GC-MS和GC-FID定性定量分析毒品中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯成分

楊發(fā)震 魯志強 沈 松 陳 康 李紹鵬 柴育芳 蘇少明

（1 毒品分析及禁毒技術公安部重點實驗室 云南 昆明 650228；2 玉溪市公安局刑事科學技術研究所 云南 玉溪 653100；3 昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院 云南 昆明 650500）

1 引言

曲馬多是一種阿片受體激動劑和常用的中樞性鎮(zhèn)痛藥，易產(chǎn)生不良反應，存在濫用的可能性[1]，與傳統(tǒng)毒品等相比，曲馬多價格便宜、獲取途徑方便，近年被一些不法分子作為傳統(tǒng)毒品的替代品來使用[2]；曲馬多的體內(nèi)代謝產(chǎn)物主要為O-去甲基曲馬多（ODT）、N-去甲基曲馬多（NDT）、N,O-去甲基曲馬多（NODT）[3]。

芬太尼作為一種阿片受體激動劑，具有強效麻醉作用，藥效約為嗎啡的50～100倍，海洛因的30～50倍，主要用于外科麻醉和癌癥患者疼痛的治療。芬太尼在血漿中的治療水平可低至1ng/mL，其主要代謝物為諾芬太尼[4-5]，僅在2013～2014年間，美國就有700多人死于芬太尼和芬太尼類似物，芬太尼被添加到海洛因中的歷史可追溯到1979年，目前白色海洛因、黒焦油海洛因中均有檢測到芬太尼及芬太尼類似物的報告[6-8]。

地芬諾酯為嗎啡的人工合成代用品、哌替啶的衍生物，長期服用可形成依賴，常被吸毒人員作為海洛因替代品吸食濫用，其中毒量與治療量較為接近，且它的代謝產(chǎn)物地芬諾辛毒性更強，過量服用極易引起中毒甚至死亡。隨著我國對阿片類傳統(tǒng)毒品打擊力度的增強和戒毒工作的持續(xù)深入，目前地芬諾酯的濫用情況呈現(xiàn)出愈發(fā)嚴重的態(tài)勢[9-11]。據(jù)相關報道，在伊朗銷售的許多阿片類藥物戒斷藥的中草藥中，從大量樣品中檢出了曲馬多、美沙酮和地芬諾酯成分[12]。近幾年，世界多國的不法分子將曲馬多、芬太尼和地芬諾酯等非法添加到中草藥中，制成不同顏色的復方膠囊進行非法販賣，或單獨非法販賣制成不同顏色膠囊的地芬諾酯單方制劑，用來作為阿片類毒品戒斷藥物或者新型毒品銷售販賣，并且已有因吸食該類藥品過量死亡案件的發(fā)生。

對于在全血、血漿、尿液、毛發(fā)等生物樣品中，對曲馬多、芬太尼、地芬諾酯一種或多種成分的檢測，目前主要采用氣相色譜-質譜法（GC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質譜法（LC-MS）、液相色譜-高分辨質譜法 （LC-HRMS）、氣相色譜-高分辨質譜法（GCHRMS）及毛細管電泳法（CE）等[3,5,13-20]；對于片劑、針劑溶液等體外樣品，主要采用高效液相色譜法（HPLC法）、毛細管電泳法（CE）等對曲馬多、芬太尼、地芬諾酯一種或兩種成分進行測定[12,21-25]，尚未見到有同時針對體外檢材中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯3種成分同時進行定性定量測定的報道，尤其是針對毒品樣品?；诖耍緦嶒瀸⒔⒉捎脷庀嗌V-質譜法（GC-MS）定性、氣相色譜法（GC-FID）定量的檢驗方法，同時對毒品樣品中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯3種成分定性定量分析。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑和材料

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用系統(tǒng)（美國Agilent 公司），Agilent 7890A-FID氣相色譜系統(tǒng)（美國Agilent 公司），Purelab Flex純水系統(tǒng)（英國ELGA公司），MS 105分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），KQ-50DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

鹽酸曲馬多（標準品，購于中國藥品生物制品檢定所），枸櫞酸芬太尼（標準品，購于中國食品藥品檢定研究院），鹽酸地芬諾酯（化學對照品，購于中國藥品生物制品檢定所），普羅地芬鹽酸鹽（標準品，購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司），甲醇（HPLC級，購于美國Fisher Scientific公司）。

