基于指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的不同貯藏年限對(duì)廣陳皮成分影響研究*

李曉芳，高 慧，朱紹光，周 鳴，劉亞平，葉喜德**

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004；3.江西新干縣三湖鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院 吉安 331303）

陳皮為蕓香科植物橘Citrμs reticμlataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，藥材分為“陳皮”和“廣陳皮（新會(huì)陳皮）”，而以廣陳皮為質(zhì)佳。廣陳皮為蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑Citrus reticulata‘Chachi’的干燥成熟果皮，具理氣健脾、燥濕化痰功效[1]。歷代本草典籍記載其以“陳久者良”，如《藥鑒》[2]中提到“陳皮須用隔年陳”，又如《本草匯言》[3]載“又他藥貴新，惟橘皮貴陳”。然而對(duì)其陳化年限的界定，歷代本草說(shuō)法不一，如1年、2年、3年或數(shù)十年等，也有“陳久”、“陳年”、“多年”等[4]。陳皮因陳化年份不同，其成分和藥理活性均有一定差別，對(duì)目前于陳皮年份的鑒別常通過(guò)感官評(píng)價(jià)法、近紅外光譜或測(cè)定其成分組成與含量來(lái)鑒別[5-7]?，F(xiàn)代研究中對(duì)于陳皮在存放過(guò)程中揮發(fā)性成分與黃酮類(lèi)成分研究較多，認(rèn)為陳皮在貯藏過(guò)程含量均會(huì)有所變化，但對(duì)于其具體的變化趨勢(shì)，不同學(xué)者研究結(jié)果不盡相同，結(jié)論不一[8-12]。

指紋圖譜是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制的重要方法之一，可以較為全面地表征中藥所含化學(xué)成分，而與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合可用于不同基原、不同產(chǎn)地、不同炮制品以及不同貯藏年限的中藥材成分差異評(píng)價(jià)。目前文獻(xiàn)對(duì)廣陳皮與陳皮的指紋圖譜研究雖較多[12-14]，但運(yùn)用指紋圖譜并結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法對(duì)不同貯藏年限廣陳皮進(jìn)行研究未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。且無(wú)論從本草典籍還是現(xiàn)有研究方面來(lái)看，對(duì)于陳皮陳化多久方可藥用或貯藏多久為質(zhì)佳仍未明確。基于此，本研究采用指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)貯藏年限1-10年的廣陳皮展開(kāi)整體性研究，并以主要差異成分含量作為定量測(cè)定指標(biāo)，探究不同貯藏年限對(duì)廣陳皮成分的影響。同時(shí)，依照成分含量變化差異，研究成分含量隨時(shí)間變化規(guī)律，以期為陳皮藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考，為揭示陳皮“陳久者良”科學(xué)內(nèi)涵提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 藥材與試劑

對(duì)照品橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素、5-去甲川陳皮素均購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公 司，批 號(hào) 分 別 為wkq20030407、wkq21060106、wkq20031701、wkq20041611、wkq21052610，純度均≥98%。乙腈和磷酸為色譜純（GRACE公司），實(shí)驗(yàn)用水為自制雙蒸水。

廣陳皮（編號(hào)S1-S10）購(gòu)于廣東省江門(mén)市新會(huì)陳皮村市場(chǎng)股份有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)胡生福副教授鑒定為經(jīng)鑒定為蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑（Citrus reticulata‘Chachi’）的干燥成熟果皮。10批陳皮藥材見(jiàn)表1、圖1。

表1 10批廣陳皮藥材產(chǎn)地與貯藏年限

圖1 10批廣陳皮藥材外觀比較

1.2 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（配備VWD紫外檢測(cè)器，安捷倫化學(xué)色譜工作站，美國(guó)安捷倫公司）；高速中藥粉碎機(jī)（型號(hào)：YF-111B，瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；超聲波清洗器（型號(hào)KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；十萬(wàn)分之一電子天平（型號(hào)：AE240，美國(guó)Mettler-Toledo 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Syncronis C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸（B）,梯度洗脫（0-28 min，10%-26% A；28-32 min，26%-30% A；32-34 min，30%-40% A；34-55 min，40%-55% A）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取各對(duì)照品適量，精密稱(chēng)重，加甲醇溶解并定容，過(guò)0.22 μm微孔濾膜。再取上述單一對(duì)照品適量，甲醇稀釋并定容，制得橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素、5-去甲川陳皮素質(zhì)量濃度分別為1.020 mg·mL-1、0.020 mg·mL-1、0.412 mg·mL-1、0.218 mg·mL-1、0.018 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取廣陳皮粉末0.50 g（過(guò)3號(hào)篩），精密稱(chēng)重，加入甲醇20 mL，超聲40 min后放冷稱(chēng)重，甲醇補(bǔ)足，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，得供試品溶液。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取廣陳皮粉末（S1），按“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行供試品溶液制備，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)6次。以橙皮苷（10號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積[15]，得相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.26%，相對(duì)峰面積RSD小于2.78%，表明該儀器的精密度良好。具體見(jiàn)表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間（RRT）和相對(duì)峰面積（RPA）

