指紋圖譜及多成分定量結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法評(píng)價(jià)不同廠家消炎利膽片質(zhì)量*

車貴娟，匡艷輝，劉曉秋，夏玉英，張傳平，王德勤

（1.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司 廣州 510000；2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院 沈陽 110015）

消炎利膽片是具有嶺南特色的名優(yōu)中成藥，有清熱、祛濕、利膽的功效，臨床上常用于肝膽濕熱引起的口苦、脅痛、急性膽囊炎、膽管炎。主要由穿心蓮、苦木、溪黃草三種藥材組成[1-3]。

消炎利膽片收載于《中華人民共和國藥典》2020版一部，其中含量測(cè)定僅對(duì)穿心蓮的兩種內(nèi)酯類活性成分進(jìn)行含量測(cè)定，這種簡(jiǎn)單的質(zhì)量控制模式是難以全面反映成品的質(zhì)量?，F(xiàn)對(duì)消炎利膽片進(jìn)行含量測(cè)定的研究總共涉及到13個(gè)指標(biāo)成分，其中綠原酸、咖啡酸為穿心蓮和溪黃草共有成分，拉西多寧、表諾多醇、冬凌草甲素、表諾多星存于溪黃草R. serra(Maxim.)Hara[4-10]。各個(gè)廠家的消炎利膽片生產(chǎn)所使用原料可能不同，不能準(zhǔn)確分析各個(gè)廠家之間質(zhì)量差異，缺乏有效測(cè)定3種藥材中代表性活性成分的方法。中藥指紋譜可以體現(xiàn)中藥制劑中化學(xué)成分和相對(duì)含量，但不能揭示出各成分可能的含量變化規(guī)律，多成分定量分析與指紋圖譜相結(jié)合，可以更好的控制其質(zhì)量[11]?；瘜W(xué)模式識(shí)別技術(shù)與指紋圖譜分析相結(jié)合，可以篩查樣品之間質(zhì)量差異的標(biāo)志物，在現(xiàn)代中藥及其制劑的質(zhì)量控制研究中也得到了廣泛的應(yīng)用[12-17]。

本研究建立了消炎利膽片的HPLC指紋圖譜，尋找各藥材的特征成分，結(jié)合3種化學(xué)模式識(shí)別方法，評(píng)價(jià)樣品之間的差異，篩選出質(zhì)量差異標(biāo)志物，為各廠家生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制提供參考。同時(shí)，本研究建立了可以同時(shí)檢測(cè)3種藥材中主要活性成分的色譜方法，為消炎利膽片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1290高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Waters2695高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司）；Supfex JX-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，天津萬象恒遠(yuǎn)科技有限公司）；Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷倫科技有限公司）；Genie U12超純水儀（上海樂楓生物科技有限公司）；KQ-600VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S-SW電子天平（0.1 mg，德國Sartorius公司）；CP225D電子天平（0.01 mg，德國Sartorius公司）。

1.2 試劑

乙腈（默克（德國）制藥公司，色譜純）；甲酸（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，色譜純）；水（Genie U12超純水儀制）；其它試劑均為分析純（廣東廣試試劑科技有限公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮（批號(hào)6533，純度98.0%）；穿心蓮內(nèi)酯（批號(hào)5327，純度96.9%）；4,5-二甲氧基鐵屎米酮（批號(hào)6532，純度98.0%）；新穿心蓮內(nèi)酯（批號(hào)8813，純度98.0%）；14-去氧穿心蓮內(nèi)酯（批號(hào)8901，純度98.0%）；Andropanoside（批號(hào)9633，純度98.0%）均購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。迷迭香酸（批號(hào)111871-202007，純度98.1%）；脫水穿心蓮內(nèi)酯（批號(hào)110854-201710，純度99.4%）；穿心蓮（批號(hào)121082-201505）；苦木（批號(hào)121017-2001305）；溪黃草（線紋香茶菜，批號(hào)121488-201603）均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 供試品

消炎利膽片樣品共41批，來源于21個(gè)廠家，編號(hào)S1、S2、S10-S34、S36-S38屬于廣東省，編號(hào)S3、S4、S9、S40、S41屬于吉林省，編號(hào)S5-S7、S39屬于云南省，編號(hào)S8、S35屬于廣西壯族自治區(qū)。陰性樣品共3批，來源于廣州白云山和記黃埔中藥有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0-25 min，19% A；25-26 min，19-23% A；26-45 min，23% A；45-50 min，23-26%A ；50-60 min，26% A；60-66 min，26-32% A；66-85 min，32% A；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；柱溫為室溫；理論板數(shù)按脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 混合對(duì)照溶液的制備

