指紋圖譜及多成分定量結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法評(píng)價(jià)不同規(guī)格西洋參質(zhì)量*

毛英民，趙大慶，黃寶泰，李佳奇，陳昊媛，劉 莉**，齊 濱**

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 長(zhǎng)春 130117）

西洋參（Panax quinquefolium L.）是五加科人參屬多年生草本植物，此品味甘微苦，性涼，歸心、肺、腎經(jīng)，善益氣、養(yǎng)陰、清熱、為清補(bǔ)佳品[1]。西洋參別名花旗參、洋參、西洋人參。我國(guó)有著西洋參生長(zhǎng)和繁衍的優(yōu)越自然生態(tài)條件，目前是西洋參生產(chǎn)的主要地區(qū)[2]。西洋參是多年生宿根性植物，從播種到收獲，需要4年時(shí)間，目前我國(guó)常見(jiàn)的西洋參種植方式有兩種，分別為移栽和直播，國(guó)外西洋參種植均為直播4年。西洋參的產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限和種植方式都會(huì)影響其質(zhì)量。西洋參主要有效成分為人參皂苷類(lèi)成分，以往的質(zhì)量控制指標(biāo)一般測(cè)定幾種常見(jiàn)的單體皂苷含量，例如Rg1、Re、Rb1，這幾種皂苷很難反映西洋參的整體質(zhì)量。本研究運(yùn)用指紋圖譜及多成分定量結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法可以為西洋參的質(zhì)量控制提供有力的支撐。近年來(lái)，西洋參指紋圖譜的研究較少，已有的研究雖然在西洋參質(zhì)量控制上有所貢獻(xiàn)，但是還有許多方面有待提高，有的很多的化學(xué)組分沒(méi)有分開(kāi)，導(dǎo)致共有峰太少；有的指認(rèn)出的有效成分太少；有的對(duì)西洋參不同產(chǎn)地進(jìn)行指紋圖譜研究，有的對(duì)西洋參的不同炮制品種進(jìn)行指紋圖譜研究。目前西洋參不同年限、不同種植方式的HPLC指紋圖譜尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，對(duì)原產(chǎn)地美國(guó)和加拿大4年生西洋參和我國(guó)4個(gè)產(chǎn)地的不同年限的西洋參以及不同種植方式下的西洋參建立指紋圖譜，其分離度及重現(xiàn)性都較好，對(duì)相似度進(jìn)行了比較，并指認(rèn)出共有峰中的11種人參皂苷成分，求得其含量，為西洋參的選用提供了參考[3]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo-Ultimate 3000型高效液相色譜儀，VWD檢測(cè)器，Chromeleon 7.2工作站，KQ-600E型超聲波清洗器，循環(huán)水式多用真空泵，玻璃砂芯過(guò)濾裝置，AK-400A型粉碎機(jī)，HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，梅特勒AB135-S型十萬(wàn)分之一電子天平。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rb1（批號(hào)DSTDR000601）、Rb2（批號(hào)DSTDR000765）、Rb3（批號(hào)DSTDR000802）、Rc（批號(hào)DST201029-013）、Rd（批號(hào)DSTDR001501）、Re（批號(hào)DSTDR001401）、Rf（批號(hào)DST201105-017）、Rg1（批號(hào) DSTDR000901）、Rg2（批號(hào)DSTDR001001）、Rg3（批號(hào)DST200401-011）、Rh2（批號(hào)DSTDS003601）、Ro（批號(hào)DST191226-031）對(duì)照品均購(gòu)自樂(lè)美天醫(yī)藥德思特生物有限公司，正丁醇（分析純），乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），磷酸（分析純），屈臣氏飲用水。

1.3 樣品

表1 20批不同規(guī)格的西洋參

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈和B為0.05%磷酸水溶液，方法按表2進(jìn)行梯度洗脫[5]；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；柱溫26.5℃；進(jìn)樣量10 μL；流速1 mL·min-1。理論板數(shù)按人參皂苷Rb1峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 對(duì)照品溶液的制備