用甲醇準確配置濃度為1.0mg/mL的曲馬多、芬太尼、地芬諾酯單標標準儲備液，于-20℃恒溫避光保存，用于回收率添加測試；用甲醇準確配置濃度為1.0mg/mL的普羅地芬標準儲備液，于-20℃恒溫避光保存，用于內(nèi)標溶液；取適量1.0mg/mL普羅地芬標準儲備液用甲醇稀釋為0.1mg/mL的內(nèi)標工作液，備用。實驗時，用0.1mg/mL的內(nèi)標工作液準確配置濃度為1.0mg/mL的曲馬多、芬太尼、地芬諾酯混標標準儲備液，于-20℃恒溫避光保存，并用0.1mg/mL內(nèi)標工作液稀釋成系列濃度的混標工作液，以供線性、檢出限、定量限等相關測試使用。

2.2 毒品樣品

毒品樣品為某市公安局于2019年3月至2019年12月期間從涉毒人員、街頭毒販和販毒集團中繳獲，并委托毒品分析及禁毒技術公安部重點實驗室進行檢驗鑒定，樣品抽取后于室溫保存。將案件中抽取的58份不同顏色膠囊包裝的毒品樣品，按照膠囊帽-膠囊體顏色分為6種：藍色-白色膠囊、棕色-棕色膠囊、紅色-白色膠囊、黑色-白色膠囊、藍色-藍色膠囊。

6種不同顏色膠囊的毒品中包含24份黃色粉末狀中草藥毒品樣品（編為Y1-Y24號）和34份白色粉末狀毒品樣品（編為W1-W34號）。在24份黃色粉末狀中草藥毒品樣品膠囊中，有16份毒品樣品為藍色-白色膠囊包裝、8份毒品樣品為棕色-棕色膠囊包裝；在34份白色粉末狀毒品樣品膠囊中，有9份毒品樣品為棕色-棕色膠囊包裝、8份毒品樣品為藍色-藍色膠囊包裝、11份毒品樣品為紅色-白色膠囊包裝、6份毒品樣品為黑色-白色膠囊包裝包裝。

2.3 樣品前處理

分別準確稱取黃色粉末狀毒品樣品100mg、白色粉末狀毒品樣品10mg，加適量內(nèi)標工作液（100μg/mL）溶解，超聲提取20min，用內(nèi)標工作液定容至10mL，搖勻，過0.22μm微孔濾膜后，供GC-MS定性及GC-FID定量分析。

2.4 儀器條件

2.4.1 GC-MS定性分析條件

色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5MS毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為高純氦氣；流量（恒流）：1.2mL/min；進樣口溫度：270℃；傳輸線溫度：280℃；質譜掃描范圍：40～500amu；溶劑延遲時間：3.5min；進樣量：1μL；分流比：20∶1；程序升溫條件：初溫100℃，保持2min，以30℃/min升至280℃，保持20min。

質譜條件：離子源溫度（EI源）：230℃；四極桿溫度：150℃；電子轟擊能量：70eV；電子倍增器電壓：1695V；質譜掃描范圍：40～500amu；掃描速度：1562u/s；溶劑延遲時間：3.5min；運行時間：28min。

2.4.2 GC-FID定量分析條件

色譜柱：色譜柱為Agilent DB-1毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為高純氮氣；流速（恒流）：1.5mL/min；進樣口溫度：270℃；進樣量：1μL；分流比：20∶1；檢測器溫度：290℃；氫氣流量：45mL/min；空氣流量：300mL/min；程序升溫條件：初溫150℃，保持1min，以20℃/min升至220℃，保持5min，以40℃/min升至280℃，保持17min。

