(yōu)的代表性方藥，將左右半結(jié)腸癌代表性方藥進行比對，選取各自的代表性“角藥”組合作為研究對象。左半結(jié)腸癌方藥研究對象為“半枝蓮-法半夏-陳皮”，右半結(jié)腸癌方藥研究對象為“地榆-生甘草-槐花”。

1.4.2 左、右半結(jié)腸癌疾病相關基因靶點獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫①* https://www.genecards.org/*[14]中以“Colon Cancer”為檢索關鍵詞，獲取結(jié)腸癌疾病相關靶點。使用R軟件包TCGAbiolinks[15]下載癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫②** https://www.tcga.org/**中的結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床信息數(shù)據(jù)，以結(jié)腸癌原發(fā)部分的左右作為主要分層因素。使用R軟件包DESeq2[16]對左、右半結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)同癌旁正常組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)行差異表達分析，以分別篩選左、右半結(jié)腸癌的差異基因。篩選閾值設定為P-adjust＜0.05&|log2FC|≥1。

1.4.3 典型方藥藥物成分及基因靶點信息獲取

從Batman-TCM[17]數(shù)據(jù)庫③*** http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php***中收集左、右半結(jié)腸癌典型方藥成分的化合物和靶基因。以數(shù)據(jù)庫官方提供的默認閾值作為篩選標準，篩選藥物成分及其靶點數(shù)據(jù)。

1.4.4 藥物-成分-疾病核心基因靶點網(wǎng)絡構建

將左、右半結(jié)腸癌典型方藥的藥物靶點分別同左、右半結(jié)腸癌疾病靶點基因進行匹配映射，使用Cytoscape 3.7.2[13]構建藥物-成分-疾病核心基因靶點網(wǎng)絡。使用Degree（連接度）篩選典型方藥治療結(jié)腸癌的關鍵成分和靶點。

1.4.5 典型方藥治療結(jié)腸癌基因靶點蛋白互作網(wǎng)絡構建

將典型方藥的治療左、右半結(jié)腸癌的靶點基因分別輸入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫中④**** https://string-db.org/****構建蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡。

1.4.6 典型方藥治療結(jié)腸癌核心基因靶點的生物信息學注釋

使用R軟件包ClusterProfiler[18]對典型方藥治療結(jié)腸癌靶點基因進行基因本體分析（Gene Ontology，GO）及KEGG通路分析。將設置注釋物種設置為“hsa”（人類），將P值閾值設置為0.01，僅納入P.adjust值≤0.01的結(jié)果，并對結(jié)果按富集基因總數(shù)從大到小進行排序，并對排序前5的GO條目及排序前10的KEGG通路進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 左、右半結(jié)腸癌中藥藥味分析

2.1.1 左、右半結(jié)腸癌典型藥味分析

左右半結(jié)腸癌方藥數(shù)據(jù)藥物共270味。其中，左半結(jié)腸癌使用的中藥味數(shù)為220味，中藥的總頻數(shù)為2932，藥物平均頻數(shù)為13.33次，使用頻數(shù)大于平均頻數(shù)的藥物為48味；右半結(jié)腸癌使用中藥共226味，藥物總頻數(shù)為2404，藥物平均頻次為10.64次，使用頻數(shù)大于平均頻數(shù)的藥物為57味。本研究將使用頻次大于所在分組平均頻次的藥物，作為左、右結(jié)腸癌治療應用的典型藥味。進一步分析表明（圖1），左、右半結(jié)腸癌典型藥味中共有44味藥物為共同使用藥物。

圖1 左右半結(jié)腸癌典型藥味韋恩圖

卡方檢驗分析結(jié)果表明，左、右半結(jié)腸癌方藥在桃仁（36.2% VS 25.3%）、柴胡（17.4% VS 32.4%）、地榆（29.1% VS 14.7%）、龍葵（18.3% VS 10%）4味典型藥物的使用上具有顯著統(tǒng)計學差異（P〈 0.05）。見表1。

