冰片促燈盞乙素透體外血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的作用研究*

李志林，鄭祖杰，黎曉冬，曾潔萍

（1.成都中醫(yī)藥大學 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 成都 610075）

青光眼是以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（Retinal ganglion cells，RGCs）及其軸突進行性丟失為病理基礎的神經(jīng)變性性疾病，臨床上青光眼的主要治療措施是降低眼壓，但臨床發(fā)現(xiàn)某些眼壓得到有效控制的青光眼患者，仍然存在視功能繼續(xù)受損的情況，單純控制眼壓無法遏止RGCs凋亡[1]。故如何在眼壓控制后繼續(xù)對視神經(jīng)保護成為國內(nèi)外研究熱點，在既往研究中已有采用各種中藥對視神經(jīng)保護的研究，諸如枸杞多糖、雷公藤、白藜蘆醇等[2]。也有研究證實活血通絡中藥如燈盞細辛提取物對急性眼內(nèi)壓升高的大鼠RGCs具有確切的保護作用[3-4]。同時臨床上研究表明燈盞花素注射液對于部分青光眼濾過術后患者的視野有部分改善作用[5]，然而口服制劑（燈盞花素片）臨床卻未達到預期效果，這可能是因為口服很難透過血眼屏障而在眼內(nèi)達到有效濃度，注射給藥方式又難以長期持續(xù)給藥從而臨床療效不理想有關。

口服藥品經(jīng)吸收后通過血液到達全身，想要進入視網(wǎng)膜內(nèi)，需要首選通過血-視網(wǎng)膜屏障。既往研究發(fā)現(xiàn)冰片作為中醫(yī)外科的常用藥，可經(jīng)眼、皮膚等部位吸收[6]。張瑞濤等[7]研究表明，經(jīng)鼻腔將冰片給藥可明顯提高鼻腔黏膜血管和腦血管的通透性，在一定濃度范圍內(nèi)，伊文思藍（Evans blue，EB）的通透性與冰片使用濃度呈線性關系。而血-視網(wǎng)膜屏障由內(nèi)屏障和外屏障組成：內(nèi)屏障由視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接構成。因此本研究通過構建內(nèi)屏障模型觀察冰片對藥物的促透過作用。

1 HBSS中燈盞乙素含量測定方法學建立

1.1 實驗儀器及藥物

1.1.1 實驗儀器

API4000型HPLC-MS/MS儀（ABSCIEX公司），十萬分之一電子分析天平（SHIMADZU公司），H2050R低溫高速離心機（湖南湘儀），EKUP-II-150L型超純水儀（四川宜科），多規(guī)格可調(diào)移液器（Sartorius）；實驗藥品燈盞乙素（純度98.54%），批號AF8051821；冰片，批號AF8040412；黃芩苷（純度99.31%，內(nèi)標），批號AF9062402，均購自于成都埃法生物科技有限公司。實驗用甲醇、甲酸、乙腈均為HPLC級。實驗中所用純水為超純水。

1.1.2 測定對象

燈盞乙素CAS#：27740-01-8；分子式：C21H18O12；分子量：462.36。黃芩苷CAS#：21967-41-9；分子式：C21H18O11；分子量：446.36

1.2 檢測方法

1.2.1 色譜條件

HPLC-MS/MS系統(tǒng)由Aglient公司1260型HPLC儀和AB SCIEX公司API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（ESI離子源）組成。選擇Agilent ZORBAX C18色譜柱（2.1e100 mm，3.5 μm，批號959793-902），柱溫30℃。流動相A為0.1%的甲酸溶液，流動相B為0.1%的乙腈溶液。梯度洗脫（見表1）。

表1 梯度洗脫流動相

1.2.2 質(zhì)譜條件

以選擇性負離子對監(jiān)測模式（MRM）測定燈盞乙素（m/z 461.3/285.2）的濃度，黃芩苷作內(nèi)標（m/z 445.1/268.9），質(zhì)譜參數(shù)見表2，燈盞乙素質(zhì)譜product碎片離子掃描圖見圖1，黃芩苷質(zhì)譜product碎片離子掃描圖見圖2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