3 結果與討論

3.1 GC-MS色譜條件優(yōu)化及檢出限、定量限測試

由于地芬諾酯出峰時間晚，實驗在總運行時間為30min條件下，對不同色譜柱進行初溫及升溫程序，包括分別以60℃、80℃、100℃、120℃為初溫條件（保持1～2min），以常見升溫速率（20℃/min、30℃/min）升至280℃后，保持不同時間至運行30min等條件進行優(yōu)化。結果在上述條件中，只有以初溫為100℃、120℃，30℃/min的升溫速率升溫至280℃時，地芬諾酯能夠順利出峰而不會在色譜柱內(nèi)保留至下一針出峰，且地芬諾酯在色譜柱的保留時間相差不大。因為在日常分析中，考慮很多常見毒品成分（如甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA、卡西酮、甲卡西酮、乙卡西酮、2-MMC、2-FMC、3-FMC、4-FMC、2-FA、3-FA、4-FA等）及常見毒品中摻雜劑（如二甲亞砜、煙酰胺、吡拉西坦、巴比妥、麻黃堿、氯麻黃堿）等物質成分出峰時間較早，因而考慮選擇在以100℃為初溫條件保持2min，之后以30℃/min 升溫速率升至280℃的升溫程序，以防止其他毒藥物成分及常見毒品摻雜劑、添加劑物質的漏篩。圖1為100μg/mL混標標準溶液、典型黃色粉末狀毒品樣品及白色粉末狀毒品樣品的總離子流色譜圖。

圖1 100μg/mL混標標準溶液、典型黃色粉末狀及白色粉末狀毒品總離子流色譜圖

色譜條件優(yōu)化完后，實驗對氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）法進行定性分析的檢出限（LODs）與定量限（LOQs）進行了測試，用100μg/mL的普羅地芬內(nèi)標工作液準確配置濃度為1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL的曲馬多、芬太尼、地芬諾酯混標標準溶液，進行氣相色譜-質譜聯(lián)用（GCMS）的檢出限（LODs）與定量限（LOQs）測試，配置的每個濃度進行平行6次實驗，結果見表1。結果顯示，在GC-MS檢出限與定量限測試中，曲馬多的檢出限（S/N=3，n=6）為1μg/mL、定量限（S/N=3，n=6）為2μg/mL，芬太尼、地芬諾酯的檢出限（S/N=3，n=6）均為2μg/mL、定量限均為（S/N=3，n=6）為5μg/mL。

3.2 GC-FID定量分析

3.2.1 檢出限、定量限與線性關系測試

用100μg/mL的普羅地芬內(nèi)標工作液準確配置濃度為1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL的曲馬多、芬太尼、地芬諾酯混標標準溶液，進行GC-FID檢出限（LODs）、定量限（LOQs）、線性關系（Linear equations）測試，配置的每個濃度進行平行6次實驗。其中，線性濃度范圍從10μg/mL～500μg/mL進行測試，線性關系以Area/AreaIS為縱坐標（Area1為目標物峰面積值；AreaIS為內(nèi)標峰面積值），以濃度為橫坐標進行線性擬合。結果如表1所示，GC-FID檢出限及定量限測試中，曲馬多、芬太尼及地芬諾酯的檢出限均為2μg/mL、定量限均為5μg/mL；在10μg/mL～500μg/mL濃度線性范圍內(nèi)，曲馬多、芬太尼及地芬諾酯3種化合物均具有良好的線性關系，曲馬多線性方程為y=12.523x+0.0149，芬太尼線性方程為y=12.537x+0.0196，地芬諾酯線性方程為y=10.9x+0.003，3種成分相關系數(shù)R2均大于0.999。圖2為普羅地芬內(nèi)標及混標標準溶液（100μg/mL）、典型黃色粉末狀毒品樣品及白色粉末狀毒品樣品的氣相色譜圖。

圖2 100μg/mL混標標準溶液、典型黃色粉末狀及白色粉末狀毒品氣相色譜圖

表1 GC-FID與GC-MS分析中3種目標物的線性、檢測限與定量限(n=6)

3.2.2 回收率測試

由于無法獲取相同基質的空白樣品，本實驗回收率采用標準加入法進行測試。分別準確平行稱取編號為Y1的典型黃色粉末狀毒品樣品及編號為W18號的典型白色粉末狀毒品樣品各6份，按照前述“2.3”進行樣品前處理后，供GC-FID測定出目標物及內(nèi)標峰面積，計算其目標物峰面積與內(nèi)標峰面積比值，再用“表1”中各目標物線性方程計算出平均含量；再次稱取上述樣品各18份，根據(jù)計算結果，使用含量為1.0mg/mL的曲馬多、芬太尼、地芬諾酯單標標準溶液進行標準加入，使編號為Y1的典型黃色粉末狀毒品樣品中曲馬多、芬太尼及地芬諾酯的加入量分別為原始含量的80%、100%和120%，每個濃度平行6次添加；同樣使用含量為1.0mg/mL的地芬諾酯標準溶液對編號為W18號的典型白色粉末狀毒品樣品進行標準加入，使其加入的地芬諾酯的含量為原始含量的80%、100%和120%，每個濃度平行6次添加。添加完成后，按照前述“2.3”進行樣品前處理后供GCFID測定并計算其平均含量?；厥章视嬎愕墓綖椋夯厥章?（測得量-原始量）/加入量×100%，每個濃度添加平行6次實驗，結果如表2所示。

