基于HPLC指紋圖譜、多指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的懷牛膝質(zhì)量評(píng)價(jià)*

王彥夫，劉 艷，楊琬琪，匡海學(xué)，楊炳友

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150040）

牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根，主產(chǎn)于河南，全國(guó)各地均有栽培，道地產(chǎn)區(qū)為河南省焦作市，為“四大懷藥”之一，習(xí)稱其為懷牛膝。2020版《中國(guó)藥典》[1]記載其具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行的功效。臨床上常用于急性咽炎、高血壓、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、引產(chǎn)、功能失調(diào)性子宮出血等癥。

國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道表明牛膝根內(nèi)含有皂苷類、甾酮類、多糖類、生物堿等成分[2-7]。其中，甾酮類化合物為牛膝的主要成分之一，具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛抗炎、抗骨質(zhì)酥松等活性[8-10]。牛膝藥材質(zhì)量受多因素影響，不同產(chǎn)地的牛膝藥效有顯著差異，這可能是因?yàn)椴煌a(chǎn)地的牛膝所含的化學(xué)成分不同或其部分化學(xué)成分的含量有所不同。

含量測(cè)定為歷代《中國(guó)藥典》中判定藥材質(zhì)量的常用方法，具有方法簡(jiǎn)單、成本低、易操作等優(yōu)點(diǎn)[11]，現(xiàn)2020版《中國(guó)藥典》中對(duì)牛膝的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅以β-蛻皮甾酮含量判斷不夠全面。隨著中藥指紋圖譜的研究越來(lái)越深入，將指紋圖譜作為質(zhì)量控制的方法得到了廣泛應(yīng)用，中藥指紋圖譜可對(duì)成分復(fù)雜的中藥材及制劑，進(jìn)行色譜分析得到豐富的化學(xué)信息，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同中藥材及制劑的質(zhì)量控制[12]。化學(xué)計(jì)量學(xué)的出現(xiàn)及應(yīng)用更是將指紋圖譜中所包含的化學(xué)信息提取并數(shù)字化，可對(duì)大量樣品進(jìn)行全面準(zhǔn)確的鑒別歸類，為中藥材的質(zhì)量控制提供了極大的便利[13]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多指標(biāo)含量測(cè)定并建立HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)河南省不同產(chǎn)地的懷牛膝藥材建立更加全面的懷牛膝質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為懷牛膝的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

萬(wàn)分之一電子分析天平（AL204，梅特勒-托利多），超聲波清洗器（KQ-250E，昆山超聲儀器有限公司），高效液相色譜（型號(hào)：e2695；檢測(cè)器型號(hào)：2998 PDA檢測(cè)器，美國(guó)Waters科技有限公司）。15批懷牛膝經(jīng)樊銳鋒副教授鑒定（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院）均為莧科科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根，保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室（產(chǎn)地見(jiàn)表1），水為超純水，甲酸、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，β-蛻皮甾酮（純度≥98%，LOT：HR20625W5）、25R-牛膝甾酮（純度≥95%，LOT：HR20924W3）、25S-牛膝甾酮（純度≥98%，LOT：HR4229W4）均采購(gòu)自寶雞晨光生物科技有限公司，所購(gòu)藥材晾干，粉碎后過(guò)3號(hào)篩備用[12]。

表1 15批懷牛膝藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色 譜 柱 為Waters SunFire C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以A：乙腈，B：0.1%甲酸水為流動(dòng)相；梯度洗脫條件見(jiàn)表2，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣10 μL，柱溫為25℃，洗脫時(shí)間為70 min，理論板數(shù)按β-蛻皮甾酮峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

表2 梯度洗脫條件

2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱取β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮對(duì)照品適量，制成濃度分別為2.57、0.55、0.74 mg·mL-1的對(duì)照品母液。分別精密量取β-蛻皮甾酮對(duì)照品母液800 μL，25S-牛膝甾酮對(duì)照品母液500 μL，25R-牛膝甾酮對(duì)照品母液500 μL，混合，定容至2 mL，搖勻，得到β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮濃度依次為1.14、0.15、0.21 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取懷牛膝粉末（過(guò)三號(hào)篩）5 g，置錐形瓶中，加水飽和正丁醇30 mL，密塞，浸泡過(guò)夜，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，濾過(guò)，用甲醇10 mL分?jǐn)?shù)次洗滌容器及殘?jiān)?，合并濾液和洗液，減壓回收至干，以甲醇定容至1 mL，離心取上清液，過(guò)0.22 μm濾膜，即得[14]。