表1 左、右半結(jié)腸癌使用具有統(tǒng)計學差異的共同典型藥物

左半結(jié)腸癌獨有的典型藥物包括預知子、壁虎、葛根及雞血藤4味，右半結(jié)腸癌獨有的典型藥物包括澤瀉、黃芩、女貞子及延胡索等12味。見表2。

表2 左、右半結(jié)腸癌獨有典型藥物

2.2 左、右半結(jié)腸癌藥物聚類分析

2.2.1 左半結(jié)腸癌藥物聚類分析結(jié)果

左半結(jié)腸癌方藥矩陣R軟件包apcluster[10]推薦最佳聚類數(shù)為18，聚類結(jié)果見表3，聚類分布見圖2(a)。

表3 左半結(jié)腸癌方藥核心組合

2.2.2 右半結(jié)腸癌藥物聚類分析結(jié)果

右半結(jié)腸癌方藥矩陣，R軟件包apcluster[10]推薦最佳聚類數(shù)亦為18。聚類結(jié)果見表4，聚類分布見圖2(b)。

圖2 左右半結(jié)腸癌方藥聚類分布

表4 右半結(jié)腸癌方藥核心組合

2.3 左、右半結(jié)腸癌藥物關聯(lián)分析

2.3.1 左、右半結(jié)腸癌方藥關聯(lián)規(guī)則結(jié)果概況

基于Apriori關聯(lián)規(guī)則算法計算獲得左半結(jié)腸癌關聯(lián)規(guī)則共2320條，右半結(jié)腸癌關聯(lián)規(guī)則共1015條。經(jīng)篩選，最終獲得左半結(jié)腸癌核心關聯(lián)規(guī)則22條，右半結(jié)腸癌關聯(lián)規(guī)則37條。

2.3.2 左半結(jié)腸癌方藥關聯(lián)規(guī)則

符合篩選標準的左半結(jié)腸癌方藥關聯(lián)規(guī)則共22條，其中藥對規(guī)則2條，角藥規(guī)則6條，其余組方規(guī)則14條（藥味為四規(guī)則9條，藥味為五規(guī)則4條，藥味為六規(guī)則1條）。其中，支持度、置信度及提升度3項參數(shù)均值最高的藥對及角藥規(guī)則分別為{山慈菇} =〉 {白術}（參數(shù)均值：0.82）及{半枝蓮,法半夏} =〉 {陳皮}（參數(shù)均值：0.94）。見表5。

表5 左半結(jié)腸癌方藥核心關聯(lián)規(guī)則

2.3.3 右半結(jié)腸癌方藥關聯(lián)規(guī)則

符合篩選標準的右半結(jié)腸癌方藥關聯(lián)規(guī)則共37條，其中藥對規(guī)則5條，角藥規(guī)則23條，其余組方規(guī)則9條（藥味為四規(guī)則8條，藥味為五規(guī)則1條）。其中，支持度、置信度及提升度3項參數(shù)均值最高的藥對及角藥規(guī)則分別為{茯苓} =〉 {白術}（參數(shù)均值：0.83）及{地榆,生甘草} =〉 {槐花}（參數(shù)均值：1.25）。見表6。

表6 右半結(jié)腸癌方核心關聯(lián)規(guī)則

3 核心配伍機制探討

3.1 左、右半結(jié)腸癌潛在藥物作用靶點獲取

3.1.1 左、右半結(jié)腸癌差異基因鑒定

本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫共獲得521個結(jié)腸癌樣本數(shù)據(jù)（腫瘤樣本480個，癌旁樣本41個）。其中根據(jù)臨床信息劃分左右半結(jié)腸癌的腫瘤樣本共計451個（左半結(jié)腸癌樣本186個，右半結(jié)腸癌樣本265個）。分別將左、右半結(jié)腸癌樣本與癌旁組織進行差異分析以鑒定差異基因，最終獲得左半結(jié)腸癌差異基因5636個，右半結(jié)腸癌差異基因5294個，兩者共同差異基因4670個。左半結(jié)腸癌獨有差異基因966個，右半結(jié)腸癌獨有差異基因624個，這些獨有的差異基因是介導左、右半結(jié)腸癌不同生物學特征的重要生物學基礎。見圖3。

圖3 左、右半結(jié)腸癌差異基因鑒定

3.1.2 左、右半結(jié)腸癌疾病相關基因靶點鑒定

以“Colon Cancer”為關鍵詞從Genecards數(shù)據(jù)庫下載獲得結(jié)腸癌相關疾病基因共4916個。將其分別3.1.1中分析得到的左、右半結(jié)腸癌獨有的差異基因分別進行取交集，最終得到左半結(jié)腸癌疾病相關基因共234個；右半結(jié)腸癌疾病相關基因共143個。這些差異基因可作為左、右半結(jié)腸癌典型方藥治療結(jié)腸癌的潛在藥物靶點。見圖4。

