微生態(tài)制劑調(diào)控比格幼犬生長性能和腸道菌群的研究

王志華，賈俊鵬，RADEBE Stoffel Matjeke，庾慶華

(南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210018)

犬是人類最重要的伴侶寵物，與人相比，犬更易受到食物污染、病原微生物和應激等多因素侵害，導致炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、腸應激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)等腸道疾病產(chǎn)生。微生態(tài)制劑(microecologics)是利用益生菌活菌、死菌或其代謝產(chǎn)物制備，用于調(diào)整微生態(tài)失調(diào)，保持微生態(tài)平衡，提高機體健康水平，以達到防病、治病效果的制劑。微生態(tài)制劑主要用于治療動物胃腸道疾病和提高經(jīng)濟動物的生產(chǎn)性能[1-2]。關于微生態(tài)制劑用于犬類的研究，Lee等[3]將分離自犬糞便的嗜酸乳桿菌HY7032(LactobacillusacidophilusHY7032)和羅伊氏乳桿菌HY7506(LactobacillusreuteriHY7506)混合制備微生態(tài)制劑，并對注射了萬古霉素和多黏菌素的6月齡比格犬連續(xù)灌喂該制劑3周，發(fā)現(xiàn)該微生態(tài)制劑能顯著改善抗生素引起的菌群失調(diào)，同時改善毛發(fā)質(zhì)量。 Xu等[4]對40只不同年齡腹瀉犬使用干酪乳桿菌Zhang(LactobacilluscaseiZhang)、植物乳桿菌P8(LactobacillusplantarumP8)和乳雙歧桿菌V9(Bifidobacteriumsp.lactisV9)制備的微生態(tài)制劑，發(fā)現(xiàn)該微生態(tài)制劑可以顯著改善病犬的腹瀉癥狀，調(diào)整其腸道菌群。但是上述報道都僅關注2月齡以上的斷奶犬，對于2月齡以下哺乳期幼犬，灌喂益生菌后其生理狀態(tài)改變狀況的研究鮮見報道。腸道菌群平衡于生命早期建立[1]，腸道細菌定植的關鍵階段是在出生后至斷奶期間。由于幼犬免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，腸道菌群結構不穩(wěn)定，通過飲食攝入益生菌對幼犬菌群的影響更大，故哺乳期幼犬腸道健康尤其值得關注。本研究利用微生態(tài)制劑灌喂哺乳期比格幼犬，綜合評價微生態(tài)制劑對比格幼犬正常生長發(fā)育的影響，同時對幼犬糞便進行菌群16S rDNA測序，檢測多樣性和豐度，研究微生態(tài)制劑對幼犬腸道菌群的影響，為今后深入探究微生態(tài)制劑調(diào)控幼犬生長性能和腸道菌群的具體機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微生態(tài)制劑 試驗用復合微生態(tài)制劑購自南京谷登寵物用品有限公司，其組成包括動物雙岐桿菌(Bifidobacteriumanimalis，1.3×109CFU/g)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，3.5×109CFU/g)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis，5.0×108CFU/g)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus，1.0×108CFU/g)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，8.0×108CFU/g)、凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans，2.0×109CFU/g)、果寡糖、L-精氨酸、?；撬?、DL-α-生育酚乙酸酯、D-泛酸鈣、葡萄糖和糊精。益生菌總菌量為6.0×109CFU/g，除益生菌外其余成分總和≤0.1%。

1.1.2 試驗動物 試驗所用比格犬購自儀征安立卯生物科技有限公司。 選取15日齡比格犬12只(由2只健康母犬第一胎次分娩)，初體重(717±84)g。

1.1.3 主要試劑及儀器 免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、犬白介素-1β(IL-1β)、脂多糖(LPS)等ELISA試劑盒均購自江蘇酶聯(lián)生物科技有限公司；TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒購自北京諾禾致源生物科技有限公司。酶標儀(Multiskan FC)購自賽默飛公司；Illumina NovaSeq 6000測序平臺購自北京諾禾致源生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組處理及樣品采集 12只比格犬隨機分為對照組(Control，n=6)和微生態(tài)制劑組(Probiotics，n=6)。對照組和微生態(tài)制劑組幼犬分別由奶水充足的健康母犬母乳喂養(yǎng)，母犬處于同一飼養(yǎng)管理環(huán)境，每只母犬各自喂養(yǎng)同一組6只幼犬，不限制幼犬與母犬的接觸。 每天09:00每只對照組幼犬灌喂20 mL生理鹽水，微生態(tài)制劑組灌喂20 mL微生態(tài)制劑溶液(18 g微生態(tài)制劑溶于20 mL生理鹽水)，每日灌喂益生菌總菌量約為1.08×1011CFU。第28天每只犬挑取2～3 g糞便置于無菌凍存管中，并于-80 ℃保存待檢。 同時各組犬禁食12 h。 禁食結束，對12只犬經(jīng)后肢隱靜脈空腹采血0.5 mL于肝素抗凝管中，4 ℃保存待檢。同時采血2 mL于真空促凝管中，1 200 r/min離心5 min，分離血清，-20 ℃待檢。