圖1 燈盞乙素質(zhì)譜product碎片離子掃描圖（m/z 461.3/285.2）

圖2 黃芩苷質(zhì)譜product碎片離子掃描圖（m/z 445.1/268.9）

1.2.3 樣本預處理

取待測樣本10 μL，加入0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液=15∶85的溶液90 μL，混勻后，再加入50 μL內(nèi)標工作液（1000 ng·mL-1的黃芩苷甲醇溶液），混勻后于4℃、12000 r·min-1離心5 min后，取上清液50 μL上樣，進樣5 μL分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst色譜工作站，自動計算待測成分與內(nèi)標的峰面積、峰面積比值、標準曲線、測定濃度以及偏差。濃度單位為ng·mL-1，標準曲線加權設置為1/c2。以標準曲線進樣后的色譜峰面積比值對應其理論濃度建立標準曲線方程，未知樣本進樣后得到的色譜峰面積比值代入次標準曲線方程即可反算出其濃度。

1.3 方法學驗證

1.3.1 標準曲線

先用天平稱取燈盞乙素10.15 mg標準品，相當于燈盞乙素10 mg，用甲醇配制燈盞乙素儲備液（100 μg·mL-1），儲存條件-35℃冰箱。取儲備液，臨用前先用流動相即0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液=15∶85溶液稀釋出標準曲線系列工作液STA-STG。基質(zhì)標準曲線范圍為5000-400 ng·mL-1，最低定量限為400 ng·mL-1，標準曲線工作液具體配置見表3，標準曲線見圖3。

圖3 標準曲線圖

表3 標準曲線工作液配制表

1.3.2 準確度和精密度

用甲醇配制燈盞乙素質(zhì)控儲備液（200 μg·mL-1）并用50%甲醇水溶液稀釋出質(zhì)控工作液HQC、MQC、LQC（含燈盞乙素4000、2000、400 ng·mL-1）。取這3個濃度水平的質(zhì)控基質(zhì)樣本，經(jīng)預處理后進樣。共測定3個分析批，每批每個濃度各測定6次，計算準確度和精密度。批內(nèi)精密度CV 0.91%-1.59%，批間精密度CV 3.70%-7.58%，準確度為98.03%-99.87%。

1.3.3 預處理回收率

取HQC、LQC質(zhì)控基質(zhì)樣品各3份，經(jīng)預處理揮干后復溶進樣。另取空白HBSS基質(zhì)經(jīng)預處理后揮干，加入標準工作液復溶，配制成同理論濃度的樣品直接進樣，比較兩組樣品的峰面積，計算預處理回收率。燈盞乙素的預處理回收率為97.3-99.5%，內(nèi)標的預處理回收率為98.7%。

1.3.4 特異性與基質(zhì)效應

取6個不同來源未混合的空白HBSS基質(zhì)，經(jīng)預處理后分別進樣檢測，考察空白基質(zhì)對待測物和內(nèi)標的出峰干擾情況，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)干擾。燈盞乙素和內(nèi)標的保留時間為1.5 min，空白基質(zhì)圖見圖4，標準曲線圖譜見圖5，實測樣本圖見圖6。

圖4 空白基質(zhì)圖譜（Blank HBSS）

圖5 標準曲線圖譜（SD sample）

圖6 實測樣本圖譜（Unknown sample）

將6個不同來源的空白HBSS基質(zhì)經(jīng)預處理后揮干，加入標準工作液復溶分別配制HQC、LQC兩個濃度水平的基質(zhì)效應考察樣本，進樣。另配制同理論濃度的純?nèi)芤簶颖?，進樣。比較兩組樣品的峰面積，考察基質(zhì)效應。每個濃度平行測定3份，計算經(jīng)內(nèi)標校正后的基質(zhì)效應因子，結(jié)果各基質(zhì)的內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應因子分別為0.989-1.003，符合要求。

1.3.5 穩(wěn)定性

分別考察了儲備液和工作液于-30℃保存31天的穩(wěn)定性（偏差為（-0.60%）-（-0.84%））、儲備液和工作液于室溫保存24 h的穩(wěn)定性（偏差為（-3.30%）-（-0.57%））、基質(zhì)樣本室溫保存22 h穩(wěn)定性（偏差為（-1.83%）-（3.53%））、基質(zhì)樣本在-30℃冰箱冷凍保存60天的穩(wěn)定性（偏差為（-0.75%）-（-4.05%））、基質(zhì)樣本反復凍融5次的穩(wěn)定性（偏差為（-1.37%）-（5.33%））、處理后的樣本重復進樣穩(wěn)定性（偏差為（1.21%）-（2.34%））和在進樣室（11℃）保存24 h的穩(wěn)定性（偏差為（-0.96%）（4.27%）），其結(jié)果均符合要求。

