基于聚類分析和主成分分析的不同產(chǎn)地龍船花全草質(zhì)量評價*

任賽賽，張志清，潘為高，劉 劍，張玉倩，解偉偉，楊珍珍，延雨濛，靳怡然**

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 石家莊 050017；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南寧 530001）

龍船花（Ixora chinensisLam.）為茜草科龍船花屬植物。龍船花又稱賣子木，在《雷公炮炙論》、《新修本草》、《本草綱目》、《千金翼方》等歷代古籍中均有記載，其花、葉、莖、根皆可入藥，具有清熱涼血、活血散瘀、止痛的功效，用于治療高血壓、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、跌打損傷、瘡瘍癤腫等[1]。龍船花原產(chǎn)于中國、緬甸和馬來西亞。在中國主要分布于福建、廣東、中國香港、廣西壯族自治區(qū)、海南[2]?，F(xiàn)代研究表明龍船花具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[3]。龍船花中含有黃酮類化合物表兒茶素、槲皮素-3-O-α-L-鼠李吡喃糖苷、山萘酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、兒茶素、異鼠李素、槲皮素和山柰酚等[4-6]；環(huán)烯醚萜類化合物京尼平苷酸、ixoroside、ixoside（7,8-dehydroforsythide）等[7]；苯丙素類化合物綠原酸和東莨菪內(nèi)酯等[5-6]。綠原酸具有清除自由基、抗菌消炎、保肝利膽、抑制腫瘤、降血壓、降血脂及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用[8]。東莨菪內(nèi)酯具有降糖作用[9]。龍船花中主要的藥效物質(zhì)有可能是揮發(fā)油、黃酮類、苯丙素類、有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜類、酚類等成分，包括龍船花脂酸[10]、山柰酚、異鼠李素、東莨菪內(nèi)酯、熊果酸、齊墩果酸、綠原酸等。這些天然產(chǎn)物不僅結(jié)構(gòu)復(fù)雜相似，一些化合物彼此間在雙鍵、羥基、甲基組成上僅存在位置或數(shù)量上的細(xì)微差異，有的還包含多對同分異構(gòu)體。目前，龍船花的成分分析方法主要采用滴定分析法、薄層分析法和高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GCMS）等。通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，陳麗君等[11]研究發(fā)現(xiàn)，抱莖龍船花揮發(fā)油的脂溶性成分主要包含脂肪酸、酯類、芳香酸酯、烷烴類及芳香類化合物。任賽賽等[12]分析了龍船花全草揮發(fā)油部分的化學(xué)成分。蔣珍藕等[13]分析了龍船花花朵中揮發(fā)油的化學(xué)成分。李文琪等[14]建立了可以同時鑒別和測定龍船花中的熊果酸和齊墩果酸的薄層色譜方法和高效液相色譜法。羅統(tǒng)勇[15]建立了東莨菪內(nèi)酯作為壯藥龍船花藥材含量測定指標(biāo)的高效液相色譜法。綜上所述，已報道的測定龍船花藥材的高效液相色譜法大多只能測定其中1-2種成分的含量，不能準(zhǔn)確反映藥材的質(zhì)量，而對于龍船花藥材質(zhì)量的研究也多以揮發(fā)油為主。為保證用藥的安全有效，建立一個能準(zhǔn)確反映藥材全草質(zhì)量的檢測方法非常重要。

中藥具有復(fù)雜的化學(xué)成分，并且配伍藥物較多，經(jīng)常是復(fù)方使用，藥物作用的特點是多靶點、多層次以及多環(huán)節(jié)[16]?？的钚赖萚17]運用多元統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行了聚類分析和主成分分析，合理地評價了各產(chǎn)地酒黃連藥材的質(zhì)量。課題組前期已開展龍船花全草化學(xué)成分及龍船花根的炮制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[10,18]。在此基礎(chǔ)上，本研究根據(jù)含量測定[19-21]的方法，基于聚類分析和主成分分析方法，選擇京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素和山柰酚這5種成分作為指標(biāo)性成分，比較廣東、廣西壯族自治區(qū)、福建、江蘇等不同產(chǎn)地間龍船花全草的5種指標(biāo)性成分的含量差異，以期為龍船花的質(zhì)量控制，野生與栽培品種的資源拓展及藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)的闡述提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Waters e2695型，包括UV型紫外檢測器，美國Waters公司）；渦旋混合器（XW-80A型，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；超聲波清洗器（RKQ-300型，昆山市超聲儀器有限公司，功率300 W，頻率40 kHz）；高速離心機(jī)（R18型，北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；電子分析天平（CPA225D型，德國Sartorius公司）；低溫冰箱（MDF-U2086S型，日本三洋公司）；高速多功能粉碎機(jī)（HC-800Y型，武義海納電器有限公司）。

