1株利用乳酸的豬源丁酸梭菌的分離鑒定及基因組序列分析

胡曉冰，林標聲，王振偉，鄭黎靜

(1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院，開封 475004；2.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364012；3.龍巖學(xué)院，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點實驗室，龍巖 364012)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)，又名丁酸菌、酪酸梭菌、丁酸梭狀芽孢桿菌，為革蘭氏陽性厭氧桿菌[1]。丁酸梭菌是人和動物體內(nèi)腸道正常益生菌群，廣泛存在于腐乳、酸奶、奶酪等食品及一些酒窖土壤中[2]。丁酸梭菌主要代謝產(chǎn)物是丁酸，而丁酸是促進腸道上皮組織細胞再生和修復(fù)的重要物質(zhì)[3]。大量研究表明，丁酸梭菌對腸道常見致病菌幽門螺桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌等均有良好的抑制增殖作用[4]；而且丁酸梭菌在腸道中還能分泌淀粉酶、纖維素酶、糖苷酶、蛋白酶等，生產(chǎn)促進機體消化吸收的葡萄糖、麥芽糖等營養(yǎng)物質(zhì)，以及部分寡糖，為其他益生菌提供營養(yǎng)物質(zhì)[5]。因而，食用丁酸梭菌可以維持腸道優(yōu)勢益生菌群，促進微生態(tài)平衡。近年來，丁酸梭菌被制成顆粒、膠囊、菌液劑等保健食品，在食品領(lǐng)域的研究逐漸受到重視，得到較為廣泛的應(yīng)用[6-7]。在養(yǎng)殖業(yè)中，丁酸梭菌作為飼料添加劑，可以促進機體健康，提高動物生產(chǎn)性能和畜產(chǎn)品品質(zhì)[8-9]。此外，制備乳酸菌-丁酸梭菌聯(lián)合益生菌發(fā)酵飼料可以改善單獨使用乳酸菌發(fā)酵飼料引起的畜禽腸道乳酸過多的不良反應(yīng)[10]。因此，本研究以乳酸為唯一碳源和能源制備篩選培養(yǎng)基，從使用乳酸菌發(fā)酵飼料的健康仔豬腸道內(nèi)分離能轉(zhuǎn)化乳酸為丁酸的丁酸梭菌臨床株，對其菌群進行16S rDNA鑒定及Illumina Miseq二代測序，揭示其種屬親緣關(guān)系和基因組相關(guān)信息，以期為深入研究該菌株的遺傳多樣性及丁酸梭菌益生菌制劑的推廣應(yīng)用提供相關(guān)背景信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 4%乳酸菌發(fā)酵飼料飼喂的未接受任何抗生素的仔豬腸道內(nèi)容物，采自福建省漳平市順佳農(nóng)牧發(fā)展有限責任公司生豬養(yǎng)殖場。

1.1.2 培養(yǎng)基 乳酸分解培養(yǎng)基(LADM培養(yǎng)基)：酪蛋白10 g，酵母膏2.5 g，磷酸二氫鉀0.45 g，磷酸氫二鉀 0.45 g，半胱氨酸1 g，NaCl 0.9 g，氯化鈣 0.09 g，硫酸鎂0.09 g，生物素10 μg，血紅素10 mg，鈷胺素10 μg，吡哆胺150 μg，葉酸50 μg，對氨基苯甲酸30 μg，核黃素0.5 μg，硫胺素0.5 μg，刃天青1 mg，添加5 mL乳酸(0.6%左右，66 mmol)作為碳源，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.0～6.5，固體培養(yǎng)基另添加瓊脂20 g，121 ℃滅菌20 min。