圖4 左、右半結(jié)腸癌疾病相關基因韋恩圖

3.2 左半結(jié)腸癌典型方藥治療左半結(jié)腸癌的網(wǎng)絡藥理學分析

3.2.1 左半結(jié)腸癌典型方藥成分及作用靶點數(shù)目

從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫分別獲取中藥半枝蓮、半夏、陳皮的藥物成分及作用靶點數(shù)據(jù)。共獲得半枝蓮藥物成分3個，靶點39個；半夏藥物成分25個，靶點1111個；陳皮成分332個，靶點603個。去重后共獲得藥物成分60個，靶點1328個。

3.2.2 左半結(jié)腸癌典型方藥治療左半結(jié)腸癌的靶點鑒定

通過構建左半結(jié)腸癌典型方藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡，最終共鑒定得左半結(jié)腸癌典型方藥治療左半結(jié)腸癌涉及半枝蓮主要成分1個，作用于2個疾病靶點；半夏主要成分17個，作用于28個疾病靶點；陳皮主要成分24個，作用于15個疾病靶點。所有藥物主要成分去重后共計42個，藥物-疾病靶點去重后共計33個。

左半結(jié)腸癌典型方藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡分析表明，網(wǎng)絡中共有79個節(jié)點，194條相互作用關系。見圖5。Degree排序靠前的藥物成分為麻黃素（Ephedrine），γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid），葫蘆巴堿（Trigonelline）等，這些成分在網(wǎng)絡中具有重要作用，可作為左半結(jié)腸癌典型方藥抗癌治療的關鍵成分。見表7。

圖5 左半結(jié)腸癌典型方藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡

表7 左半結(jié)腸癌典型方藥關鍵藥物成分信息

3.2.3 左半結(jié)腸癌典型方藥治療左半結(jié)腸癌的靶點PPI網(wǎng)絡分析

將左半結(jié)腸癌典型方藥“半枝蓮-法半夏-陳皮”治療左半結(jié)腸癌的靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構建靶點PPI網(wǎng)絡。見圖6。Degree排序靠前的靶點為ESR1，KITLG及FASLG等，表明這些基因在網(wǎng)絡中具有重要地位，為“半枝蓮-法半夏-陳皮”有效成分作用的核心靶點基因。見表8。

圖6 左半結(jié)腸癌典型方藥抗癌治療靶點PPI網(wǎng)絡

表8 左半結(jié)腸癌典型方藥治療左半結(jié)腸癌核心靶點

3.2.4 左半結(jié)腸癌典型方藥治療左半結(jié)腸癌的靶點生物信息學注釋

通過對“半枝蓮-法半夏-陳皮”治療左半結(jié)腸癌靶點進行GO和KEGG注釋。共計獲得GO條目條，含生物學過程（biological process，BP）141條，細胞組分（cellular component，CC）9條，分子功能（Molecular function，MF）10條，獲得KEGG通路條目124條。結(jié)果表明，“半枝蓮-法半夏-陳皮”治療左半結(jié)腸癌主要涉及的生物學過程（BP），主要包括氧水平反應、肽鏈內(nèi)切酶活性調(diào)節(jié)及凋亡信號通路調(diào)控；涉及的細胞組分（CC）主要包括囊腔、膜區(qū)域及膜筏。涉及的分子功能（MF）主要包括細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性及轉(zhuǎn)錄輔因子結(jié)合。見圖7。

圖7 左半結(jié)腸癌典型方藥治療左半結(jié)腸癌靶點GO富集條形圖

KEGG富集結(jié)果表明，“半枝蓮-法半夏-陳皮”治療左半結(jié)腸癌靶點主要富集于MAPK信號通路、RAS信號通路及PI3K-AKT信號通路。見圖8。

圖8 左半結(jié)腸癌典型方藥治療左半結(jié)腸癌靶點KEGG富集高級氣泡圖

3.3 右半結(jié)腸癌典型方藥治療右半結(jié)腸癌的網(wǎng)絡藥理學分析

3.3.1 右半結(jié)腸癌典型方藥成分及作用靶點數(shù)目

從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫分別獲取中藥地榆、生甘草、槐花的藥物成分及作用靶點數(shù)據(jù)。共獲得符合篩選標準的其中地榆藥物成分14個，靶點496個；生甘草藥物成分75個，靶點691個；槐花成分4個，靶點366個。去重后共獲得藥物成分92個，靶點1022個。