表2 典型黃色、白色粉末狀毒品中3種目標物的回收率（n=6）

結果顯示，編號為Y1的典型黃色粉末狀毒品樣品中曲馬多的回收率（80%，100%，120%）在99.2%～99.6%之間，相對標準偏差在0.39%～0.94%之間，平均回收率為99.5%；芬太尼的回收率（80%，100%，120%）在99.1%～101.3%之間，相對標準偏差在0.41%～1.34%之間，平均回收率為100.3%；地芬諾酯的回收率（80%，100%，120%）在96.2%～101.9%之間，相對標準偏差在0.56%～1.44%之間，平均回收率為98.7%；編號為W18號的典型白色粉末狀毒品樣品中地芬諾酯的回收率（80%，100%，120%）在99.7%～104.3%之間，相對標準偏差在0.53%～0.94%之間，平均回收率為101.8%。測試結果顯示，典型黃色粉末狀毒品樣品（編號為Y1）和典型白色粉末狀毒品樣品中（編號為W18）中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的平均回收率（R%，n=6）在98.7%～101.8%間，各化合物的相對標準偏差均小于1.50%，說明建立的方法回收率高，定量結果準確、可靠。

3.2.3 準確度與精密度測試

用100μg/mL的普羅地芬內(nèi)標工作液準確配置濃度為20μg/mL、100μg/mL和500μg/mL的曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的混標標準溶液，分別連續(xù)3日用GC-FID進行測定，每個濃度每日平行測定6次，記錄并計算目標物峰面積及內(nèi)標峰面積比值，用“表1”中所建立線性方程計算出含量，普羅地芬內(nèi)標物直接用外標單點法進行計算含量，用以評估方法的準確度與精密度。準確度用相對誤差來表示，精密度用相對標準偏差（RSD）來表示，測試結果如表3所示。

表3 不同濃度混標溶液中(20、100、500μg/mL) 3種目標物和內(nèi)標普羅地芬（100μg/mL）的準確度與精密度

結果顯示，曲馬多連續(xù)3日測定的相對誤差（n=6）在-0.5%～2.0%之間，連續(xù)3日日內(nèi)精密度（n=6）在0.48%～1.28%之間，日間精密度（n=18）在0.77%～1.40%之間；芬太尼連續(xù)3日測定的相對誤差（n=6）在-0.3%～4.5%之間，連續(xù)3日日內(nèi)精密度（n=6）在0.35%～1.02%之間，日間精密度（n=18）在0.59%～1.99%之間；地芬諾酯連續(xù)3日測定的相對誤差（n=6）在0.1%～6.5%之間，連續(xù)3日日內(nèi)精密度（n=6）在0.37%～2.71%之間，日間精密度（n=18）在1.25%～3.28%之間；普羅地芬內(nèi)標物連續(xù)3日測定的相對誤差（n=6）在-1.7%～0.4%之間，連續(xù)3日日內(nèi)精密度（n=6）在0.80%～1.30%之間，日間精密度（n=18）為1.34%。整體而言，在準確度與精密度測試中，曲馬多、芬太尼、地芬諾酯連續(xù)3日測量的相對誤差（n=6）在-0.5%～6.5%間，日內(nèi)精密度（RSD%，n=6）在0.35%～2.71%間，日間精密度（RSD%，n=18）在0.59%～3.28%間，該方法準確度與精密度良好，完全滿足定量分析要求。

3.2.4 重復性測試

使用制備好的編號為Y1號的典型黃色粉末狀毒品樣品溶液和編號為W18號的典型白色粉末狀毒品樣品溶液，用GC-FID測定并記錄目標物峰面積及普羅地芬內(nèi)標峰面積，計算其目標物峰面積與內(nèi)標峰面積比值，使用“表1”中所建立線性方程計算出含量并計算相對標準偏差，用來評估該方法的重復性，結果如表4所示。