精密稱取迷迭香酸、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、穿心蓮內(nèi)酯、4,5-二甲氧基鐵屎米酮、新穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，置同一容量瓶中，加適量甲醇溶解，稀釋至刻度，用甲醇溶解定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為對(duì)照品溶液（每1 mL分別含0.003165-0.2198 mg、0.02054-0.7132 mg、0.01600-1.111 mg、0.02540-2.940 mg、0.003456-0.4000 mg、0.003584-0.4148 mg、0.02056-2.038 mg）。

精密稱取穿心蓮、苦木、溪黃草對(duì)照藥材各0.5 g，分別置3個(gè)具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min（250 W，45 kHz），放冷，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取消炎利膽片樣品10片，除去包衣，研細(xì)，取約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min，放冷，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取樣品（S26），按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣6針，以4號(hào)峰作為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取樣品（S28），按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)的色譜條件下0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，以4號(hào)峰作為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取樣品（S32），按“2.3”項(xiàng)分別制備6份供試品溶液，“2.1”項(xiàng)的色譜條件下測(cè)定，以4號(hào)峰作為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。

2.5 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性、耐用性實(shí)驗(yàn)

取3份陰性樣品和樣品（S27），按“2.3”項(xiàng)的方法分別制備各陰性樣品溶液和供試品溶液。取各陰性樣品溶液、供試品溶液和按“2.2”項(xiàng)制得的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。

取上述供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別用“1.1”項(xiàng)兩種品牌的色譜柱測(cè)定。

取上述供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，用同一根色譜柱分別在“1.1”項(xiàng)兩種品牌的色譜儀上測(cè)定。

2.5.2 線性關(guān)系考察

取“2.2”項(xiàng)的不同濃度混合對(duì)照品溶液，以濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取樣品（S28），按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)色譜條件0、2、4、6、8、12、24 h分別進(jìn)行測(cè)定。

2.5.4 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

取樣品（S32），去除包衣，研細(xì)，精密稱取9份，每份0.15 g，置具塞錐形瓶中，精密加入適量各對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。

2.6 化學(xué)模式識(shí)別

采用SPSS 26.0軟件，對(duì)32批樣品中11個(gè)共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)行CA和PCA。其中CA采用系統(tǒng)聚類分析組間聯(lián)接，平方歐氏距離作為樣品的測(cè)量區(qū)間。

無監(jiān)督分析在樣品組間差異不明顯，組內(nèi)差異明顯時(shí)，難以發(fā)現(xiàn)和區(qū)分組間差異；組間差異小時(shí)，樣本量大的那組將會(huì)主導(dǎo)模型，避免這些問題就是采用有監(jiān)督分析[18]。根據(jù)PCA和CA的分組結(jié)果，將32批消炎利膽片通過SIMCA 14.1軟件進(jìn)行有監(jiān)督模式的OPLS-DA，篩選樣品之間的差異標(biāo)志物。

3 結(jié)果

3.1 消炎利膽片指紋圖譜研究

3.1.1 方法學(xué)考察結(jié)果

指紋圖譜方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性結(jié)果的RSD值均小于3%。

3.1.2 指紋圖譜研究結(jié)果

取32批消炎利膽片，分別按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。導(dǎo)出32批消炎利膽片的色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”得到了32批消炎利膽片指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（圖1），根據(jù)藥材與消炎利膽片樣品的對(duì)比圖（圖2）選擇各藥材中的主要成分且分離度較好的色譜峰作為共有峰，共標(biāo)定了11個(gè)峰，進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 消炎利膽片樣品相似度

圖1 32批樣品的HPLC指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜（R）

圖2 藥材與消炎利膽片的對(duì)比圖

3.1.3 主要色譜峰的化學(xué)指認(rèn)

采用對(duì)照品進(jìn)行指認(rèn)，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，比較各峰保留時(shí)間和紫外吸收光譜。消炎利膽片樣品HPLC指紋圖譜中共指認(rèn)了8個(gè)峰，分別是迷迭香酸（2號(hào)峰）、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮（3號(hào)峰）、穿心蓮內(nèi)酯（4號(hào)峰）、Andropanoside（6號(hào)峰）、4,5-二甲氧基鐵屎米酮（8號(hào)峰）、新穿心蓮內(nèi)酯（9號(hào)峰）、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯（10號(hào)峰）、脫水穿心蓮內(nèi)酯（11號(hào)峰）。