梭菌增殖培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)：葡萄糖5 g，牛肉膏10 g，胰蛋白胨10 g，酵母膏3 g，可溶性淀粉1 g，三水合乙酸鈉3 g，氯化鈉5 g，刃天青0.3 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.5～7.0，固體培養(yǎng)基另添加瓊脂20 g，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑與儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自天根生化科技(北京)有限公司；測序儀(3730XL)和PCR儀(2720 thermal cycler)購自應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；板式離心機(5810R)購自Eppendorf公司；凝膠成像裝置(JY04S-3C)和電泳儀(JY300C Power Supply)均購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；高效液相色譜儀(LC-16)購自島津公司；厭氧手套箱(YQX-11)購自上海海向儀器設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 初篩：取采集的樣品10 g，加入50 mL LADM液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下震蕩厭氧(培養(yǎng)基中加入0.1%的硫乙醇酸鈉厭氧還原劑)富集培養(yǎng)5 d，然后按5%比例接入含LADM的厭氧管繼續(xù)培養(yǎng)，定期監(jiān)測乳酸的消耗，當乳酸可快速降解時，按10倍稀釋法稀釋菌液，在厭氧箱內(nèi)均勻涂布于LADM固體培養(yǎng)基平板上，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)3～5 d，挑選單一菌落，劃線接種于LADM固體培養(yǎng)基上進行菌株純化，直至獲得單一菌株克隆后，接種于斜面厭氧管保存。

復(fù)篩：將初篩出的菌株接種到裝有10 mL RCM液體培養(yǎng)基的厭氧管中，80 ℃下熱敷10 min，用水冷卻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧富集培養(yǎng)4 d，定期監(jiān)測乳酸的消耗，挑選有大量氣泡生成的培養(yǎng)液，進一步在RCM 固體培養(yǎng)基中進行富集、傳代，篩選利用乳酸快、丁酸轉(zhuǎn)化率高的為目標菌株，進行下一步研究。

1.2.2 形態(tài)鑒定 將獲得的目標菌株進行平板菌落觀察、革蘭氏染色及芽孢染色觀察，具體方法參照《微生物學(xué)實驗》[11]。

1.2.3 16S rDNA序列分析 按試劑盒說明書提取純化細菌的基因組DNA，采用16S rDNA通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAGC-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體系為50 μL：DNA模板1 μL,2×TsingKE Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，送北京奧維森基因科技有限公司進行測序。測得的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對，下載相關(guān)菌株的序列信息，采用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.4 乳酸轉(zhuǎn)化特性試驗 將所篩選的菌株制備成菌懸液(108CFU/mL)，按5%比例接種到LADM液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)5 d，定期取樣測定菌株生長D600 nm值、乳酸消耗量和丁酸生成量，分析所篩選菌株生長情況與乳酸轉(zhuǎn)化的特性。乳酸、丁酸含量使用高效液相色譜儀測定[7]：色譜柱HypersilC 184.6 mm×150 mm，5 μm；移動相2.5 mmol/L磷酸二氫銨，pH 2.65，流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm。

1.2.5 菌株的重測序及分析 采用高通量測序技術(shù)(next-generation sequencing technology，NGS)對所篩選菌株進行重測序及分析，具體流程如下：提取所篩選的菌株基因組DNA，樣品的DNA純度、完整性檢測合格后，構(gòu)建DNA小片段文庫；再經(jīng)質(zhì)量檢測合格后，按照文庫有效濃度及期望數(shù)據(jù)量的需求對文庫進行匯集(pooling)，最后根據(jù)測序讀長，在測序儀上機測序。所測得的有效測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組(BioProject登錄號：PRJNA478481)中，獲得單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點、插入缺失(insertion/deletion，InDel)、結(jié)構(gòu)變異(structure variation，SV)、拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)等遺傳變異信息并進行比對分析[12]。