用十萬(wàn)分之一的電子天平，精密稱(chēng)取12種人參皂苷對(duì)照品Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、Ro，加色譜級(jí)甲醇定容，混勻后用0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液制成上述12種單體皂苷的混合對(duì)照 品 溶 液，濃 度 分 別 為0.740、0.300、0.290、0.305、0.760、0.545、0.285、0.335、0.305、0.385、0.400、0.515 mg·mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

用粉碎機(jī)把西洋參整根粉碎，過(guò)三號(hào)篩（50目）得本品粉末，精密稱(chēng)取其1 g，置于錐形瓶中，加入提前配置好的水飽和正丁醇50 mL，稱(chēng)定其重量，置于超聲波清洗器（功率600 W）中連接好回流裝置，采用超聲70℃加熱進(jìn)行提取，1.5 h后停止，取出，放涼，再次稱(chēng)重，補(bǔ)齊超聲加熱回流中減少的水飽和正丁醇，搖晃均勻，用濾紙過(guò)濾[6]。用量筒量取續(xù)濾液25 mL，移至蒸發(fā)皿中，在通風(fēng)廚中70℃水浴鍋上蒸干，加入適量的色譜甲醇使殘?jiān)芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖晃均勻，用0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液置于液相小瓶中。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系

用十萬(wàn)分之一的電子天平，精密稱(chēng)取12種人參皂苷對(duì)照品稱(chēng)取對(duì)照品Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、Ro，加色譜級(jí)甲醇使其溶解，配制成濃度分別為4.710、1.006、1.450、1.025、1.350、2.725、1.025、1.075、0.425、0.386、0.365、1.175 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，再用甲醇將其稀釋2、5、10、20、25倍，制成5種不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，將得到的結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得到每種成分的回歸方程和線(xiàn)性范圍[7]，結(jié)果見(jiàn)表3，表明在定量范圍內(nèi)各成分的線(xiàn)性良好。

表3 線(xiàn)性關(guān)系表

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取配制好的供試品溶液1份，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，將峰型較好、保留時(shí)間和峰面積大小適中的共有色譜峰Ro為參照峰,計(jì)算28個(gè)共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD〈1%，相對(duì)峰面積的RSD〈3%，表明儀器精密度良好。

換熱站供熱節(jié)能改造工程采用合同能源管理模式，簽訂合同時(shí)，應(yīng)明確約定項(xiàng)目的邊界條件和收益計(jì)算的基準(zhǔn)參數(shù)，并規(guī)定節(jié)能效益的分成比例。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取配制好的供試品溶液1份，在制備0、6、12、24、36、48 h后，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，將峰型較好、保留時(shí)間和峰面積大小適中的共有色譜峰Ro為參照峰，計(jì)算28個(gè)共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD〈1%，相對(duì)峰面積的RSD〈3%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好[8]。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取配制好的供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,將峰型較好、保留時(shí)間和峰面積大小適中的共有色譜峰Ro為參照峰，計(jì)算28個(gè)共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD〈1%，相對(duì)峰面積的RSD〈3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取7份樣品S1，分別加入提取溶劑后，其中有6份分別加入2.4.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.4 mL，分別記為H1、H2、H3、H4、H5、H6；最后1份加入空白溶液0.4 mL，記為S1。按2.3項(xiàng)下對(duì)樣品進(jìn)行處理，制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算11種單體皂苷的平均回收率和RSD結(jié)果見(jiàn)表4，表明該分析方法準(zhǔn)確度良好。

表4 加樣回收率結(jié)果

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

按2.3項(xiàng)下方法，將得到的20批西洋參樣品進(jìn)行制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定。將得到的20批西洋參數(shù)據(jù)文件以cdf文件的格式，導(dǎo)入到中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）中，將1號(hào)樣品的圖譜作為參照譜，選擇中位數(shù)法，時(shí)間寬度為0.1，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰mark峰匹配[9-10]，確定了28個(gè)共有峰，得到西洋參疊加指紋圖譜，見(jiàn)圖1。