3.2 HPLC同時(shí)測(cè)定消炎利膽片中7種有效成分的含量結(jié)果

3.2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法專屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、均良好，陰性樣品無干擾，如圖3、表2、表3所示。耐用性考察結(jié)果表明使用兩種品牌的色譜柱各成分的分離度均達(dá)到1.5以上，兩種品牌的色譜儀測(cè)定各成分含量差異在10%范圍以內(nèi)。

圖3 混合對(duì)照品溶液（A）、陰性樣品（B、C、D）及消炎利膽片供試品溶液（E）色譜圖

表2 線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.2 樣品含量測(cè)定

將“1.4”項(xiàng)41批樣品按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算各成分的含量。結(jié)果41批樣品中穿心蓮內(nèi)酯含量為2.62-10.2 mg/片，新穿心蓮內(nèi)酯含量為0.869-5.73 mg/片，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯含量為0.660-4.50 mg/片，脫水穿心蓮內(nèi)酯含量為1.50-8.99 mg/片，迷迭香酸含量為0.0266-0.791 mg/片，4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮含量為0-0.730 mg/片，4,5-二甲氧基鐵屎米酮含量為0-0.171 mg/片。

3.3 化學(xué)模式識(shí)別

3.3.1 聚類分析（CR）

結(jié)果見圖4，當(dāng)類間距離為12時(shí)，消炎利膽片被分為3類。樣品S5、S6、S7的相似度相對(duì)較低，聚類趨勢(shì)與相似度評(píng)價(jià)一致。

圖4 32批樣品聚類樹狀圖

3.3.2 主成分分析（PCA）

主成分分析結(jié)果表明，以特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得 到3個(gè) 主 成 分，PC1、PC2、PC3貢 獻(xiàn) 率 為60.076%、13.567%、11.798%，累積貢獻(xiàn)率為85.442%。

由表4成分矩陣可知，PC1中峰3、峰5、峰6、峰8、峰9、峰10貢獻(xiàn)大；PC2中峰1、峰4貢獻(xiàn)大；PC3中峰11貢獻(xiàn)大。根據(jù)公式F=Zx×t（Zx原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)準(zhǔn)化矩陣，t為標(biāo)準(zhǔn)化的正交特征向量矩陣）計(jì)算各主成分值[12]。分別以計(jì)算所得的F1、F2、F3建立樣品分布散點(diǎn)圖，如圖5。PCA的樣品分布與CA一致，S5樣品離群較遠(yuǎn)，與相似度評(píng)價(jià)一致。

圖5 PCA樣品分布散點(diǎn)圖

表4 PCA成分矩陣

3.3.3 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

OPLS-DA所建立模型得到的關(guān)鍵指標(biāo)R2、Q2在通常情況下大于0.5較好，且兩者差值不大于0.2-0.3為好[19]。一般增加主成分也會(huì)增加R2、Q2值，當(dāng)只有R2值增加，Q2值不再增加或減少，此時(shí)已擬合過度，應(yīng)該終止計(jì)算新的主成分[19]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)建立所得的模型的Rx2cum=0.791、Ry2cum=0.679、Q2cum=0.635，其差值較小，且大于0.5，說明2主成分對(duì)樣品預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)，該模型擬合較好。

基于11個(gè)共有峰構(gòu)建32批不同地方消炎利膽片的OPLS-DA第1、2樣品分布散點(diǎn)圖（圖6），樣品聚集趨勢(shì)明顯，且與PCA、CA分析的結(jié)果相同。圖7展示了OPLS-DA模型中1、2主成分的11個(gè)指標(biāo)峰與樣品之間的相關(guān)性，從圖中可以看出峰3、峰4、峰11距原點(diǎn)較遠(yuǎn)。OPLS-DA模型中化學(xué)指標(biāo)的VIP（Variable importance for the projection）值越大，其對(duì)于解釋變量的貢獻(xiàn)越大、差異相關(guān)性越高。以VIP ≥ 1為重要的變量，篩選發(fā)現(xiàn)峰4、峰11、峰3對(duì)批次間穩(wěn)定性的影響較大，說明在生產(chǎn)中應(yīng)對(duì)這3個(gè)峰給予高度重視。

圖6 OPLS-DA模型第1、2主成分樣品分布散點(diǎn)圖

圖7 OPLS-DA模型第1、2主成分載荷圖

4 討論

4.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水等幾種不同的洗脫條件，將對(duì)照品溶液在波長(zhǎng)190-400 nm間掃描后對(duì)比了205 nm和225 nm下樣品的色譜圖。樣品在流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水，檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm下各色譜峰達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適中，分離度良好，即確定該洗脫方法和檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)比較了提取溶劑為水、甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇和色譜柱溫度為25℃、30℃、40℃時(shí)各色譜峰峰面積的差異。發(fā)現(xiàn)不同溫度對(duì)各成分的影響不大，提取溶劑用乙醇或70%乙醇時(shí)不利于迷迭香酸的提取，水不利于生物堿和內(nèi)酯的提取，70%甲醇時(shí)所得的供試品溶液中各成分的含量較高，且無絮狀物及沉淀產(chǎn)生，即確定以70%甲醇作為其提取溶劑，柱溫為室溫。