1.2.6 菌株的二代基因組測序及功能分析 在北京奧維森基因科技有限公司Illumina MiSeq測序平臺通過二代基因組測序獲得所篩選菌株的Raw reads數(shù)據(jù)，經(jīng)Trimmomatic(v0.36)軟件進行數(shù)據(jù)的質(zhì)控，獲得Clean reads，再經(jīng)SPAdes v3.13.0軟件拼接、組裝，獲得菌株的基因組基本數(shù)據(jù)[13]。通過基因預(yù)測分析菌株基因組的編碼基因及非編碼DNA結(jié)構(gòu)、串聯(lián)重復(fù)序列、CRISPR結(jié)構(gòu)組件等，得到菌株的基因組組分。再將預(yù)測得到的蛋白質(zhì)編碼基因與各個標準功能數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，并進行特定功能數(shù)據(jù)庫注釋、比較基因組等高級分析[14]。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的分離鑒定

本研究通過LADM培養(yǎng)基初篩、RCM培養(yǎng)基復(fù)篩，篩選到1株菌株。所篩選菌株菌落呈奶油色，圓形，邊緣整齊、稍突，表面濕潤光滑，不透明，有酸臭味(圖1A)。 顯微鏡下，其基本形態(tài)為革蘭氏陽性桿菌、梭狀，次端生芽孢、卵圓，(0.6～1.1) μm×(4.0～7.0) μm(圖1B)。將此分離菌株命名為LY33。 LY33菌株的16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2，其PCR產(chǎn)物大小為1 400 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致。所得序列經(jīng)NCBI BLAST比對發(fā)現(xiàn)，LY33菌株與丁酸梭菌(C.butyricumTK2(登錄號:KJ558432))一致性達到99.8%(圖3)，屬于丁酸梭菌。

A，平板菌落形態(tài)；B，顯微鏡下的菌體形態(tài)(1 000×)

圖2 LY33菌株16S rDNA PCR電泳圖

圖3 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)進化樹

2.2 菌株的乳酸轉(zhuǎn)化性能分析

LY33菌株菌體生長、乳酸消耗及丁酸生成如圖4所示，乳酸消耗及丁酸生成過程基本與LY33菌株菌體生長同步，LY33菌株利用乳酸生產(chǎn)丁酸的能力較強。當菌體在對數(shù)生長期生長較快時(2～6 d)，LY33菌株對乳酸的轉(zhuǎn)化速度較快，丁酸的生成量較大，在第6天可將66 mmol的乳酸基本轉(zhuǎn)化完全，生成17 mmol左右的丁酸。

圖4 LY33菌株菌體生長、利用乳酸生產(chǎn)丁酸的曲線圖

2.3 菌株重測序結(jié)果分析

2.3.1 與參考基因組的比對結(jié)果 LY33菌株經(jīng)高通量測序技術(shù)上機測序，獲得原始堿基1 693 386 900 bp、有效率99.77%、GC含量29.83%。使用BWA程序把有效測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對，經(jīng)SAMtools對結(jié)果進行排序，匹配率為90.13%、測序深度為1×的最小覆蓋范圍為89.33%，測序深度為4×的最小覆蓋范圍為89.26%。LY33菌株的測序深度的分布及累積分布如圖5所示，LY33菌株測序所得數(shù)據(jù)能較好的覆蓋參考基因組。

圖5 LY33菌株測序深度及累計分布圖

2.3.2 基因組的變異分析 采用ANNOVAR軟件對LY33菌株進行遺傳變異信息的注釋，結(jié)果表明與參考基因組相比，LY33菌株全基因組雜合比率為0.022‰，SNP位點變異總數(shù)21 590個(占整個基因組0.4666%)，InDel突變總和為594個(占0.0128%，其中包括插入突變總和299個、缺失突變總和295個)，SV注釋的變異總數(shù)103個(占0.0003%，其中包括缺失76個、倒置12個、染色體內(nèi)部遷移8個、染色體間的遷移7個)，不存在CNV注釋的變異。將所獲得的SNP、InDel、SV和CNV遺傳變異信息與參考基因組上對應(yīng)的位置信息分析表明，突變基因主要為假設(shè)蛋白(hypothetical protein)、淀粉結(jié)合蛋白(starch-binding protein)、生物素合成酶BioB(biotin synthase BioB)、生物素轉(zhuǎn)運體BioY(biotin transporter BioY)、?；?sn-甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase)、碳水化合物激酶(carbohydrate kinase)、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase)、甲基化趨化蛋白(methyl-accepting chemotaxis protein)、蔗糖-6-磷酸水解酶(sucrose-6-phosphate hydrolase)、含有蛋白的轉(zhuǎn)運體-底物結(jié)合域(transporter substrate-binding domain-containing protein)等與菌株生長、能量代謝調(diào)節(jié)、維生素合成(特別是生物素)有關(guān)的基因，分布于2條染色體多個序列上。

