非洲辣木組培快繁再生技術體系的建立

鐘連香，林 東，魏秋蘭，肖玉菲，劉海龍，覃子海

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院，廣西南寧 530002）

非洲辣木（Moringa stenopetala）為辣木科（Mor?ingaceae）辣木屬植物，有豐富的營養(yǎng)和藥用價值[1]，在熱帶、亞熱帶國家和地區(qū)分布廣泛，在我國云南、廣東及廣西等地有大量種植[2]；辣木籽富含氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素及人體必需的礦物質(zhì)元素，有較高的營養(yǎng)價值[3]；含有黃酮、多糖和多酚等生物活性物質(zhì)，在抗氧化、消炎、抗癌和降血壓等方面作用顯著[4-5]，是藥食同源的植物，其營養(yǎng)和藥用價值已被廣泛證實并開發(fā)利用[6-7]。辣木（M. oleifera）具有速生、耐旱和抗病性強等特點，經(jīng)濟效益好，是世界上熱門的多用途樹種之一[8]，同屬的非洲辣木也具有這些特點。關于辣木化學成分的藥理作用和營養(yǎng)成分方面的研究均取得了較好的進展[9-10]?；诶蹦镜臐撛趦r值，并且辣木種子價格較高，傳統(tǒng)的種子育苗已不能滿足市場需求，辣木育苗技術[11]和栽培技術[12]日益成為研究熱點。關于辣木組織培養(yǎng)技術方面的研究也逐漸增多。陳麗文等[13]研究發(fā)現(xiàn)，辣木在MS + 6-BA 0.6 mg/L + IAA 0.2 mg/L 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)增殖系數(shù)可達4.2，但在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)葉子黃化脫落的現(xiàn)象；高敏霞等[14]的研究結果顯示，辣木的生根率可達80%，其生根培養(yǎng)基仍需繼續(xù)優(yōu)化；張?zhí)煜璧萚15]的研究表明，辣木生根瓶苗移栽在泥炭土∶珍珠巖=1∶1 的基質(zhì)中，成活率為80.6%。目前，非洲辣木組織培養(yǎng)技術尚不成熟，有必要對其開展無性快繁技術研究，摸索成熟的組培快繁體系，為非洲辣木推廣提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。本研究以非洲辣木無菌苗為試驗材料，研究培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對其再生體系建立的影響，探索最適移栽基質(zhì)，優(yōu)化非洲辣木組培快繁再生技術，加快良種推廣應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為非洲辣木無菌苗。無菌苗由飽滿且健康的非洲辣木種子經(jīng)無菌萌發(fā)獲得，種子原產(chǎn)于印度。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗誘導

將種子剝?nèi)ネ鈿げ⒂孟匆路巯磧?，置于超凈工作臺上消毒（75%酒精1 min + 0.1%升汞10 min）。將經(jīng)消毒處理和無菌水沖洗后的種子接種于MS 培養(yǎng)基（蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，pH 值6.0）上，放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。15 天時，統(tǒng)計發(fā)芽情況，計算發(fā)芽率（%）和污染率（%）。

1.2.2 愈傷組織誘導

采用6-BA 和KT 的組合進行愈傷組織誘導，基本培 養(yǎng)基 為MS 培 養(yǎng)基。6-BA 濃 度為0.1、1.0 和2.0 mg/L，KT 濃度為1.0 和2.0 mg/L，共6 個處理（表1）。將無菌苗切成2 ～2.5 cm 小段，接種至愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。15 天后，統(tǒng)計出愈數(shù)，計算誘導率（%）。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)

對誘導產(chǎn)生的不定芽進行切斷處理，保留2 cm左右的長度，以基本培養(yǎng)基（MS、WPM 和B5）、6-BA（0.2、0.6和1.2 mg/L）和KT（0.1、0.3和0.5 mg/L）為因素，進行L9（34）正交試驗設計（表2）。接種后，先暗培養(yǎng)10 天，再轉入正常光照培養(yǎng)。25 天后，統(tǒng)計各處理芽總數(shù)，計算增殖系數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng)與移栽