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取廣陳皮粉末（S1），按“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行供試品溶液制備，平行制備6份，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以橙皮苷（10號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.45%，相對(duì)峰面積RSD小于2.77%，表明該方法的重復(fù)性較好。具體見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間（RRT）和相對(duì)峰面積（RPA）

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取S1的同一份供試品溶液，分別于 0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h ，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以橙皮苷（10號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.38%，相對(duì)峰面積RSD小于2.65%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。具體見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間（RRT）和相對(duì)峰面積（RPA）

2.5 HPLC指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取10批廣陳皮粉末，按“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行供試品溶液的制備，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。將10批陳皮色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，以S1為參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正與Mark峰匹配，共確定了19個(gè)共有峰，10批廣陳皮的指紋圖譜見(jiàn)圖2。與橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素等對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出共有峰中的5個(gè)色譜峰，如圖3，分別為：峰10（橙皮苷）、峰13（甜橙黃酮）、峰15（川陳皮素）、峰18（橘紅素）、峰19（5-去甲川陳皮素）。以橙皮苷（峰10）為參照峰，計(jì)算10批廣陳皮共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，見(jiàn)表5和表6。結(jié)果得10批次樣品相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.14%-0.54%，相對(duì)峰面積的RSD為8.87%-52.07%。以對(duì)照?qǐng)D譜為參照?qǐng)D譜，對(duì)10批廣陳皮的指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，得10批樣品的相似度均大于0.990，表現(xiàn)出較強(qiáng)的相似性，具體見(jiàn)表7。分析發(fā)現(xiàn)，10批不同貯藏年限廣陳皮的圖譜相似度較高，但部分色譜峰相對(duì)峰面積RSD大，說(shuō)明部分成分含量仍存在一定差異。

圖2 10批廣陳皮的HPLC指紋圖譜

圖3 供試品溶液HPLC圖譜（A）與混合對(duì)照品溶液HPLC圖譜（B）

表5 10批廣陳皮共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表6 10批廣陳皮共有峰相對(duì)峰面積

表7 10批廣陳皮指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.6.1 聚類(lèi)分析（HCA）

系統(tǒng)聚類(lèi)是聚類(lèi)分析方法中的較為常見(jiàn)的一種，也稱(chēng)層次聚類(lèi)。將10批廣陳皮19個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 21版軟件中，采用離差平方和法（Ward法）聯(lián)結(jié)，歐式距離平方和為度量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，根據(jù)樣品相似度對(duì)其分類(lèi)，聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖見(jiàn)圖4。當(dāng)距離為10時(shí)，10批廣陳皮樣品可聚為3類(lèi)：S1、S3聚為一類(lèi)，S4、S6聚為一類(lèi)，S2、S5、S7-S10聚為一類(lèi)。這說(shuō)明不同貯藏年限對(duì)廣陳皮成分變化具有一定的影響，其中1年與3年廣陳皮成分變化較為接近，4年與6年廣陳皮較接近，而2年、5年，7-10年廣陳皮較接近。

圖4 10批廣陳皮聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

2.6.2 主成分分析（PCA）

進(jìn)一步將10批廣陳皮19個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SMICA 13.0軟件中，進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。一共得到4個(gè)主成分，累計(jì)R2X=0.895，代表模型的擬合能力；Q2=0.363代表了模型的預(yù)測(cè)能力，結(jié)果表明PCA的模型擬合度較好。由圖5中可看出，不同貯藏年限廣陳皮能有效區(qū)分，說(shuō)明10批廣陳皮樣品成分存在差異，其中S1、S3號(hào)樣品與聚集中心偏離程度較大，而S4、S6號(hào)樣品稍有偏離，這與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