3.3.2 右半結(jié)腸癌典型方藥治療右半結(jié)腸癌的靶點鑒定

通過構建右半結(jié)腸癌典型方藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡，最終共鑒定得到右半結(jié)腸癌典型方藥治療右半結(jié)腸癌涉及地榆主要成分6個，作用于8個疾病靶點；甘草主要成分16個，作用于9個疾病靶點；槐花主要成分2個，作用于7個疾病靶點。所有藥物主要成分去重后共計23個，藥物-疾病靶點去重后共計15個。

右半結(jié)腸癌典型方藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡分析表明，網(wǎng)絡中共有42個節(jié)點，78條相互作用關系（圖9）。Degree排序靠前的藥物成分為白樺脂醇（Betulin）及熊果酸（Ursolicacid）等，這些成分在網(wǎng)絡中具有重要作用，可作為右半結(jié)腸癌典型方藥抗癌治療的關鍵成分。見表9。

圖9 右半結(jié)腸癌典型方藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡

表9 右半結(jié)腸癌典型方藥關鍵藥物成分信息

3.3.3 右半結(jié)腸癌典型方藥治療右半結(jié)腸癌的靶點PPI網(wǎng)絡分析

右半結(jié)腸癌典型方藥“地榆-生甘草-槐花”治療右半結(jié)腸癌的靶點PPI網(wǎng)絡（見圖10）中共有15節(jié)點和11條相互作用關系。網(wǎng)絡中介性（Betweenness）平均值為0.17，緊密度（Closeness）為0.44，Degree平均值為2.2。Degree排序靠前的靶點為MAPK3，IFNG及PTGS2等，表明這些基因在網(wǎng)絡中具有重要地位，為“地榆-生甘草-槐花”有效成分作用的核心靶點基因。見表10。

圖10 右半結(jié)腸癌典型方藥抗癌治療靶點PPI網(wǎng)絡

表10 右半結(jié)腸癌典型方藥治療右半結(jié)腸癌核心靶點

3.3.4 右半結(jié)腸癌典型方藥治療右半結(jié)腸癌的靶點生物信息注釋

通過對“地榆-生甘草-槐花”治療右半結(jié)腸癌靶點進行GO和KEGG注釋。共計獲得GO條目條（見圖11），含BP 316條，CC 23條，MF 30條，獲得KEGG通路條目154條。結(jié)果表明“地榆-生甘草-槐花”治療右半結(jié)腸癌靶點涉及的生物學過程（BP）主要包括類固醇代謝過程、防御反應的正向調(diào)控及炎癥反應的正向調(diào)控；涉及的細胞組分主要包括核膜、膜區(qū)域及膜筏：涉及的分子功能主要包括：四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合及離子通道活性。

圖11 右半結(jié)腸癌典型方藥治療右半結(jié)腸癌靶點GO富集條形圖

KEGG富集分析結(jié)果顯示（見圖12），“地榆-生甘草-槐花”治療右半結(jié)腸癌靶點主要富集于IL-17信號通路、VEGF信號通路及TNF信號通路。

圖12 右半結(jié)腸癌典型方藥治療右半結(jié)腸癌靶點KEGG富集高級氣泡圖

4 討論

“整體觀念”與“辨證論治”是中醫(yī)學的兩大基本特點，在治療腫瘤疾病過程中，當重視辨病與辨證相結(jié)合，其中辨病是對疾病發(fā)生、發(fā)展全過程有一個縱向的認識，而辨證是對疾病發(fā)生、發(fā)展過程中某一階段各方面生理特性的橫斷面的認識。一病有數(shù)證，同一疾病隨發(fā)展階段或發(fā)病部位的不同，其證型亦會有所不同，當采取不同的治法，即“同病異治”?；凇罢w觀念”而言，結(jié)腸癌作為一個整體決定了疾病的基本屬性，而左右半結(jié)腸癌不同的疾病特點又構成了結(jié)腸癌疾病本身“矛盾”的一體兩面。