以基本培養(yǎng)基（1/2 MS、1/2 WPM 和1/2 B5）、NAA（0.5、1.0 和1.5 mg/L）和IBA（0.5、1.0 和1.5 mg/L）為因素，進行L9（34）正交試驗設計（表3）。將增殖培養(yǎng)得到的小苗接種至培養(yǎng)基；接種后，用遮光布遮住進行暗培養(yǎng)，7 天后將遮光布掀開進行全光照培養(yǎng)；25 天后，統(tǒng)計苗木生根狀況，計算生根率（%）。將生根的試管苗移入大棚，在自然光下煉苗7天后，將生長健壯的生根苗分別移栽至椰糠、泥炭土、泥炭土∶椰糠= 1∶1、泥炭土∶椰糠= 1∶3 和泥炭土∶椰糠=3∶1 這5 種基質(zhì)中。移栽30 天后，統(tǒng)計生長狀況，計算移栽成活率（%）。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為24 ℃，光照強度為6 000 lx，光周期為14 h/天。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)整理；采用SPSS 21.0 軟件對誘導率、增殖系數(shù)、生根率、生根數(shù)和根長進行方差分析和鄧肯氏新復極差檢驗。

2 結果與分析

2.1 無菌苗誘導情況

培養(yǎng)7 天后，種子開始萌動；15 天時，種子發(fā)芽率為81.11%，污染率為17.41%。

2.2 不同處理對愈傷組織誘導的影響

培養(yǎng)10 天后，開始出現(xiàn)少量愈傷組織。6 個處理的誘導率均在50%以上，處理3 和處理5 的誘導率達80%以上；處理3的誘導率最高（89.89%），顯著高于其他處理（P＜0.05）（表1）。6-BA 濃度為0.1 mg/L 時，隨KT 濃度升高，誘導率增加；6-BA 濃度為1.0 或2.0 mg/L 時，隨KT 濃度升高，誘導率降低。處理3 的誘導率高且愈傷組織生長較好，非洲辣木愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基為MS + 6-BA 1.0 mg/L +KT 1.0 mg/L。

表1 不同處理對愈傷組織誘導的影響Tab.1 Effects of different treatments on callus induction

2.3 不同處理對繼代增殖的影響

以MS 為基本培養(yǎng)基的處理更有利于繼代增殖，以WPM 和B5 為基本培養(yǎng)基處理的增殖效果較差（表2）。處理1 和處理2 的增殖系數(shù)均達4.0 以上，顯著高于其他處理（P＜0.05）；影響增殖系數(shù)的因素為培養(yǎng)基＞6-BA ＞KT。處理2 的增殖系數(shù)最高（4.62），非洲辣木不定芽增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.6 mg/L+KT 0.3 mg/L。

表2 不同處理對繼代增殖的影響Tab.2 Effects of different treatments on subculture proliferation

2.4 不同處理對生根的影響

生根培養(yǎng)10 天后，小苗的基部切口處開始生根。各處理的生根率均在60%以上；處理6 的生根率最低（63.80%），顯著低于其他處理（P＜0.05）；處理1 和處理2 的生根率較高，均在94%以上；影響生根率的因素為NAA ＞培養(yǎng)基＞IBA（表3 ～4）。各處理的根長為1.38 ～2.18 cm，以1/2 WPM 為基本培養(yǎng)基處理的根長較短；影響根長的因素為培養(yǎng)基＞IBA ＞NAA。各處理的生根數(shù)均在3 根以上，處理1和處理7 的生根數(shù)較多，在6 根以上；以1/2 MS 和1/2 B5 為基本培養(yǎng)基處理的生根數(shù)較多；影響生根數(shù)的因素為培養(yǎng)基＞NAA ＞IBA。處理2 的生根率最高（96.67%），根長和生根數(shù)均表現(xiàn)較好，非洲辣木生根的最優(yōu)培養(yǎng)基為1/2 MS + NAA 1.0 mg/L +IBA 1.0 mg/L。

表3 不同處理對生根的影響Tab.3 Effect of different treatments on rooting

2.5 不同基質(zhì)對幼苗移栽的影響

在不同移栽基質(zhì)中，幼苗的存活率均在80%以上；處理2 的存活率最高（94.44%）；處理5 次之（92.22%）；處理1 和處理4 的存活率較低，顯著低于其他處理（P＜0.05）（表5）。處理2的苗木存活率高且生長較好，泥炭土為最適合的移栽基質(zhì)。

表5 不同移栽基質(zhì)對幼苗存活率的影響Tab.5 Effects of different transplanting substrates on survival rates of seedlings

表4 不同因素的極差分析Tab.4 Range analysis on different factors

3 討論與結論

消毒是植物組織培養(yǎng)的關鍵環(huán)節(jié)[16]。處理方式、消毒試劑及消毒時間均會影響種子萌發(fā)。研究結果表明，非洲辣木種子經(jīng)剝殼、清水中浸泡30 min + 75%酒精消毒1 min + 0.1%的升汞消毒10 min 處理后，消毒效果較好，種子發(fā)芽率較高，污染率較低。辣木外殼表面細菌多，剝除外殼結合消毒處理，可有效減少污染，提高發(fā)芽率。