2.4 菌株二代基因組測序及功能注釋分析

2.4.1 菌株基因組基本信息 通過Illumina MiSeq測序平臺獲得了LY33菌株高質(zhì)量基因組序列，獲得Raw reads 5 644 623個,使用SPAdes v3.13.0軟件對測序菌株質(zhì)控后的測序數(shù)據(jù)進行組裝，最終獲得菌株基因組大小4 627 127 bp，GC含量28.60%，使用Prokka1.13.7軟件對細菌基因組進行注釋預(yù)測，LY33菌株預(yù)測基因總長度3 892 563 bp，預(yù)測基因數(shù)量4 171個，編碼區(qū)總長度占全基因組84.12%。將測序原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得BioProject登錄號：PRJNA761144。

2.4.2 菌株編碼基因蛋白的功能注釋 將LY33菌株所預(yù)測的基因蛋白編碼序列輸入NR、SwissProt、GO、KEGG、COG、InterproScan、CAZyme數(shù)據(jù)庫中進行比對(Diamond，Evalue≤1e-5)，各數(shù)據(jù)庫中注釋到的基因個數(shù)(非冗余)分別為：4 166、2 683、2 491、2 086、3 060、3 691和175個。

其中GO數(shù)據(jù)庫注釋得到三大分類統(tǒng)計中基因種類和數(shù)量最多的是生物過程(biological process)，其次是分子功能(molecular function)，細胞組分(cellular component),注釋到的基因種類和數(shù)量最少(圖6)。 KEGG注釋中，數(shù)量最多的代謝通路類別分別是：碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、全部和全局觀覽圖(global and overview maps)、膜運輸(membrane transport)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)(圖7)。COG數(shù)據(jù)庫注釋中數(shù)量最多的是碳水化合物運輸和代謝(carbohydrate transport and metabolism)(圖8)。表明LY33菌株的基因功能與細胞代謝密切相關(guān)，并參與了多種物質(zhì)的代謝途徑轉(zhuǎn)化。此外，CARD數(shù)據(jù)庫中共有109個抗性基因得到注釋，其中基因個數(shù)最多的前13個抗性基因見圖9，基因個數(shù)最多的抗性基因前3位是ARO:3000535(39個)、ARO:3002987(19個)和ARO:3003728(14個)，分別與抗大環(huán)內(nèi)酯類藥物、抗桿菌肽、VanI糖肽抗性基因有關(guān)。

圖6 LY33菌株的GO功能注釋

圖7 LY33菌株的KEGG通路分析

圖8 LY33菌株的COG功能分類

圖9 LY33菌株的前13個抗性基因的CARD數(shù)據(jù)庫注釋個數(shù)

3 討 論

除了飼喂乳酸菌等益生菌發(fā)酵飼料能在動物體內(nèi)積累乳酸外，動物和人消化道內(nèi)有許多微生物如嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillusacidophilus)、糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)等也都能產(chǎn)生乳酸[15]。乳酸對酸化飼料、降低畜禽胃內(nèi)容物pH、殺滅腸道有害微生物，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、刺激消化酶分泌等均具有良好的功效[16]，但過多的乳酸容易導(dǎo)致畜禽短腸綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎等疾病[10]。而丁酸在維持腸道生理平衡、保持上皮細胞完整性，降低腸炎和糖尿病等方面發(fā)揮重要作用[17]。因此腸道內(nèi)能夠代謝乳酸、產(chǎn)生丁酸的丁酸梭菌及其發(fā)酵制劑的研究越來越引起了研究者的重視，對飼用益生素的進一步發(fā)展有較好的實際意義[18-19]。