1.2 材料

18批龍船花全草藥材為2020年10月-2021年4月采購自廣西壯族自治區(qū)防城港、廣東廣州、江蘇宿遷等地，采購地點及編號詳見表1。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授和朱意麟實驗師鑒定為茜草科龍船花屬植物龍船花Ixora chinensisLam.的全草。槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100081-200907），綠原酸、京尼平苷酸、山柰酚、東莨菪內(nèi)酯對照品（南京廣潤生物制品有限公司，批號分別為GR-137-200303、GR-137-200319、GR-137-200526、GR-137-200702）。

表1 樣品信息

1.3 試劑

甲醇（美國Fisher公司，色譜純）；乙腈（美國Fisher公司，色譜純）；甲酸（上海阿拉丁生化科技有限公司，色譜純）；蒸餾水（屈臣氏）。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）溶液，梯度洗脫，梯度洗脫（0-18 min，95%-84% A；18-22 min，84%-80% A；22-33 min，80%-65% A；33-45 min，65%-50% A；45-47 min，50%-70% A；47-50 min，70%-95% A）。檢測波長268 nm（0-12 min，檢測京尼平苷酸）、344 nm（12-37 min，檢測綠原酸、東莨菪內(nèi)酯）、350 nm（37-41 min，檢測槲皮素）、254 nm（41-50 min，檢測山柰酚），柱溫25℃；體積流量1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。龍船花藥材供試品及對照品色譜圖，如圖1所示。

圖1 混合對照品（A）及龍船花供試品（B）色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定干燥至恒重的京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素、山柰酚對照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制得質(zhì)量濃度依次為218、364、44、10、20 μg·mL-1的對照品母液。取對照品母液，逐級稀釋，得到各系列濃度混合對照品溶液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備

稱取干燥的龍船花粉末約1.0 g（精密稱定至所取重量的千分之一），精密加入100%甲醇25 mL，稱重，密塞，靜置30 min，超聲40 min（功率300 W，頻率40 kHz），放置冷卻后，用甲醇補足減失的重量，搖勻，進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，制得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

精密吸取各系列濃度的混合對照品溶液。在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣20 μL，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系

2.4.2 精密度試驗

稱取龍船花粉末1份（S8），按“2.3”項下制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素、山柰酚峰面積RSD分別為1.7%、1.9%、2.3%、2.4%、1.8%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗

稱取龍船花粉末6份（S8），按“2.3”項下制備供試品溶液，按照“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，記錄京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素、山柰酚的峰面積。計算京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素、山柰酚質(zhì)量濃度的RSD分別為2.8%、2.9%、2.9%、2.1%、2.7%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

稱取龍船花粉末（S8）約1 g，按“2.3”項下制備供試品溶液，室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素、山柰酚的峰面積RSD分別為1.6%、1.8%、1.7%、1.8%、1.5%。表明該龍船花樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗

稱取6份已知成分含量的龍船花粉末（S8），每份約0.5 g，精密加入混合對照品適量，按“2.3”項下制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)樣，計算得到京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素、山柰酚的平均加樣回收率分別為98.54%、93.76%、99.54%、97.98%、99.91%，RSD分別為0.66%、1.29%、1.24%、1.47%、0.78%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.5 含量測定

分別取18批樣品，按“2.3”項下制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)行含量測定，記錄京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素、山柰酚的峰面積，計算5種成分的含量。結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果（±s，n=3，mg·g-1）

表3 各成分含量測定結(jié)果（±s，n=3，mg·g-1）

產(chǎn)地S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18京尼平苷酸2.193±0.008 2.148±0.013 2.165±0.017 1.817±0.004 1.601±0.017 1.792±0.009 2.072±0.023 2.813±0.031 2.746±0.005 2.759±0.003 3.413±0.049 2.831±0.065 2.642±0.032 2.965±0.021 2.807±0.018 2.991±0.007 3.362±0.039 3.281±0.004綠原酸4.862±0.027 4.261±0.020 4.462±0.024 4.358±0.027 3.576±0.098 4.323±0.082 2.014±0.020 1.789±0.041 1.894±0.029 3.999±0.025 4.151±0.050 4.067±0.046 2.829±0.055 3.149±0.044 3.152±0.053 2.786±0.070 3.165±0.030 2.943±0.070東莨菪內(nèi)酯0.623±0.015 0.593±0.014 0.618±0.019 0.429±0.010 0.313±0.009 0.364±0.005 0.228±0.003 0.160±0.003 0.192±0.004 0.287±0.002 0.221±0.005 0.242±0.004 1.001±0.023 1.081±0.030 1.013±0.030 0.599±0.001 0.667±0.015 0.620±0.009槲皮素0.017±0.001 0.016±0.000 0.013±0.000 0.010±0.000 0.013±0.000 0.014±0.000 0.011±0.000 0.010±0.000 0.013±0.000 0.013±0.000 0.011±0.000 0.011±0.000 0.029±0.001 0.042±0.001 0.043±0.001 0.023±0.000 0.021±0.000 0.025±0.001山柰酚0.051±0.001 0.091±0.002 0.070±0.001 0.059±0.001 0.053±0.001 0.058±0.001 0.107±0.001 0.090±0.002 0.105±0.003 0.107±0.002 0.101±0.002 0.111±0.003 0.048±0.001 0.039±0.001 0.040±0.001 0.050±0.000 0.053±0.002 0.051±0.001