2.4 方法學(xué)考察

取河南省焦作市的懷牛膝藥材粉末，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液；2.1項(xiàng)下色譜條件，以β-蛻皮甾酮為參照峰，通過(guò)計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積對(duì)該方法重復(fù)性，儀器精密度以及樣品穩(wěn)定性進(jìn)行考察。精密稱取6份，每份5 g進(jìn)行重復(fù)性考察，取其中一份連續(xù)測(cè)定6次進(jìn)行精密度考察，并在室溫條件下，分別于0、2、4、8、16、24 h時(shí)進(jìn)行穩(wěn)定性考察。其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均〈2.0%，相對(duì)峰面積RSD均〈3.0%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好，儀器精密度良好，樣品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 懷牛膝指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

精密稱取15批不同產(chǎn)地的懷牛膝藥材粉末各5 g，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，提取記錄各樣品色譜圖，并將15批樣品的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）》中，設(shè)S1號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度0.10 min，采用中位數(shù)法，多點(diǎn)校正后得到15批懷牛膝藥材HPLC圖譜疊加圖（圖1），及對(duì)照指紋圖譜（R）（圖2）。共得到31個(gè)共有峰，計(jì)算各樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度結(jié)果為0.979、0.892、0.896、0.902、0.958、0.978、0.912、0.973、0.977、0.972、0.969、0.876、0.943、0.967、0.802由該相似度分析結(jié)果顯示，11批樣品的相似度大于0.900，其差異性較小，其中產(chǎn)地為河南省安陽(yáng)市的S2、S3兩批藥材以及河南省駐馬店市的S12、S15兩批藥材相似度小于0.900，說(shuō)明不同產(chǎn)地中個(gè)別批次的懷牛膝藥材成分具有一定的差異性[15-16]。

圖1 15批牛膝藥材樣品指紋圖譜

圖2 懷牛膝藥材對(duì)照指紋圖譜(R)

2.5.2 共有峰的指認(rèn)

按2.2項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液，2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，將得到的色譜圖（圖3）與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比可知，峰13為β-蛻皮甾酮，峰14為25R-牛膝甾酮，峰15為25S-牛膝甾酮。

圖3 混合對(duì)照品HPLC圖

2.6 三種指認(rèn)成分含量測(cè)定

2.6.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮對(duì)照品適量，至5 mL量瓶中，加甲醇定容，得到濃度依次為3.214、0.414、0.630 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液適量，加甲醇定容，梯度稀釋，共得到混合對(duì)照品溶液6份，見(jiàn)表3。

表3 六種梯度混合對(duì)照品濃度

2.6.2 線性關(guān)系考察

按2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)配制的混合對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮進(jìn)樣量（mg）為橫坐標(biāo)（x），以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。其線性回歸方程及線性范圍見(jiàn)表4。

表4 混合對(duì)照品溶液HPLC分析回歸方程測(cè)定結(jié)果

2.6.3 精密度

取2.6.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行連續(xù)6次測(cè)定，積分獲得β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面積，在6次測(cè)定下，3種成分的峰面積RSD均〈2.0%，說(shuō)明儀器具有良好的精密度。

2.6.4 重復(fù)性

取河南省焦作市的懷牛膝藥材粉末6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液；2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行重復(fù)性考察。積分獲得β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面積。其6份樣品中3種待測(cè)成分的峰面積RSD均〈3.0%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性

取河南省焦作市的懷牛膝藥材粉末6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液；2.1項(xiàng)下色譜條件，在室溫條件下分別于0、2、4、8、16、24 h時(shí)進(jìn)行穩(wěn)定性考察，積分獲得β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面積。其中3種待測(cè)成分的峰面積RSD均〈3.0%，說(shuō)明該樣品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.6 加樣回收率

精密稱取已知含量的懷牛膝藥材粉末約1 g，置錐形瓶中，精密加入用水飽和正丁醇配制的混合對(duì)照品溶液（β-蛻皮甾酮142 μg·mL-1，25R-牛膝甾酮43 μg·mL-1，25S-牛膝甾酮30 μg·mL-1）5 mL和水飽和正丁醇25 mL，按2.3項(xiàng)下方法制備加樣供試溶液，測(cè)定并計(jì)算β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮的加樣回收率，測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)表5，6，7。