圖1 20批西洋參藥材的HPLC指紋圖譜其對(duì)照指紋圖譜（R）

生成對(duì)照指紋圖譜R，20批西洋參指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果S1-S20與對(duì)照指紋圖譜的 相 似 度 分 別 為0.924、0.922、0.921、0.920、0.931、0.935、0.938、0.940、0.949、0.952、0.936、0.941、0.904、0.910、0.909、0.910、0.925、0.920、0.921、0.923每批西洋參的相似度結(jié)果均大于0.90，表明所建立的指紋圖譜方法可對(duì)西洋參藥材進(jìn)行鑒定和質(zhì)量控制[11]。

2.6 有效成分含量測(cè)定

在建立西洋參指紋圖譜的基礎(chǔ)上，采用與對(duì)照品比對(duì)，見(jiàn)圖2，指認(rèn)了其中11個(gè)共有峰，分別為1號(hào)峰人參皂苷Rg1；2號(hào)峰人參皂苷Re；3號(hào)峰人參皂苷Rg2；4號(hào)峰人參皂苷Ro；5號(hào)峰人參皂苷Rb1；6號(hào)峰人參皂苷Rc；7號(hào)峰人參皂苷Rb2；8號(hào)峰人參皂苷Rb3；9號(hào)峰人參皂苷Rd；10號(hào)峰人參皂苷Rg3；11號(hào)峰人參皂苷Rh2，未檢測(cè)到12號(hào)峰人參皂苷Rf，計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表5。其中個(gè)批次樣品中Rg1、Re、Rb1含量的和高于2%，符合2020版《中國(guó)藥典》的規(guī)定。

表5 20批西洋參中11種人參皂苷成分的含量（n=3，mg·g-1）

圖2 西洋參樣品S1（A）和混合對(duì)照品（B）的HPLC色譜圖

2.7 基于化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)不同批次的西洋參比較與區(qū)分

為了說(shuō)明不同產(chǎn)地間不同批次的西洋參的品質(zhì)差異，本研究以測(cè)得的西洋參中的11種成分的含量為變量，運(yùn)用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)20批西洋參樣品進(jìn)行分析。

2.7.1 聚類(lèi)分析

聚類(lèi)分析是一種被用作描述數(shù)據(jù)的技術(shù)方法，可以衡量不同樣品間數(shù)據(jù)的相似性，是將一些有相似數(shù)據(jù)基礎(chǔ)的樣品分類(lèi)到不同簇的一個(gè)過(guò)程，所以同一個(gè)簇中的樣品有更高的相似性，而不同簇間的樣品有著一定相異性。

運(yùn)用SPSS 21軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)20批西洋參樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，將測(cè)得的11種人參皂苷類(lèi)成分的含量作為變量，聚類(lèi)方法使用Ward法（離差平方和法），以平方Eucliodean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)[12]，得到系統(tǒng)聚類(lèi)分析的樹(shù)狀圖，結(jié)果見(jiàn)圖3，當(dāng)判別距離為5時(shí)，20批西洋參樣品可以分為3類(lèi)，S1、S2、S3、S4、S17、S18、S19、S20八批樣品為一類(lèi)，S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12八批樣品為一類(lèi)，S13、S14、S15、S16四批樣品為一類(lèi)。由結(jié)果可知，聚類(lèi)分析法可以將20批西洋參樣品進(jìn)行分類(lèi)，山東文登產(chǎn)區(qū)的西洋參（S13-S16）單獨(dú)成一類(lèi)；東北產(chǎn)區(qū)的西洋參樣品中，長(zhǎng)白的西洋參（S5-S8）和撫松的西洋參（S9-S12）區(qū)分效果不是很明顯，歸為一類(lèi)；集安的西洋參（S1-S4）和美國(guó)、加拿大的西洋參（S17-S20）二者有明顯的區(qū)分效果但是被歸為一類(lèi)。長(zhǎng)白地區(qū)和撫松地區(qū)距離很近，兩個(gè)產(chǎn)區(qū)都屬于吉林省長(zhǎng)白山產(chǎn)區(qū)，兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的地理生長(zhǎng)環(huán)境相似，所以?xún)蓚€(gè)產(chǎn)區(qū)的西洋參差異不大；集安地區(qū)的和美國(guó)、加拿大可能在緯度和其他自然條件上相似，生產(chǎn)的西洋參都品質(zhì)較高?？梢钥闯鼍垲?lèi)分析法可以全面反應(yīng)20批西洋參之間的差異。