1.3.6 其他

我們還考察了儀器的進樣攜帶污染率（Carryover）、樣本稀釋的可靠性（稀釋系數(shù)5、10）等，其結(jié)果均符合2015版《中國藥典》中《9012生物樣品定量分析方法驗證指導原則》。所有樣本的采集、處理、保存和檢測過程均控制在方法學驗證有效的時效范圍內(nèi)。

2 大鼠原代視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)

2.1 實驗所需材料

2.1.1 主要儀器

TDZ4-WS臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺（蘇州博萊爾凈化設備有限公司），AE31型生物顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)有限公司），MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋電機株式會），F(xiàn)B124電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械），另外需要尼龍篩網(wǎng)200目（Corning），15 mL離心管及50 mL離心管，Transwell（24孔8 μm及0.4 μm），一次性針頭過濾器PES進口（33 mm，0.22 μm），眼科手術剪，眼科手術鑷，加樣槍及槍頭、培養(yǎng)瓶、碘伏、棉簽等若干。

2.1.2 主要試劑

Gibco公司生產(chǎn)胎牛血清，DMEM/F12，HBSS緩沖液，Sigma公司的II型膠原酶，纖維粘連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N），Hyclone的胰蛋白酶（含EdTA），青鏈霉素（雙抗），Solarbio的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS），ScienCell的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基（ECM），成都埃法生物科技有限公司的燈盞乙素及冰片，北京凱瑞基生物科技有限公司的二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）。

2.2 實驗方法

2.2.1 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)

先將培養(yǎng)瓶進行FN包被，包被需在正式取材實驗前24 h。取纖維粘連蛋白，規(guī)格1010 μg·mL-1。解凍后取0.25 mL原液，加入9.75 mL的PBS液，得濃度25 μg·mL-1的FN共計10 mL，一次性濾器過濾后，用移液槍分別裝入2個培養(yǎng)瓶，每瓶5 mL纖維粘連蛋白混合液包被。室溫狀態(tài)下靜置45 min后，吸出上清液。再將培養(yǎng)瓶密封好后置入2-8℃冰箱冷藏。

取SD大鼠6只，體質(zhì)量250-280 g，來源于（成都中醫(yī)藥大學動物房），10%水合氯醛麻醉處死后，碘伏棉簽消毒眼周和眼球。摘除眼球，浸泡于75%的酒精中10 min，后拿出浸泡于含有4%雙抗的PBS液中，反復沖洗3次。沿角鞏膜緣剪開，去除眼前段組織，分離視網(wǎng)膜、玻璃體。視網(wǎng)膜置于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入0.1% Ⅱ型膠原酶消化，37℃下消化20 min，加入終止液（含20%胎牛血清的ECM）終止消化。予以200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，按1000 r·min-1，7 min條件下離心。后取出去除上清。加入ECM培養(yǎng)基（含20%胎牛血清，4%雙抗，1%的ECGS）混懸。分裝兩個培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶預先已行FN包被，每瓶各細胞懸液8 mL。予以37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。48 h后首次換液進行半量換液[8]。此后每兩天換液。

2.2.2 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞傳代

當細胞貼壁生長約8天左右，視生長情況予以消化傳代。消化傳代前，在37℃孵箱內(nèi)復溫所需的胰酶、培養(yǎng)基、PBS等。待原代細胞生長至80%-90%融合時，進行傳代。復溫所需的胰酶、培養(yǎng)基、PBS后。棄去原有的培養(yǎng)基后，予以PBS洗滌3次，每次用PBS約2 mL。清洗后加入0.25%胰酶（含EDTA）1 mL進行消化，消化約2 min后可見細胞脫落。消化完全時，加入3 mL培養(yǎng)基終止消化。予以離心機1000 r·min-1，離心5 min，去上清。加入完全培養(yǎng)基約5 mL吹打混勻，按每毫升5×104接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，1∶1或者1∶2傳代，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取第四代細胞用于Transwell實驗。