表5 β-蛻皮甾酮加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表6 25R-牛膝甾酮加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表7 25S-牛膝甾酮加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.6.7 樣品測(cè)定

將15批懷牛膝藥材按2.3項(xiàng)處理后進(jìn)樣分析，獲得15批懷牛膝藥材樣品中β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮的峰面積，利用測(cè)得的結(jié)果，計(jì)算懷牛膝樣品中3種甾酮類成分的含量，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 15批懷牛膝藥材樣品含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）

2.7 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.7.1 聚類熱圖分析

將15批懷牛膝指紋圖譜的31個(gè)共有色譜峰的峰面積組成31×15階矩陣，導(dǎo)入Metabo Analyst 5.0網(wǎng)站中進(jìn)行聚類熱圖分析。以共有峰峰面積作為變量，采用標(biāo)準(zhǔn)化中位數(shù)法，得到聚類熱圖，見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，15批懷牛膝樣品被分為3類，S1、S2、S3、S4、S5聚為一類，其產(chǎn)地均為河南省安陽(yáng)市，且其指紋圖譜共有峰中2、3、5、10、11、16、24、26、27號(hào)峰代表的化學(xué)成分明顯高于安陽(yáng)市和焦作市兩個(gè)產(chǎn)地；S6、S7、S8、S9、S10聚為一類，其產(chǎn)地均為河南省焦作市，其中共有峰1、4、6、7、8、9、12、13、14、15、18、21、22、25、28、29、30、31所代表的成分含量略高于安陽(yáng)市所產(chǎn)懷牛膝，高于駐馬店市所產(chǎn)懷牛膝；S11、S12、S13、S14、S15聚為為一類，其產(chǎn)地均為河南省駐馬店市，其中17、19、20、23號(hào)峰代表的化學(xué)成分明顯高于安陽(yáng)市和駐馬店市兩個(gè)產(chǎn)地。

圖4 15批懷牛膝藥材樣品的聚類熱圖

2.7.2 主成分分析

將15批懷牛膝指紋圖譜的31個(gè)共有色譜峰的峰面積組成31×15階矩陣導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，建立PCA模型，采用自標(biāo)度化法（UV）進(jìn)行縮放，提取2個(gè)主成分，得到模型解釋率參數(shù)R2X為0.700，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.544，表明提取的主成分可解釋70.0%的原始變量，模型的預(yù)測(cè)能力為54.4%。15批懷牛膝樣品的PCA得分圖見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示15批懷牛膝樣品能基本分為3類，與聚類分析結(jié)果相互佐證，進(jìn)一步說(shuō)明不同產(chǎn)地懷牛膝化學(xué)成分的含量存在一定的差異。

圖5 15批懷牛膝藥材樣品的PCA得分圖

2.7.3 偏最小二乘法-判別分析

為進(jìn)一步尋找不同產(chǎn)地懷牛膝間的差異性成分，我們對(duì)15批懷牛膝樣品進(jìn)行PLS-DA分析。將共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，獲得相應(yīng)PLS-DA模型，提取4個(gè)主成分，得到模型解釋率參數(shù)R2X和R2Y分別為0.838和0.985，模型預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.941，表明模型對(duì)變量X的可解釋能力為83.8%，對(duì)變量Y的可解釋能力為98.5%，模型的預(yù)測(cè)能力為94.1%，說(shuō)明該模型穩(wěn)定、可靠。PLS-DA得分圖見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示15批懷牛膝樣品被分為3類，與PCA相比，各組懷牛膝樣品進(jìn)一步聚集。

圖6 15批懷牛膝藥材樣品的PLS-DA圖

變量投影重要性（VIP）值是篩選差異化合物的重要指標(biāo)，VIP值越高，表明其對(duì)組間差異的影響越大。以貢獻(xiàn)值VIP〉1為標(biāo)準(zhǔn)，得到17個(gè)成分，結(jié)果見(jiàn)圖7。按VIP值大小排序依次為2號(hào)峰、24號(hào)峰、16號(hào)峰、26號(hào)峰、5號(hào)峰、27號(hào)峰、19號(hào)峰、3號(hào)峰、23號(hào)峰、20號(hào)峰、17號(hào)峰、18號(hào)峰、31號(hào)峰、29號(hào)峰，21號(hào)峰、22號(hào)峰、28號(hào)峰。由此推測(cè)這17個(gè)共有峰所代表的化學(xué)成分可能是導(dǎo)致三個(gè)不同產(chǎn)地懷牛膝之間差異的主要變量，與聚類熱圖分析的差異性成分較為一致[8]。