圖5 10批廣陳皮（S1-S10）的PCA得分圖

將峰面積導(dǎo)入至SPSS 21軟件中，結(jié)果提取了4個(gè)特征值大于1的主成分，4個(gè)主成分的特征值為9.459、3.590、2.740、1.265，其方差貢獻(xiàn)率為49.787%、18.895%、14.422%、6.565%，累積貢獻(xiàn)率為89.760%，表明提取出的4個(gè)主成分可代表10批廣陳皮藥材的大部分信息。峰4、峰5、峰11、峰13（甜橙黃酮）、峰14、峰15（川陳皮素）、峰16、峰18（橘紅素）、峰19（5-去甲川陳皮素）在主成分1上有較高的載荷，峰2在主成分2上有較高的載荷（載荷絕對(duì)值大于0.7），具體見(jiàn)表8。載荷的絕對(duì)值越大，對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越大，對(duì)樣品的區(qū)分影響也越大，這表明以上成分是影響不同貯藏年限廣陳皮差異的主要成分。

表8 初始因子載荷矩陣

2.7 多成分含量測(cè)定

2.7.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下的5種成分的混標(biāo)溶液，加甲醇倍比稀釋為2、4、8、16、32倍，得6份不同濃度的混標(biāo)溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)（X），待測(cè)成分的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸。橙皮苷、甜橙黃酮等5種成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍見(jiàn)表9。

表9 5種化學(xué)成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍

2.7.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取廣陳皮粉末（S1），按“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行供試品溶液制備，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)6次，計(jì)算得橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素及5-去甲川陳皮素的保留時(shí)間RSD分別為0.07%、0.02%、0.03%、0.03%、0.06%，峰面積RSD分別為1.50%、1.26%、1.44%、1.22%、1.57%，表明該儀器精密度良好。具體見(jiàn)表10。

表10 5種成分的保留時(shí)間與峰面積及RSD

2.7.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取廣陳皮粉末（S1），按“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)行供試品溶液制備，平行制備6份，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素、5-去甲川陳皮素5種成分含量RSD分別為2.13%、1.88%、1.83%、1.79%、2.42%，表明該方法重復(fù)性良好。具體見(jiàn)表11。

表11 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中5種成分含量及RSD

2.7.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取S1的同一份供試品溶液，分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h以“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素、5-去甲川陳皮素峰面積的RSD分別為2.52%、1.48%、2.51%、2.10%、2.59%，表明24 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。具體見(jiàn)表12。

表12 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中5種成分峰面積及RSD

2.7.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的廣陳皮（S1）粉末6份，各0.25 g，精密稱(chēng)定，分別按供試品待測(cè)指標(biāo)成分含量100%，精密加入一定量的混標(biāo)溶液，按“2.1.3”項(xiàng)方法進(jìn)行供試品溶液制備，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算得橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素、5-去甲川陳皮素的加樣回收率分別為96.92%、96.18%、98.46%、99.75%、98.19%，RSD分別為2.12%、2.21%、2.95%、3.08%、2.02%。具體見(jiàn)表13。

表13 廣陳皮中5種成分的加樣回收率

2.7.6 樣品含量測(cè)定

取10批廣陳皮粉末（過(guò)3號(hào)篩）0.50 g，精密稱(chēng)定，制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、5-去甲川陳皮素5種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表14，變化趨勢(shì)結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，10批廣陳皮中橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素和5-去甲川陳皮素的含量依次為20.940 mg·g-1-34.780 mg·g-1、0.344 mg·g-1-0.517 mg·g-1、4.667 mg·g-1-7.456 mg·g-1、3.592 mg·g-1-5.879 mg·g-1、0.391 mg·g-1-0.710 mg·g-1。這表明不同貯藏年限的廣陳皮中橙皮苷、甜橙黃酮以及川陳皮素等多種成分含量存在差異。

圖6 10批廣陳皮（S1-S10）多成分含量變化趨勢(shì)

表14 10批廣陳皮含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇

廣陳皮主要成分為黃酮，具抗氧化、抗炎、抗腫瘤與保肝等藥理作用。其中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素為2020版《中國(guó)藥典》中廣陳皮質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)成分，橙皮苷因具較強(qiáng)的清除氧自由基能力，表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化活性；川陳皮素能舒張支氣管具平喘作用，同時(shí)具有神經(jīng)保護(hù)作用；甜橙黃酮抗血管生成，同時(shí)可抑制人AGS胃癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用；橘皮素具有很好的祛痰、理氣作用；而5-去甲川陳皮素具抗炎作用[15-16]。結(jié)合指紋圖譜與主成分分析可知，除橙皮苷外的其它4個(gè)成分是引起不同貯藏年限廣陳皮差異的成分，故本研究選擇橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素和5-去甲川陳皮素作為定量分析指標(biāo)。