2.6 不同產(chǎn)地龍船花全草聚類分析

使用SPSS 20.0軟件，對18批不同產(chǎn)地龍船花全草樣品的京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素、山柰酚的含量進(jìn)行了系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖2。18批樣品一共分為3大類，其中S7-S12為第1大類，主要為廣西壯族自治區(qū)防城港和廣東惠州產(chǎn)樣品，該2產(chǎn)地各批次藥材均為野生品種，主要生長于山地，其受到日照、溫度、生長年限、土壤等影響，與其他產(chǎn)地的栽培品種含量產(chǎn)生了差異，其總體含量不如栽培品種含量高；S1-S6為第2大類，主要為福建漳州和江蘇宿遷產(chǎn)地樣品，該2產(chǎn)地主要位于中亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林地帶，較其他產(chǎn)地緯度偏高，其中綠原酸和山柰酚含量較高，以福建漳州產(chǎn)地（S1）綠原酸含量最高為4.862 mg·g-1。S13-S18為第3大類，主要集中在廣東揭陽和廣東廣州地區(qū)，屬于南亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林地帶，其中京尼平苷酸、東莨菪內(nèi)酯和槲皮素含量較高。聚類后不同類群的龍船花全草中各成分平均含量比較見表4。結(jié)果表明各類群的含量均存在顯著性差異（P〈0.05）。

圖2 不同產(chǎn)地龍船花全草的聚類分析圖

表4 聚類后3類產(chǎn)區(qū)全草中各成分平均含量比較（±s）

表4 聚類后3類產(chǎn)區(qū)全草中各成分平均含量比較（±s）

注：同一行不同小寫字母表示P〈0.05差異顯著。

化合物京尼平苷酸綠原酸東莨菪內(nèi)酯槲皮素山柰酚含量（mg·g-1）第1類（S7-S12）2.772±0.426a 2.986±1.934b 0.222±0.043c 0.012±0.001b 0.104±0.007a第2類（S1-S6）1.952±0.249b 4.307±0.417a 0.490±0.138b 0.014±0.002b 0.637±0.015b第3類（S13-S18）3.008±0.274a 3.004±0.174b 0.830±0.223a 0.030±0.010a 0.047±0.006c

綜上所述，藥材質(zhì)量較好的為廣東揭陽和廣東廣州地區(qū)，與傳統(tǒng)認(rèn)為的道地產(chǎn)地一致，福建和江蘇產(chǎn)龍船花質(zhì)量次之。通過含量測定及聚類分析結(jié)果可以看出，第1類地區(qū)的樣品有效成分含量較低，有些有效成分可能隨著藥材生長年限的增加反而逐漸降低，提示龍船花藥材并非生長年限越長質(zhì)量越好，其需要合適的采收時間。

2.7 不同產(chǎn)地龍船花全草主成分分析

2.7.1 特征值和方差貢獻(xiàn)率

采用SPSS 20.0軟件，依據(jù)主成分的特征值和貢獻(xiàn)率，對不同產(chǎn)地的18批龍船花藥材進(jìn)行主成分分析。KMO檢驗和Bartlett檢驗用于驗證數(shù)據(jù)是否適合進(jìn)行主成分分析[22]，結(jié)果得到不同產(chǎn)地龍船花全草的KMO度量值為0.602，Bartlett檢驗法結(jié)果P〈0.001，均符合要求。由表5可知，前3個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到93.916%（〉80%），可代表龍船花藥材中5個有效成分的大部分信息內(nèi)容。因此可將這3個作為主成分用于18批龍船花樣品進(jìn)行質(zhì)量評價。5個有效成分含量的碎石圖見圖3。各變量對前3個主成分的貢獻(xiàn)可用初始因子載荷矩陣和公共因子載荷散點圖來表示（表6，圖4），東莨菪內(nèi)酯、槲皮素在第一主成分上有著較高的載荷，這說明第一主成分主要反映東莨菪內(nèi)酯、槲皮素的信息；京尼平苷酸、山柰酚在第二主成分上有著較高的載荷，這說明第二主成分主要反映京尼平苷酸、山柰酚的信息；綠原酸主要在第三主成分上有著較高的載荷，這說明第三主成分主要反映綠原酸的信息。