圖7 15批懷牛膝31個(gè)共有峰的VIP值

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

現(xiàn)階段對(duì)懷牛膝指紋圖譜的研究中，共有峰鑒定數(shù)量較少，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)[17]且多需要變波長(zhǎng)檢測(cè)[18]，本實(shí)驗(yàn)為了確定最佳色譜條件，對(duì)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液3個(gè)流動(dòng)相體系進(jìn)行了考察，最終確定以乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，該條件下系統(tǒng)基線平穩(wěn)，色譜峰分離較好；采用2998 PDA檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行了190-400 nm全波長(zhǎng)掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，該條件下色譜信息較為豐富，整體峰形較好。通過(guò)優(yōu)化色譜條件，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)也確定了最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng)，可為不同產(chǎn)地懷牛膝的質(zhì)量評(píng)價(jià)的色譜條件提供參考。

3.2 含量測(cè)定結(jié)果分析

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，河南省不同地區(qū)所產(chǎn)懷牛膝也具有一定質(zhì)量差異，由含量測(cè)定結(jié)果可知河南省各產(chǎn)地懷牛膝β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮含量較為接近。2020版《中國(guó)藥典》中對(duì)懷牛膝的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定以β-蛻皮甾酮含量判斷不得少于0.03%，本實(shí)驗(yàn)15批懷牛膝的β-蛻皮甾酮含量在0.068%-0.073%之間，明顯高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，而甾酮類成分作為懷牛膝的主要成分之一，具有較好的活性以及可測(cè)性，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC指紋圖譜建立更加全面的懷牛膝質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，同時(shí)提供了共有性成分25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮的含量測(cè)定的一種可行性方法?？蔀閼雅Ｏサ馁|(zhì)量評(píng)價(jià)中甾酮類成分含量測(cè)定的指標(biāo)提供參考依據(jù)。

3.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)果分析

為了進(jìn)一步區(qū)分并對(duì)不同產(chǎn)地懷牛膝進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，我們?cè)谧罴焉V條件下，建立了15批懷牛膝藥材的指紋圖譜，其11批相似度在0.900以上，并且標(biāo)定了31個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中3個(gè)共有峰成分，其他共有峰成分有待確定。并將15批懷牛膝藥材的指紋圖譜的共有峰峰面積進(jìn)行聚類熱圖分析、主成分分析以及偏最小二乘法—判別分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)河南省不同產(chǎn)地懷牛膝其他成分存在含量差異，聚類熱圖分析結(jié)果顯示15批樣品可聚為3類，S1-S5為一類，S6-S10為一類，S11-S15為一類，此與主成分分析結(jié)果、正交偏最小二乘-判別分析結(jié)果基本一致，通過(guò)熱圖分析可知，安陽(yáng)所產(chǎn)牛膝中峰2、3、5、10、11、16、24、26、27所代表的化合物含量較高，駐馬店市所產(chǎn)牛膝中峰17、19、20、23所代表的化合物含量較其他產(chǎn)地高，焦作市所產(chǎn)牛膝中以上成分含量均小于其他兩個(gè)產(chǎn)地，通過(guò)對(duì)比以上共有峰可初步篩選區(qū)分該牛膝所屬產(chǎn)地，依據(jù)VIP〉1得到的17個(gè)共有峰，推測(cè)該17個(gè)成分可能為造成不同產(chǎn)地懷牛膝質(zhì)量差異的潛在成分，可對(duì)不同產(chǎn)地的懷牛膝質(zhì)量控制中其他指標(biāo)的選擇提供實(shí)驗(yàn)參考。

4 結(jié)論

本研究建立了一種簡(jiǎn)單、快速、便捷且具有較好的準(zhǔn)確性的懷牛膝三種甾酮類成分（β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮）的含量測(cè)定方法，同時(shí)建立了15批懷牛膝的指紋圖譜，并首次結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)從多角度相互驗(yàn)證下對(duì)不同產(chǎn)地15批懷牛膝的共有成分進(jìn)行分析，篩選出了不同產(chǎn)地間懷牛膝質(zhì)量差異性成分，可為懷牛膝的質(zhì)量控制提供參考。