網(wǎng)絡藥理學是一種整體特性的研究方法，旨在從系統(tǒng)、網(wǎng)絡的角度對中醫(yī)藥多靶點整合調(diào)節(jié)的作用機制[19-20]，其研究的邏輯及思路與中醫(yī)整體觀念不謀而合。網(wǎng)絡藥理學為研究者基于“整體觀”研究中醫(yī)藥作用機制提供了強有力研究策略支持。

深入研究中醫(yī)藥治療左右半結(jié)腸癌的藥味的施用特點及規(guī)律有助于增進中醫(yī)學對結(jié)腸癌病機及證型特點的認識水平，同時裨益于中醫(yī)臨床診療。

4.1 左、右半結(jié)腸癌常用藥物及核心組合存在差異

“同病異治”的觀念體現(xiàn)在藥味及藥物組合使用差異中，這與左、右半結(jié)腸癌不同病機特點及常見證型息息相關。在共同使用的44味典型藥味中，左半結(jié)腸癌桃仁、地榆及龍葵使用頻率高于右半結(jié)腸癌，而右半結(jié)腸癌柴胡使用比例高于左半結(jié)腸癌。桃仁功擅活血化瘀，龍葵可清熱解毒及地榆涼血止血，俱為治療左半結(jié)腸癌瘀毒內(nèi)結(jié)證之良藥；柴胡可疏肝行氣、升舉陽氣，則可用于右半結(jié)腸癌突出之脾腎陽虛及肝腎陰虛證。在差異使用的典型藥味方面，左半結(jié)腸癌預知子、壁虎等4味藥能活血解毒散結(jié)、生津養(yǎng)血，右半結(jié)腸癌澤瀉等14味藥則可利濕行氣、補益肝腎。藥物施用差異與左半結(jié)腸癌多見氣滯血瘀、濕熱內(nèi)結(jié)及右半結(jié)腸癌證型多見肝腎陰虛的證型特點分布存在基本相符[7]。

另一方面，本研究表明左、右半結(jié)腸癌臨床上施用的藥物核心組合存在一定的差異。左半結(jié)腸癌藥物核心組合整體上突出清熱解毒、行氣活血的功效特點。核心組合如“浙貝母-貓爪草-桔?！敝?，浙貝母清熱化痰散結(jié)，貓爪草解毒化痰散結(jié)、桔梗宣肺排膿又兼有引經(jīng)之用，三藥均歸肺經(jīng)，其治之藥與中醫(yī)“肺與大腸表里”理論相符。該組合可作為左半結(jié)腸癌痰濕結(jié)聚、兼夾毒邪的選用方藥。又如核心組合“南方紅豆杉-廣藿香-麥芽-枳實-稻芽-陳皮”，藥理學研究表明南方紅豆杉含有紫衫烷化合物[21]，且該藥也是臨床常用抗癌中藥。陳皮、廣藿香兩藥相合可健脾化濕，枳實行氣消痞，麥芽、谷芽健脾和胃。諸藥合用，攻補兼施舍，既可攻癌消痞，又能健脾益氣，攻邪而避免傷正。

右半結(jié)腸癌的藥物核心組合整體功效則彰顯健脾益氣、養(yǎng)血補血的特點。核心組合如“當歸-黃芪”，當歸可活血養(yǎng)血，黃芪可健脾益氣，托毒排膿。核心組合如“香附-川芎-敗醬草-延胡索-牡丹皮-烏藥”，香附、川芎、延胡索、烏藥相配可疏肝行氣活血止痛，丹皮可活血化瘀，敗醬草可消癰排膿。諸藥合用，以調(diào)血理氣為主，又兼有排膿之功，與“行血則便膿自愈，調(diào)氣則后重自除”的理論相合，可用于氣滯血瘀之證較明顯的結(jié)腸癌患者。