本研究對所分離的丁酸梭菌進行重測序，結(jié)果表明，LY33菌株基因組特別是編碼基因整體變異較小，假設(shè)蛋白、淀粉結(jié)合蛋白、生物素合成酶BioB、生物素轉(zhuǎn)運體BioY、?；?sn-甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶、碳水化合物激酶等與菌體生長、能量代謝，維生素合成(特別是生物素)的功能基因變異增強。經(jīng)查閱測序的基因描述(gene description)文件，LY33菌株基因組中確實含有豐富的維生素合成基因，如硫胺素合成酶(thiamine phosphate synthase)、核黃素合酶(riboflavin synthase)、雙功能葉酸聚谷氨酸合酶(bifunctional folylpolyglutamate synthase)、6-羧基四氫葉黃素合酶(6-carboxytetrahydropterin synthase)、生物素-(乙酰輔酶A羧化酶)連接酶(biotin--(acetyl-CoA-carboxylase) ligase)、生物素依賴性羧基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白(biotin-dependent carboxyltransferase family protein)等，進一步支持了丁酸梭菌具有合成B族維生素、淀粉酶等功能的研究報道[20-21]，在動物腸道內(nèi)應(yīng)用具有保健作用。此外，LY33菌株框架圖測序及其編碼基因蛋白的功能注釋表明，LY33菌株生長過程中涉及了各種的能量、膜轉(zhuǎn)運、氨基酸代謝的通路，推測與其產(chǎn)生淀粉酶、維生素有關(guān)，且對大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類抗生素具有較強的抗性，可通過抗生素表型試驗做進一步的驗證。

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序技術(shù)已成為微生物基因組學(xué)研究的重要手段和分析方法[22]。本研究通過對仔豬腸道內(nèi)容物中分離的丁酸梭菌進行重測序及二代框架測序，有利于在分子水平揭示丁酸梭菌的基因架構(gòu)及功能特性的本質(zhì)，為其在生物發(fā)酵飼料、功能食品、生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。總之，本研究所獲得的丁酸梭菌LY33菌株有望作為一種新的微生物資源用于微生態(tài)制劑產(chǎn)品的生產(chǎn)，并能與乳酸菌、芽孢菌、雙歧桿菌等益生菌復(fù)配使用，增強此類產(chǎn)品的功效[23-24]。與目前廣泛應(yīng)用的非芽孢類活菌制劑相比，丁酸梭菌及其復(fù)合菌制劑更具廣闊的市場前景。

4 結(jié) 論

本研究從飼喂4%乳酸菌發(fā)酵飼料的健康仔豬腸道內(nèi)容物中分離到1株利用乳酸快、丁酸轉(zhuǎn)化率高的LY33菌株，經(jīng)鑒定為丁酸梭菌。LY33菌株的重測序表明，其基因組特別是編碼基因整體變異較小，突變基因主要為與菌株生長、 能量代謝調(diào)節(jié)、 維生素合成(特別是生物素)有關(guān)的基因。LY33菌株框架圖測序及其編碼基因蛋白的功能注釋表明，其基因組序列長度4 627 127 bp、GC含量28.60%，含有4 171個基因,編碼區(qū)總長度占比84.12%，參與了糖代謝、膜轉(zhuǎn)運和氨基酸代謝等多種代謝途徑轉(zhuǎn)化過程，基因組中抗大環(huán)內(nèi)酯類藥物、抗桿菌肽、VanI糖肽抗性基因個數(shù)較多。