2.3 實驗結(jié)果

2.3.1 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮形態(tài)觀察及細胞生長周期

P1內(nèi)皮細胞培養(yǎng)第6天可見細胞呈梭形生長，部分可見軸突（圖7）。培養(yǎng)第9天，細胞層結(jié)構生長致密，融合度達到80%-90%（圖8）。

圖7 內(nèi)皮細胞P1第6天（100×）

圖8 內(nèi)皮細胞P1第9天（100×）

圖9顯示細胞融合度較高，呈梭形生長，結(jié)構致密。無接觸性抑制。原代細胞在生長前期剛貼壁時，其主要呈散在分布，以單層排列為主，主要以梭形，也有三角形或多角形，邊界較為清晰，后期生長較為致密，可呈簇狀，網(wǎng)狀融合分布。一般可在3-5天細胞生長融合。

圖9 內(nèi)皮細胞P3（100×）

3 Transwell實驗

3.1 建立視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞屏障模型

取內(nèi)皮細胞培養(yǎng)瓶，吸出瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加入PBS 2 mL吹打沖洗。吸出PBS后加入1 mL胰酶，消化細胞約5 min，加入終止液約3 mL，終止消化，后移入離心管離心，1000 r·min-1，5 min，棄上清，加入約5 mL培養(yǎng)基，重懸。密度約為每毫升5×105。取Transwell（24孔板，0.4 μm），于下室加入600 μL培養(yǎng)基。上室加入約200 μL細胞懸液接種。隔日換液，待細胞貼壁后，每天換液。換液時，先吸出上室液體，再吸出下室液體，然后先加下室培養(yǎng)基600 μL，再加上室培養(yǎng)基200 μL。

3.2 結(jié)晶紫染色檢測細胞屏障致密度

培養(yǎng)21天，兩個模型各隨機取出5個小室，用復溫后的PBS清洗3次，無水乙醇室溫下固定30 min，后再用PBS清洗兩次。加入0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，染色可見單細胞層結(jié)構模型形成。

染色結(jié)果示視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞胞漿及細胞間連接呈紫色均染，且各組細胞致密度較高，無顯著差異。

3.3 冰片及燈盞乙素的藥物溶液配制

將所需HBSS、PBS等溶液復溫。精密稱取燈盞乙素5000 μg，加入50 mL的HBSS溶液，渦旋混勻后得100 μg·mL-1的燈盞乙素溶液。精密稱取冰片9600 μg，加入20 μL的DMSO，得濃度480 μg·mL-1的冰片藥物母液。再取4 μL含冰片的DMSO母液，加入4 mL含有100 μg·mL-1燈盞乙素的HBSS溶液，充分渦旋后，再用一次性濾器過濾。得含有冰片濃度為480 μg·mL-1，含有燈盞乙素濃度為100 μg·mL-1，DMSO濃度為1/1000的HBSS藥物溶液。然后按照不同比例配制含有冰片240 μg·mL-1、120 μg·mL-1、60 μg·mL-1的HBSS溶液。保證其每種濃度下燈盞乙素濃度為100 μg·mL-1，且DMSO濃度小于1/1000，僅僅存在冰片含量的差異性。

3.4 給藥取樣

取Transwell模型，吸凈其上下室培養(yǎng)液，HBSS清洗3次，洗滌細胞單層中可能殘留的培養(yǎng)基及附著物。隨機編號為A-E。按下列方法處理各個樣本（如表8）：A孔為陰性對照，上室給含有燈盞乙素100 μg·mL-1的HBSS溶液200 μL，下室給600 μL的純HBSS。B孔上室給含有冰片濃度為60 μg·mL-1，含有燈盞乙素100 μg·mL-1的HBSS溶液200 μL，下室給600 μL的純HBSS。C孔上室給含有冰片濃度為120 μg·mL-1，含有燈 盞 乙 素100 μg·mL-1的HBSS溶 液200 μL，下 室給600 μL的純HBSS。D孔上室給含有冰片濃度為240 μg·mL-1，含有燈盞乙素100 μg·mL-1的HBSS溶液200 μL，下室給600 μl的純HBSS。E孔上室給含有冰片濃度為480 μg·mL-1，含有燈盞乙素100 μg·mL-1的HBSS溶液200 μL，下室給600 μL的純HBSS。給藥后置于以37℃，5% CO2的孵箱之中。于2 h取下室液體凍存管封存。上室液體全部吸出，凍存管封存于-80℃冰箱保存。