關聯(lián)規(guī)則分析可用于挖掘分析方藥中的常用藥物配伍規(guī)律。本研究中左、右半結(jié)腸癌在關聯(lián)規(guī)則上存在一定的差異，左半結(jié)腸癌代表性核心關聯(lián)規(guī)則分別為“山慈菇-白術”、“半枝蓮-法半夏-陳皮”等。山慈菇功能清熱解毒，消癰散結(jié)，配合白術甘溫補氣健脾，兩藥配伍正切合左半結(jié)腸癌脾虛又多夾癌毒的特點；半枝蓮功能清熱解毒，散瘀止血，半夏辛溫功能燥濕化痰、消痞散結(jié)，再配合陳皮健脾理氣，三藥相合可舒調(diào)中焦氣機，力散結(jié)聚之痰。右半結(jié)腸癌關聯(lián)規(guī)則代表性核心關聯(lián)規(guī)則分別為“茯苓-白術”、“地榆-生甘草-槐花”等。茯苓、白術兩藥配伍可健脾益氣，利水滲濕，為治療脾虛證的常用藥對，在經(jīng)典方劑如四君子湯、參苓白術散及二陳湯等中均有運用；地榆功能涼血止血，解毒斂瘡，槐花涼血止血兼清肝瀉火，再配伍甘草一者可清熱解毒，二者兼有甘緩調(diào)藥之用，可以防止諸藥寒涼太過損耗陽氣。

4.2 治療左、右半結(jié)腸癌潛在分子機制不同點分析

4.2.1 不同的有效成分

網(wǎng)絡藥理學分析結(jié)果顯示，左半結(jié)腸癌典型方藥“半枝蓮-法半夏-陳皮”的關鍵抗癌成分包括γ-氨基丁酸、葫蘆巴堿等，這些成分為該典型方藥規(guī)則的重要藥效基礎。既往研究表明，這些關鍵成分均具有一定的直接抗癌作用。An等[22]研究結(jié)果顯示，產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳桿菌可通過介導γ-氨基丁酸受體通路抑制對5-FU耐藥的HT-29結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移性并誘導腫瘤細胞凋亡，產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳桿菌有望成為對5-FU耐藥的結(jié)腸癌患者的輔助用藥。本研究中γ-氨基丁酸的所屬藥物為半夏，筆者推測該藥物含有的γ-氨基丁酸成分或可通過類似的機制調(diào)節(jié)結(jié)腸癌患者對5-FU的耐藥從而體現(xiàn)中醫(yī)藥協(xié)同化學治療的“增效”作用。Tazehkand等[23]研究顯示葫蘆巴堿可通過抑制紅細胞核因2相關因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）的表達而減低SW480及LS174T結(jié)腸癌細胞系對奧沙利鉑的耐藥。

PPI網(wǎng)絡分析顯示，左半結(jié)腸癌典型方藥核心抗癌治療靶點為ESR1、FASLG及KITLG等。作為雌激素的主要受體之一，ESR1可通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白以及細胞周期蛋白D1的表達促進細胞周期的轉(zhuǎn)換和增殖信號的轉(zhuǎn)導[24]。Fan等[25]研究表明ESR-1抑制劑可通過抑制ESR1表達，抑制NLRP3炎癥小體活性，降低促炎細胞因子表達，抑制HCT116結(jié)腸癌細胞的增殖同時促進其凋亡；FASLG是腫瘤壞死因子（TNF）家族的一員，其主要功能是通過與受體FAS結(jié)合而活化T淋巴細胞進而誘導細胞凋亡[26]。FASLG與FAS在結(jié)腸癌細胞中存在共表達的情況，但結(jié)腸癌來源的細胞系通常對Fas介導的凋亡具有抗性[27]。實驗研究表明，KITLG同樣在結(jié)腸癌細胞系中存在異常表達，KITLG自分泌和/或旁分泌信號途徑的激活與結(jié)腸癌細胞的生長增殖關系密切，敲除KITLG可使DLD1結(jié)腸癌細胞形成的異種移植瘤明顯縮小[28]。

GO富集分析顯示，“半枝蓮-法半夏-陳皮”防治左半結(jié)腸癌的靶點涉及的生物學過程氧水平反應、肽鏈內(nèi)切酶活性調(diào)節(jié)及凋亡信號通路調(diào)控。其中，尤以凋亡信號通路的調(diào)控值得引起重視。KEGG結(jié)果表明“半枝蓮-法半夏-陳皮”防治左半結(jié)腸癌的靶點主要富集于MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路及RAS信號通路，文獻報道顯示，這三條通路在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中均具有重要作用[29-30]。如研究表明，PI3K-AKT信號通路在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均存在異常激活。與正常細胞相比，腫瘤細胞的存活及抗凋亡多呈現(xiàn)PI3K/AKT依賴性，短期抑制PI3K/AKT信號誘導腫瘤細胞可能僅對正常細胞產(chǎn)生較小的毒性[31]。在本研究中，左半結(jié)腸癌典型方藥核心作用靶點FASLG即富集于PI3K-AKT通路上。既往研究表明，PI3K/AKT抑制劑可增強 FASLG誘導HCT-15及 DLD-1結(jié)腸癌細胞系凋亡的作用。在較高濃度下，PI3K/AKT抑制劑誘導結(jié)腸癌細胞凋亡的同時還可顯著促進FAS介導的凋亡信號轉(zhuǎn)導[32]。