4.2 PCA、CA、OPLS-DA及含量測(cè)定分析

通過對(duì)比指紋圖譜相似度和CA結(jié)果，其中白云山所生產(chǎn)的消炎利膽片都聚在一類，還包括萬年青、一力、嘉應(yīng)、濟(jì)民等主流品牌產(chǎn)品，這些廠家的產(chǎn)品相似度均較高，在0.98以上。部分批次的相似度低于0.98，通過含量對(duì)比發(fā)現(xiàn)，S12相似度低是因?yàn)槊撍┬纳弮?nèi)酯的含量較低，S1-S7相似度低主要是因?yàn)槊缘闼帷?-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、4,5-二甲氧基鐵屎米酮等含量較低。CA中將S1-S3、S5-S6、S10分為一類，可能原因是這幾批的穿心蓮內(nèi)酯的含量相對(duì)其它樣品較低，與產(chǎn)地?zé)o關(guān)。而S33-S41因缺少苦木生物堿的含量，故沒有納入指紋圖譜研究范圍。PCA結(jié)合OPLS-DA發(fā)現(xiàn)4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯為樣品差異性的質(zhì)量標(biāo)志物，與上述指紋圖譜的研究結(jié)果相符，工藝生產(chǎn)中應(yīng)注意3種成分的傳遞規(guī)律。有文獻(xiàn)表明穿心蓮內(nèi)酯在長(zhǎng)時(shí)間的高溫環(huán)境下會(huì)降解成脫水穿心蓮內(nèi)酯等成分，工藝生產(chǎn)過程應(yīng)該控制好穿心蓮提取時(shí)的溫度[20]。

S1-S41樣品中都含有迷迭香酸，但含量差異較大，本研究也發(fā)現(xiàn)不同廠家的樣品經(jīng)70%甲醇提取后的液體顏色差異較大，溪黃草基原未明確可能是其原因之一，有相關(guān)文獻(xiàn)也證明不同基原中迷迭香酸的含量和汁液顏色有一定差異[21-22]。S33-S41樣品中有6批不含4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮，9批不含4,5-二甲氧基鐵屎米酮，而兩種成分均來源于苦木，生物堿作為苦木中主要的抗炎活性成分，其不同的藥用部位含量差異較大[23]。以上說明消炎利膽片的原料有一定差異，應(yīng)當(dāng)注意該投料藥材的來源、用藥部位、生產(chǎn)工藝等。

4.3 展望

本研究建立的指紋圖譜確定了11個(gè)共有峰，建立的含量測(cè)定方法對(duì)消炎利膽片的3味藥材主要活性成分都進(jìn)行了控制，為消炎利膽片中各成分的含量測(cè)定和生產(chǎn)工藝研究提供了參考，由于苦木和溪黃草中各成分含量差異較大，需進(jìn)行質(zhì)量傳遞規(guī)律研究的前提下，完善生產(chǎn)工藝，確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中各成分限量。

穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮中具有抗炎作用的活性成分，工藝生產(chǎn)時(shí)的溫度將會(huì)導(dǎo)致兩者的含量發(fā)生變化[24-26]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道穿心蓮內(nèi)酯對(duì)NO抑制的活性強(qiáng)于其分解產(chǎn)物脫水穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯，總內(nèi)酯的對(duì)NO抑制的活性又強(qiáng)于穿心蓮內(nèi)酯的對(duì)NO抑制的活性[27]。總內(nèi)酯中各成分的比例，某個(gè)成分的缺失或低于某一值后是否會(huì)對(duì)抗炎作用產(chǎn)生影響還需進(jìn)一步研究，同時(shí)需要對(duì)比兩者及不同比例總內(nèi)酯對(duì)炎癥患者的治療效果，以為工藝生產(chǎn)時(shí)更好的把控兩種成分的含量提供依據(jù)，確保藥物的一致性。

4種基原的溪黃草的抗炎活性差異應(yīng)進(jìn)一步研究，找出具有代表性的抗炎活性成分控制其質(zhì)量，明確其哪種基原作為消炎利膽片的原料更為合適，以保證藥物的有效性。