3.5 UPLC-MS/MS檢測HBSS中燈盞乙素含量

按照第1部分建立的檢測方法進行檢測。

3.6 結(jié)果

冰片對燈盞細辛透視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞屏障的影響：與陰性對照比較，加入冰片2 h后，燈盞乙素透視網(wǎng)膜血管周內(nèi)皮細胞屏障到達Transwell下室的濃度升高，提示冰片具備促燈盞乙素透視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞屏障的作用，其效應隨冰片濃度加大而增強（圖10）。

圖10 內(nèi)皮細胞屏障模型中燈盞乙素含量柱狀圖及冰片與其比值

4 小結(jié)與展望

冰片具備促進燈盞乙素透體外血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障模型的作用，在本實驗中上室的冰片藥物濃度達到480 μg·mL-1時，燈盞乙素透過體外血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障模型達到最大藥物濃度。冰片外觀為一種無色或白色半透明的結(jié)晶體。其理化性質(zhì)中不溶于水。溶于乙醇、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、甲醇，極微能溶于水。極易升華，具有類似樟腦的氣味。冰片的通透作用，除了外用促透皮作用外，既往在研究血腦屏障時對其研究較多，主要表現(xiàn)在對血腦屏障的開放作用[9]，主要表現(xiàn)在通過對內(nèi)皮細胞間的緊密連接，影響P-糖蛋白（P-gp）功能，以及通過影響P-gp功能，達到開放血腦屏障作用。同時對缺氧模型有保護性作用。此外也有研究顯示冰片對血腦屏障有雙向調(diào)節(jié)保護作用[10]。其主要包括通過抑制NF-κB下調(diào)P-gp，或以促進血腦屏障胞飲作用方式；此外也可通過抑制IL-1β，MMP-9表達和影響Ca2+-eNOS-NO，VEGF-eNOS-NO等通路方式。在其促透作用方面效果比較確切。對于冰片開放血視網(wǎng)膜屏障，其原理與緊密結(jié)構相關，這種緊密連接與蛋白質(zhì)元素組成的復合物相關，正因為緊密連接的相關蛋白質(zhì)彼此相互作用，保持了緊密連接的完整性。如果這些蛋白質(zhì)被破壞，它們將直接影響緊密連接的完整性，從而改變屏障的滲透性。在其促進血視網(wǎng)膜屏障的通透性的機制，可能與減少緊密連接相關蛋白ZO-1表達有關，證實了冰片作為促透劑，能夠開放大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞間的緊密連接，增加血視網(wǎng)膜屏障的通透性[11]。在使用安全性方面，有研究顯示天然冰片與合成冰片對兔眼及角膜均不產(chǎn)生刺激性，長期應用亦無毒性傷害，有望作為引經(jīng)促透劑廣泛用于滴眼液配方[12]。

燈盞乙素具有清除氧自由基，提高抗氧化酶活性，減少氧化物產(chǎn)生的作用[13]，同時還能抑制細胞焦亡[14]的作用。在既往研究中發(fā)現(xiàn)能促進部分阻塞血管的再通，達到再灌注效應[15]。此外也有研究顯示燈盞乙素能促進視網(wǎng)膜內(nèi)血流速度，這對于缺血缺氧內(nèi)循環(huán)的改善有極大幫助[16]。在對于DR中研究顯示燈盞花素可能存在降低VEGF的表達作用，從而達到減少血管的新生。這證明無論是青光眼還是糖尿病視網(wǎng)膜病變，燈盞乙素改善血流，對眼底血管的保護性作用巨大。但燈盞乙素存在生物利用度低、半衰期短、穩(wěn)定性差等問題[17]。在冰片的促透作用下，提高眼內(nèi)燈盞乙素的藥物含量，發(fā)揮其保護性作用、保護視神經(jīng)、提高對視功能，具有重大意義。在實驗過程中，如果具備更好實驗條件，可將觀察時間延長，進一步觀察。甚至采用氣相色譜對冰片進行濃度測量。如果具備更好的培養(yǎng)基，可否將兩種細胞進行進一步培養(yǎng)，建立混合模型，進行進一步的實驗觀察。如果繼續(xù)將冰片含量繼續(xù)提高，促透作用是否會繼續(xù)加強。這些均有待于我們進一步研究。