另一方面，右半結(jié)腸癌典型方藥“地榆-生甘草-槐花”的關鍵抗癌成分主要包括白樺脂醇、熊果酸等。藥理學研究表明，槐花關鍵成分白樺脂醇能抑制RKO和SW480結(jié)腸癌細胞的生長同時誘導細胞凋亡，并能抑制裸鼠移植瘤的生長，其機制與白樺脂醇結(jié)腸癌細胞中降低Sp1、Sp3和Sp4轉(zhuǎn)錄因子的表達水平有關[33]。此外，白樺脂醇還可通過抑制硬脂酰輔酶a脫飽和酶1（SCD-1）從而殺傷結(jié)腸癌干細胞[34]。既往研究表明熊果酸可通過下調(diào)Bcl-2和Bcl-xL的表達，活化Caspase-3和Caspase-9而間接誘導HT-29結(jié)腸癌細胞凋亡，并且熊果酸對HT-29細胞的生長抑制作用具有劑量和時間依賴性[35]。另一方面，研究表明熊果酸可通過抑制VEGF的表達及HIF-1α的積累，進而抑制腫瘤血管生成，同時在低氧條件下對結(jié)腸癌SW480細胞具有化療增敏作用[36]。值得注意的是，本研究中，“地榆-生甘草-槐花”的核心靶點所富集的通路即包含VEGF信號通路，該通路與結(jié)腸癌血管生成密切相關[37]，因此抑制結(jié)腸癌血管生成可能是“地榆-生甘草-槐花”發(fā)揮抗癌作用的重要機制之一。

基于上述研究表明，γ-氨基丁酸、葫蘆巴堿等成分可能是治療左半結(jié)腸癌的藥效物質(zhì)基礎，而白樺脂醇、熊果酸等可能是治療右半腸癌的藥效物質(zhì)基礎。

4.2.2 不同的靶點和通路

PPI網(wǎng)絡分析顯示右半結(jié)腸癌典型方藥作用的核心靶點主要包括IFNG、MAPK3、PTGS2等。IFNG蛋白具有抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能，腫瘤浸潤淋巴細胞中 IFNG 基因的高甲基化是腫瘤誘發(fā)免疫抑制的重要機制之一[38]。研究表明IFNG的兩種標簽單核苷酸多態(tài)性干擾素調(diào)節(jié)因子1及干擾素調(diào)節(jié)因子3與結(jié)腸癌發(fā)病風險增高有關[39]；MAPK3作為MAP激酶家族的一員，參與了細胞增殖、分化和細胞周期進程的調(diào)控，并與癌癥的發(fā)生發(fā)展關系密切[40]。隊列研究表明，MAPK3與結(jié)直腸癌KRAS基因突變顯著相關（OR:1.34，95% CI:1.02-1.76），并且MAPK3的表達也與結(jié)直腸癌患者的不良預后有關[41-42]。PTGS2是前列腺素生物合成的關鍵酶，既是雙加氧酶又是過氧化物酶。研究顯示，在BRAF突變的結(jié)直腸中，腫瘤PTGS2的高表達與患者較差的遠期生存相關（HR:2.4，95% CI:1.39-4.28），而在BRAF野生型的患者中PTGS2的表達水平則與患者的生存預后無關[43]。考慮到BRAF突變常見于晚期的右半結(jié)腸癌[44]，筆者推測右半結(jié)腸癌典型方藥靶點或可通過靶向調(diào)控PTGS2的表達水平而對患者預后產(chǎn)生積極影響。