表4 典型黃色、白色粉末狀毒品中3種目標物的重復性測試

結果顯示，重復性測試中，編號為Y1號的典型黃色粉末狀毒品樣品溶液中連續(xù)6次測定的曲馬多成分平均含量為0.0238mg/mg，相對標準偏差為2.18%；連續(xù)6次測定的芬太尼成分平均含量為0.0222mg/mg，相對標準偏差為1.74%；連續(xù)6次測定的地芬諾酯成分平均含量為0.0048mg/mg，相對標準偏差為3.14%；編號為W18號的典型白色粉末狀毒品樣品溶液中連續(xù)6次測定的地芬諾酯成分平均含量為0.1959mg/mg，相對標準偏差為2.72%。總體來說，在重復性測試中，典型黃色粉末狀毒品樣品和白色粉末狀毒品樣品溶液中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的RSD%值在0.31%～1.51%間，所建立的方法測量重復性良好。

3.2.5 穩(wěn)定性測試

使用制備好的編號為Y1號的典型黃色粉末狀毒品樣品溶液和編號為W18號的典型白色粉末狀毒品樣品溶液，分別于0、2、4、6、8、12和24小時測定并記錄典型黃色粉末狀毒品樣品溶液中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯和普羅地芬內(nèi)標物的峰面積，以及典型白色粉末狀毒品樣品溶液中地芬諾酯和普羅地芬內(nèi)標物的峰面積，計算出平均峰面積和相對標準偏差，用以評估制備樣品在24小時內(nèi)的穩(wěn)定性，結果如表5所示。

表5 典型黃色、白色粉末狀毒品中3種目標物的24h峰面積穩(wěn)定性

結果顯示，編號為Y1號的典型黃色粉末狀毒品樣品溶液中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯和普羅地芬的平均峰面積分別為240.5、228.5、40.3、80.4，相對標準偏差在1.03%～3.78%之間；編號為W18號的典型白色粉末狀毒品樣品溶液中地芬諾酯和普羅地芬的平均峰面積分別為166.8、79.7，相對標準偏差在0.74%～2.52%之間?？傮w來說，兩種毒品樣品溶液中測定的RSD%值在0.74%～3.78%之間，所制備的樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3 實際樣品分析

應用所建立的GC-MS定性和GC-FID定量方法對某市公安局繳獲并抽取的58份毒品進行檢驗，結果如表6所示。

表6 實際案件樣品中3種目標物的分析結果（黃色粉末狀毒品：Y1-Y24，白色粉末狀毒品：W1-W34）

結果顯示，在GC-MS定性分析中，24份不同顏色膠囊包裝的黃色粉末狀毒品樣品中均檢出曲馬多、芬太尼及地芬諾酯成分；在34份不同顏色膠囊包裝的白色粉末狀毒品中均檢出地芬諾酯成分，均未檢出曲馬多和芬太尼成分。在GC-FID定量分析中，不同顏色膠囊包裝的黃色粉末狀毒品樣品中，藍色-白色膠囊中曲馬多的含量均比棕色-棕色膠囊中含量低，芬太尼的含量則相對高于棕色-棕色膠囊中的含量，地芬諾酯的含量則在0.004mg/mg～0.006mg/mg之間；在34份不同顏色膠囊包裝的白色粉末狀毒品樣品中，每種顏色膠囊中的地芬諾酯含量均不一樣，相同顏色含量相仿，其中棕色-棕色膠囊中地芬諾酯含量最高（均高于0.42mg/mg），紅色-白色膠囊中地芬諾酯含量最低（均低于0.19mg/mg），黑色-白色和藍-藍色膠囊中地芬諾含量在0.23mg/mg～0.28mg/mg間。

4 結論

本實驗采用GC-MS定性結合GC-FID定量法，建立了繳獲毒品樣品中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的定性定量分析方法，該方法具有前處理簡單、準確、精密度、穩(wěn)定性良好、回收率高等特點，并且已將該方法成功應用于實際案件繳獲的毒品樣品中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的定性定量檢驗，可為法庭科學實踐提供一定的有益借鑒。