表5 不同產(chǎn)地龍船花全草的主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率

圖3 不同產(chǎn)地龍船花全草的主成分碎石圖

表6 不同產(chǎn)地龍船花全草的初始因子載荷矩陣

圖4 不同產(chǎn)地龍船花全草的主成分載荷散點圖

2.7.2 龍船花全草藥材綜合評價

將龍船花全草5種藥效成分含量的標(biāo)準(zhǔn)化值代入以下公式，用3個主成分對各樣品進(jìn)行綜合評價，其綜合評價函數(shù)為：

Z1、Z2、Z3、Z4、Z5分別為京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)化后的變量，以F1、F2、F3三個主成分的得分貢獻(xiàn)率為標(biāo)準(zhǔn)，對主成分得分進(jìn)行加權(quán)平均，得到綜合得分（F），綜合得分排序結(jié)果詳見表7（綜合得分反應(yīng)龍船花藥材中有效成分的統(tǒng)計質(zhì)量，得分越高表明統(tǒng)計質(zhì)量越好）。排名第一者為S14，排名第二者為S15，排名第三者為S13，排名第四到第十分別為S18、S17、S16、S1、S8、S9、S11，可見排名前十中80%的供試品為廣東地區(qū)龍船花藥材?？傮w來說，屬于南亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林地帶的廣東各地區(qū)的龍船花全草質(zhì)量較好，與其他地區(qū)的龍船花有一定差異，這與上述聚類分析的差異性結(jié)果相一致。

表7 不同產(chǎn)地龍船花全草的主成分值、綜合得分及排序表

3 討論

中藥的顯著特點是其成分具有多樣性和復(fù)雜性，無論是單味藥還是復(fù)方，都是多種化學(xué)成分的一個集合體，故以單一指標(biāo)成分控制中藥質(zhì)量顯然不足以表明其整體信息。而多指標(biāo)成分同時進(jìn)行定量，可準(zhǔn)確控制其質(zhì)量，以保證有效性成分的穩(wěn)定性和其藥理活性[22]。本研究分別對0.05%甲酸水、0.1%磷酸水、0.1%甲酸水等多種流動相進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動相為乙腈-0.05%甲酸水時，梯度洗脫，各色譜峰在較短的時間達(dá)到完全分離。通過對不同的提取溶劑100%乙醇、100%甲醇、70%甲醇、80%甲醇進(jìn)行了考察對比，乙醇作提取溶劑時，所得色譜峰與甲醇提取色譜峰差距不太大，考慮到乙醇比甲醇易揮發(fā)，所以選擇不易揮發(fā)的甲醇為提取溶劑；不論選擇100%、80%、70%甲醇作為提取溶劑，有效成分含量均較高、差異不明顯?；?00%甲醇在-20℃冰箱易于存放，解凍迅速，操作簡便，便于保存樣品，故選擇100%甲醇為提取溶劑。對于龍船花全草藥材用回流提取和超聲提取時，甲醇溶液回流提取1 h比超聲提取效果略優(yōu)，但整體差別不大，考慮到操作簡單，節(jié)省資源等方面，選擇了超聲提取。檢測波長均選擇了各物質(zhì)的最強(qiáng)吸收波長，并且基線平穩(wěn)，268 nm（0-12 min，檢測京尼平苷酸）、344 nm（12-37 min，檢測綠原酸、東莨菪內(nèi)酯）、350 nm（37-41 min，檢測槲皮素）、254 nm（41-50 min，檢測山柰酚）。

本項研究中，我們對福建漳州、江蘇宿遷、廣東惠州、廣西壯族自治區(qū)防城港、廣東揭陽、廣東廣州6個產(chǎn)地從2020年10月-2021年4月的18批次龍船花全草進(jìn)行了檢測。運用HPLC法測定了18批樣品藥材中京尼平苷酸、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素、山柰酚5種活性成分的含量，并使用聚類分析和主成分分析方法分析了5個有效成分的含量測定結(jié)果。通過主成分分析得到各批樣品的綜合得分排名，得分越高，表明藥材質(zhì)量越好。由各藥材的綜合排名可知，在排名前十的樣品中，南亞熱帶季風(fēng)常綠闊葉林地帶的廣東地區(qū)的樣品占80%，相對于來自其他產(chǎn)地的市售龍船花全草藥材，質(zhì)量總體較好。這與聚類分析所得結(jié)果一致，提示藥材生產(chǎn)應(yīng)考慮產(chǎn)地的影響。綜上所述，基于聚類分析方法和主成分分析法測定不同產(chǎn)地龍船花全草中有效成分的含量，可為龍船花種植、栽培和質(zhì)量評價提供依據(jù)。