圖3 20批西洋參藥材系統(tǒng)聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

2.7.2 主成分分析

主成分分析是一種通過(guò)多個(gè)變量的線(xiàn)性變換，利用降維的思想，選出少數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法。在用統(tǒng)計(jì)分析方法研究含有多個(gè)變量的實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)會(huì)隨變量的個(gè)數(shù)增多使復(fù)雜程度增高。其實(shí)變量之間是有一定的相關(guān)關(guān)系的，變量之間會(huì)有相同的一部分因素，和不同的一部分因素，當(dāng)兩個(gè)變量之間相關(guān)關(guān)系緊密時(shí)，可以認(rèn)為這兩個(gè)變量在反映實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，有一部分信息是重疊的。主成分分析就是盡可能減少實(shí)驗(yàn)中提出的變量，當(dāng)變量有很多時(shí)，可以將關(guān)系之間緊密的幾個(gè)變量變成另外一個(gè)新變量，且建立出的幾個(gè)新變量之間是沒(méi)有聯(lián)系的，我們可以通過(guò)較少的幾個(gè)新變量，就可以保留原有的信息且完全反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容，減輕了分析實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜程度[13]。

將測(cè)得的11種人參皂苷類(lèi)成分的含量作為變量導(dǎo)入SPSS 21軟件中，選用因子分析，采用主成分的方法，選擇相關(guān)性矩陣，計(jì)算得到主成分特征值、累計(jì)貢獻(xiàn)率及主成分綜合得分。主成分特征值與方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表6，主成分因子載荷矩陣見(jiàn)表7。將特征值〉1、累計(jì)貢獻(xiàn)率〉80%作為提取標(biāo)準(zhǔn)，可提取到2個(gè)主成分，第一主成分貢獻(xiàn)率最高為70.676%，第二主成份貢獻(xiàn)率為11.550%，2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為82.226%，由此可知前2個(gè)主成分能反映西洋參中11種人參皂苷的含量信息。

表6 主成分特征值與方差貢獻(xiàn)率

表7 主成分因子載荷矩陣

根據(jù)得到的主成分，建立含有2個(gè)主成分的PCA模型，其中R2X（cum）表示在進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，其在X軸方向上保留原始數(shù)據(jù)信息的百分比平方，其大小為0.995；Q2（cum）為整體模型預(yù)測(cè)能力參數(shù)，大小為0.88。整體來(lái)說(shuō)建立的模型區(qū)分度和預(yù)測(cè)程度都較好[14]。建立含2個(gè)主成分的坐標(biāo)系，得到PCA得分圖，見(jiàn)圖4。從PCA得分圖中我們可以得到20批西洋參的分類(lèi)信息，可以看出東北集安產(chǎn)區(qū)的西洋參（S1-S4）和山東文登產(chǎn)區(qū)的西洋參（S13-S16）以及國(guó)外西洋參（S17-S20）在PCA得分圖上，比較明顯的被分到獨(dú)立區(qū)域，而東北長(zhǎng)白產(chǎn)區(qū)的西洋參（S5-S8）和東北撫松產(chǎn)區(qū)的西洋參（S9-S12）在PCA得分圖上分布較集中，兩個(gè)地區(qū)的區(qū)分不是很清晰。20批不同批次的西洋參總體上被分為4類(lèi)，表明各個(gè)批次的西洋參在化學(xué)成分含量上有差異性，其主要是受到產(chǎn)地的影響，雖然西洋參的種植方式和種植年限對(duì)其也有影響，但其并不是導(dǎo)致每批西洋參有差異的關(guān)鍵因素。