培養(yǎng)基在繼代增殖過程中發(fā)揮重要作用。研究結果顯示，非洲辣木在以MS 為基本培養(yǎng)基的處理上增殖效果較好，與劉德承[17]的研究結果一致。MS 培養(yǎng)基中較高濃度的NH4+和NO3

-更適合非洲辣木不定芽的增殖。基本培養(yǎng)基只能使外植體存活下來，想要獲得更優(yōu)質(zhì)的試管苗，需添加植物生長調(diào)節(jié)劑促使其生長和分化。本研究在非洲辣木愈傷組織誘導和繼代增殖階段選用的植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA 和KT。相關研究表明，6-BA 濃度為0.5 ～1.2 mg/L 時，濃度與愈傷組織生長呈正相關[18]；6-BA 濃度為0.02 ～1.0 mg/L 時，隨濃度升高，愈傷組織生長增加[19]。本研究結果顯示，在非洲辣木愈傷組織誘導試驗中，KT 濃度為1.0 mg/L 時，隨6-BA濃度升高，誘導率先升后降，1.0 mg/L 時最高，與之前的研究結果基本一致。在誘導培養(yǎng)基中添加適量的KT 可改善愈傷組織的質(zhì)量，延緩其器官分化能力的喪失，提高植株再生頻率[20]。本試驗結果顯示，6-BA 濃度為0.1 mg/L 時，KT 濃度的增加有利于愈傷組織誘導；6-BA 濃度為1.0 或2.0 mg/L時，愈傷組織誘導率與KT 濃度間存在“低促高抑”的現(xiàn)象，調(diào)節(jié)各植物生長調(diào)節(jié)劑的配比尤為重要。在繼代增殖過程中，培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑間的相互作用共同影響非洲辣木的增殖。非洲辣木繼代增殖的最適培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基；以MS 為基本培養(yǎng)基時，增殖系數(shù)隨6-BA 和KT 濃度的增加先增后降，6-BA 濃度為0.6 mg/L、KT 濃度為0.3 mg/L 時，增殖系數(shù)可達4.62，增殖效果最佳。

木本植物生根是離體培養(yǎng)的關鍵步驟[21]，培養(yǎng)基種類和植物生長調(diào)節(jié)劑等對組培苗生根均會產(chǎn)生一定影響。非洲辣木在無機鹽濃度較低的1/2 MS培養(yǎng)基上生根效果較好，高濃度無機鹽易使外植體切面產(chǎn)生愈傷組織，不利于生根。試管苗生根多屬于不定根，根原基不是植物體內(nèi)固有的，而是在植物生長調(diào)節(jié)劑等因素作用下形成的，添加外源植物生長調(diào)節(jié)劑有利于不定根形成[22]。NAA 和IBA 是誘導不定根形成的常用植物生長調(diào)節(jié)劑，其不同濃度配比會對植物生根產(chǎn)生不同影響，因此需要調(diào)節(jié)各植物生長調(diào)節(jié)劑的配比，在保證生根的情況下，讓根多且粗壯，利于移栽成活。本試驗結果顯示，以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，NAA 為1.0 mg/L、IBA 為1.0 mg/L 時，非洲辣木生根率最高，生根數(shù)較多，根細長且愈傷組織少，利于苗木移栽成活。

移栽基質(zhì)與移栽成活率和生長狀況密切相關[23]。本研究中，以泥炭土作為移栽基質(zhì)，非洲辣木的移栽成活率高達94.44%，可能是因為泥炭土持水性和透氣性好，能減少水分流失，同時其腐殖質(zhì)豐富，能為苗木生長提供足夠的養(yǎng)分。

非洲辣木種子經(jīng)過剝殼處理，經(jīng)清水浸泡30 min+75%酒精消毒1 min+0.1%升汞消毒10 min處理后，可達到很好的發(fā)芽效果；愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基為MS + 6-BA 1.0 mg/L + KT 1.0 mg/L，誘導率為89.89%；繼代增殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.6 mg/L + KT 0.3 mg/L，增殖系數(shù)為4.62；生根最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L，生根率為96.67%；以泥炭土作為移栽基質(zhì)，能顯著提高試管苗的移栽成活率。綜合來看，在本研究建立的組培快繁技術體系下，非洲辣木外植體誘導、繼代增殖、生根培養(yǎng)及煉苗移栽效果理想，該技術體系可在工廠化育苗中推廣應用，可為非洲辣木快速繁殖和緩解種苗短缺提供保障。