GO富集結(jié)果顯示，“地榆-生甘草-槐花”防治右半結(jié)腸癌的靶點主要富集于類固醇代謝過程等條目上。研究表明，硬脂酰輔酶a脫飽和酶（SCD-1）在結(jié)腸癌干細胞中存在高表達現(xiàn)象，其可將飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪，而典型方藥中槐花關鍵成分白樺脂醇可通過抑制SCD-1而發(fā)揮對腫瘤干細胞的殺傷作用[34]。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，“地榆-生甘草-槐花的作用靶點”主要富集于IL-17信號通路、VEGF信號通路及TNF信號通路。IL-17信號通路主要由IL-17及其受體（IL-17-RA）組合構成，Wang等[45]研究表明在動物模型中IL-17的表達上調(diào)與結(jié)腸癌的疾病進展和5-FU治療耐藥有關，而IL-17-RA可直接在轉(zhuǎn)化的結(jié)腸上皮細胞內(nèi)促進癌前病變的發(fā)展；IL-17-RA還參與激活ERK、p38 MAPK和NF-κB信號，并能促進APC基因的突變的結(jié)腸癌胞的增殖。在本研究中，“地榆-生甘草-槐花”的核心靶PTGS2、IFNG及MAPK3均富集于IL-17信號通路上，作用于核心靶點并調(diào)控該通路可能是該典型方藥組合防治右半結(jié)腸癌的重要機制。另一方面，PTGS2及MAPK3還同時富集于VEGF信號通路和TNF信號通路，有文獻報道VEGF信號通路及TNF信號通路均在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[37,46]?！暗赜?生甘草-槐花”亦可能通過靶向相關靶點調(diào)控這些通路以起防治結(jié)腸癌的作用。

本研究表明中醫(yī)臨床診療中左半結(jié)腸癌組方以清熱解毒、行氣活血為特點，代表藥物有壁虎、地榆等。代表藥物核心組合有“浙貝母-貓爪草-桔梗”等，代表的典型藥物搭配規(guī)律有“半枝蓮-法半夏-陳皮”等。右半結(jié)腸癌組方以健脾益氣、養(yǎng)血補血為特點，代表藥物有紅景天、熟地黃等。代表方藥核心有“當歸-黃芪”等，代表的典型藥物搭配規(guī)律有“地榆-生甘草-槐花”等。同時，本研究通過網(wǎng)絡藥理學分析表明，左半結(jié)腸癌典型方藥潛在抗癌機制主要涉及腫瘤耐藥阻滯、抑制增殖及促進腫瘤凋亡，涉及的信號通路主要有PI3K-AKT信號通路；右半結(jié)腸癌典型方藥潛在抗癌機制主要涉及抗腫瘤血管生成、促腫瘤凋亡等，涉及的信號通路主要為VEGF信號通路等。以上研究結(jié)果，可為指導中醫(yī)辨證論治左右半結(jié)腸癌臨床用藥提供借鑒，同時為相關基礎研究的開展提供理論依據(jù)。

本研究亦存在著一定不足：①本研究中所挖掘的方藥規(guī)律主要基于臨床實際使用情況，未根據(jù)患者服藥后臨床癥狀及體征的改變進行分析、隨訪及療效評價，研究結(jié)果可為臨床提供組方用藥策略提供參考，但應根據(jù)臨床實際情況靈活加減應用，同時對于左、右半結(jié)腸癌的有效方藥策略制定仍需要在未來基于大樣本數(shù)據(jù)進行進一步的深入挖掘研究。②本研究第二部分分析主要基于網(wǎng)絡藥理學，網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)庫仍有不斷更新的迭代的趨勢，對于典型方藥的機制探討，在未來研究中建議盡可能納入更多元的數(shù)據(jù)。③本研究網(wǎng)絡藥理學研究的相關結(jié)果雖可為相關基礎研究的開展提供理論基礎，但研究結(jié)果仍需要進一步的實驗驗證。

綜上，現(xiàn)代醫(yī)學認為左、右半結(jié)腸癌是兩種不同的實質(zhì)性疾病，本研究以左、右半結(jié)腸癌作為數(shù)據(jù)挖掘的切入點，分析左、右半結(jié)腸患者方藥規(guī)律及其典型方藥抗癌作用機制。相關研究結(jié)果可為中醫(yī)藥防治左、右半結(jié)腸癌的中醫(yī)臨床診療策略制定及相關基礎研究開展提供參考。從中醫(yī)學理論及臨床實際深化對左右半結(jié)腸癌疾病的認識，同時促進中醫(yī)精準辨證論治左右半結(jié)腸癌疾病的研究工作，對裨益病患具有較大的臨床意義，值得進一步探索開拓。