圖4 20批西洋參PCA得分圖

對(duì)導(dǎo)致西洋參差異的標(biāo)志成分進(jìn)行分析，并得到差異性標(biāo)記物的VIP值，結(jié)果見(jiàn)圖5，篩選出導(dǎo)致西洋參差異性較大的成分，以VIP〉1.0的變量作為標(biāo)準(zhǔn)[15]，篩選出造成品質(zhì)差異的4個(gè)主要成分，Rb1、Re、Rd、Ro，其中Rb1、Re的VIP值都大于1.5，其是導(dǎo)致不同批次西洋參差異的主要成分，其在美國(guó)、加拿大、集安地區(qū)生產(chǎn)的西洋參中含量較高。

圖5 11種人參皂苷成分的VIP預(yù)測(cè)值分布圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在前期比較了超聲提取法、加熱回流提取法和超聲加熱回流提取法對(duì)峰面積的影響，結(jié)果顯示當(dāng)采用超聲加熱回流提取時(shí)，色譜峰的峰面積在整體程度上高于超聲提取法和加熱回流提取法，其中加熱回流提取法時(shí)的色譜峰面積又高于超聲提取法的。同時(shí)對(duì)進(jìn)樣色譜條件進(jìn)行了考察，包括色譜柱的選用、流動(dòng)相的選用、流動(dòng)相磷酸水的pH、柱溫，綜合各種因素，最終梯度洗脫條件確定為：安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱，柱溫26.5℃，乙腈-0.05%磷酸水溶液，流速1 mL·min-1。

20批西洋參藥材的HPLC化學(xué)指紋圖譜結(jié)果顯示20批西洋參樣品的相似度均大于0.90。集安、長(zhǎng)白、撫松和美國(guó)、加拿大的西洋參相似度較高均大于0.92，說(shuō)明東北3個(gè)產(chǎn)區(qū)和美國(guó)、加拿大產(chǎn)區(qū)的西洋參藥材在化學(xué)組分和含量上類(lèi)似，其中又以長(zhǎng)白和撫松地區(qū)的相似度最高最接近，可能是兩個(gè)產(chǎn)區(qū)距離較近，地理生長(zhǎng)環(huán)境相似的原因；集安和美國(guó)、加拿大地區(qū)的相似度最接近，可能是緯度相接近，生長(zhǎng)環(huán)境相似的原因。山東文登產(chǎn)區(qū)的相似度相對(duì)于整體較低，相似度在0.90-0.92之間。說(shuō)明20批西洋參樣品的化學(xué)組分和含量上存在差異，這種差異主要是由產(chǎn)地造成的，不同的生長(zhǎng)環(huán)境導(dǎo)致西洋參中的化學(xué)組分存在著差異，采用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法無(wú)法區(qū)分不同年限和不同種植方式的西洋參樣品。

含量測(cè)定得到了11種人參皂苷的含量，聚類(lèi)分析和主成分分析反應(yīng)20批西洋參之間的差異。從皂苷含量和的結(jié)果整體來(lái)看：進(jìn)口〉集安〉長(zhǎng)白≈撫松〉文登，國(guó)內(nèi)種植方式：4年〉直播4年〉3年〉2年。西洋參的質(zhì)量不僅與產(chǎn)地有關(guān)系，而且還與種植方式有關(guān)，在國(guó)內(nèi)移栽種植4年的西洋參人參皂苷含量要高于直播種植4年的西洋參。此外西洋參的質(zhì)量還與種植的年限有關(guān)系，在同一產(chǎn)地西洋參生長(zhǎng)的年份越高，人參皂苷類(lèi)成分含量的和越高，藥材的質(zhì)量越高；造成西洋參質(zhì)量差異的主要成分是人參皂苷Rb1、Re、Rd、Ro。

本研究提取溶劑選用水飽和正丁醇，僅對(duì)部分化學(xué)成分進(jìn)行提取，所以進(jìn)行的HPLC分析結(jié)果，僅顯現(xiàn)出西洋參藥材部分化學(xué)信息。