3.2 提取條件的優(yōu)化

比較提取溶劑與提取時(shí)間對(duì)廣陳皮中橙皮苷、甜橙黃酮與川陳皮素等黃酮類(lèi)成分含量，及對(duì)指紋圖譜色譜峰數(shù)量的影響，對(duì)提取溶劑50%甲醇、70%甲醇、純甲醇與超聲提取時(shí)間20 min、30 min、40 min進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，提取溶劑為純甲醇時(shí)對(duì)陳皮成分的提取效率最好，超聲提取40 min對(duì)各成分的提取效率高于20 min、30 min，最終確定提取溶劑為純甲醇，超聲提取時(shí)間為40 min。

3.3 指紋圖譜及多元統(tǒng)計(jì)分析

中藥指紋圖譜可獲得標(biāo)示中藥材共有峰的色譜圖，能較全面反映中藥材化學(xué)成分信息，具整體性、模糊性等特點(diǎn)。聚類(lèi)分析與主成分分析是常用的多元統(tǒng)計(jì)方法。聚類(lèi)分析是一種將未知類(lèi)別的樣本，根據(jù)相似性大小進(jìn)行聚類(lèi)劃分的方法；而主成分分析是一種降維統(tǒng)計(jì)方法，依據(jù)貢獻(xiàn)率大?。ā?5%），把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)來(lái)反映原始數(shù)據(jù)的信息。指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，有助于對(duì)中藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[17]。

本研究建立了貯藏年限1年-10年廣陳皮的HPLC特征指紋圖譜并進(jìn)行相似度分析，同時(shí)結(jié)合聚類(lèi)分析、主成分分析等多元統(tǒng)計(jì)方法，比較了不同貯藏年限廣陳皮成分變化差異。指紋圖譜相似度結(jié)果表明，10批廣陳皮具有較好的一致性，總體質(zhì)量保持穩(wěn)定，但部分色譜峰相對(duì)峰面積RSD大，仍存在一定差異。聚類(lèi)分析將10批不同貯藏年限廣陳皮分為3類(lèi)，但并未呈現(xiàn)出按貯藏年限聚類(lèi)趨勢(shì)，提示貯藏年限只是廣陳皮成分與質(zhì)量變化的影響因素之一。而造成該聚類(lèi)差異的主要色譜峰有甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素與5-去甲川陳皮素，其中部分成分未進(jìn)行有效指認(rèn)，故后續(xù)可通過(guò)LC-MS技術(shù)鑒定其余未知成分。

3.4 多成分含量測(cè)定

中藥在貯藏過(guò)程中自身化學(xué)成分會(huì)發(fā)生變化，且隨著貯藏時(shí)間的變化其成分含量發(fā)生相應(yīng)的變化。如橙皮苷常隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加[18]，但研究也發(fā)現(xiàn)橙皮苷成分下降時(shí)，橘皮素成分含量卻增加[19]。但也有研究發(fā)現(xiàn)其黃酮類(lèi)含量變化較小[20]，或隨貯藏年份變出現(xiàn)波動(dòng)變化[21]，或部分成分含量在3-10年內(nèi)增加，15-30年下降[22]。而本研究對(duì)貯藏年限1年-10年廣陳皮中藥典指標(biāo)成分橙皮苷與差異成分甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、5-去甲川陳皮素共5種成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各成分含量隨貯藏時(shí)間增加呈波動(dòng)變化，且其變化趨勢(shì)存在一定相似性，如與1年陳皮比較，2年陳皮的5種成分含量呈升高趨勢(shì)，3年陳皮則又呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)，而后隨時(shí)間延長(zhǎng)各成分含量呈現(xiàn)出一定的波動(dòng)增加與下降趨勢(shì)，這與部分學(xué)者的研究結(jié)果一致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同貯藏年限廣陳皮藥材進(jìn)行了指紋圖譜和多元統(tǒng)計(jì)分析研究，并建立了廣陳皮HPLC指紋圖譜與橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素等多成分HPLC含量測(cè)定方法。該法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于不同貯藏年限廣陳皮藥材的指紋圖譜研究和多成分含量測(cè)定。另外，指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明廣陳皮隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其整體質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，但具體成分含量存在差異。其中橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素與5-去甲川陳皮素等5種成分含量呈波動(dòng)變化，而不是隨著貯藏年份增長(zhǎng)而增加的。故陳皮在貯藏過(guò)程中，上述成分的變化與其“陳久者良”是否存在相關(guān)性尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。