1.2.2 生長性能檢測 于試驗0、3、9、12、15、18、21、25、28 d 08:00稱量12只犬的空腹體重，并計算凈增重。

凈增重=當日稱重量-0 d稱重量

1.2.3 血液學指標測定 將0.5 mL抗凝血樣送至南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)院，使用ABX MICROS 60全自動三分類血細胞分析儀對犬血液進行紅細胞計數(shù)(RBC)和血紅蛋白(HGB)濃度測定；將1 mL血清樣送至南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)院，使用愛德士Catalyst Dx 生化分析儀檢測犬血清中堿性磷酸酶(AKP)、無機磷(IP)、總膽固醇(TCHO)和甘油三酯(TG)含量。

1.2.4 血清免疫指標測定 使用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測犬血清中IgA、IgG、IL-1β和LPS含量。在預先包被捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HR標記的檢測抗體，進行溫育并徹底洗滌。用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，用酶標儀測定D450 nm值，計算樣品濃度。

1.2.5 腸道菌群16S rDNA測序 采集幼犬糞樣后送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行16S rDNA高通量測序分析。首先采用SDS法對樣本的基因組DNA進行提取，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，對模板的16S V4區(qū)進行PCR擴增(引物806R：5′-GG-ACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；515F：5′-GTG-CCAGCMGCCGCGG-3′)得到PCR產(chǎn)物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit進行文庫構建，文庫合格后，對PCR產(chǎn)物使用NovaSeq 6000平臺進行上機測序，得到下機數(shù)據(jù)。根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行拼接、過濾得到有效數(shù)據(jù)(Clean data)。然后基于有效數(shù)據(jù)進行聚類，默認以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，并對OTUs序列進行物種注釋。對不同樣本在97%一致性閾值下的Alpha多樣性分析指數(shù)(Goods coverage、Observed species、Shannon)進行統(tǒng)計，并基于Weighted Unifrac距離對樣本進行PCoA分析。用Mothur方法與SILVA138(http:∥www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析，獲得分類學信息并分別統(tǒng)計各樣本的在門(phylum)、屬(genus)、種(species)水平上的物種分布情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t檢驗，結果用平均值±標準誤表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 微生態(tài)制劑對比格幼犬生長性能的影響

灌喂微生態(tài)制劑后，30～43日齡微生態(tài)制劑組幼犬體重均顯著高于對照組(P<0.05，圖1A)；15～43日齡微生態(tài)制劑組幼犬凈增重顯著高于對照組(P<0.05，圖1B)。

①A，比格幼犬15～43日齡體重變化；B，比格幼犬15～43日齡凈增重。②*,差異顯著(P<0.05)；無標記，表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 微生態(tài)制劑對比格幼犬血液學指標的影響

微生態(tài)制劑組比格幼犬RBC數(shù)及血清HGB、AKP和IP含量均顯著增高(P<0.05)；微生態(tài)制劑組比格幼犬血清TCHO與對照組無顯著差異(P>0.05)，血清TG顯著降低(P<0.05)(圖2)。

圖2 比格幼犬血液學指標

2.3 微生態(tài)制劑對比格幼犬血清免疫指標的影響

與對照組相比，微生態(tài)制劑組比格幼犬血清中LPS、IL-1β、IgG、IgA含量均無顯著差異(P>0.05，圖3)。

圖3 比格幼犬血清免疫學指標

2.4 比格幼犬腸道菌群測序結果

2.4.1 菌群測序信息統(tǒng)計及多樣性分析 Goods coverage指數(shù)為本次測序結果的樣本覆蓋度，由圖4A可知，對照組與微生態(tài)制劑組的Goods coverage指數(shù)均高于0.990，提示本次菌群測序已經(jīng)基本涵蓋樣本中的所有物種信息，數(shù)據(jù)具有可信度。由圖4B可知，微生態(tài)制劑組比格幼犬腸道菌群Observed species指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，提示微生態(tài)制劑組比格幼犬菌群物種豐富度顯著增加；由圖4C可知，微生態(tài)制劑組比格幼犬菌群Shannon指數(shù)高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。由圖4D可知，微生態(tài)制劑組和對照組樣本群落處于不同區(qū)域，兩組樣本群落結構置信區(qū)域只有小部分重疊，提示微生態(tài)制劑會對比格幼犬腸道菌群結構造成很大改變。

A，Goods coverage指數(shù)箱形圖；B，Observed species指數(shù)箱形圖；C，Shannon指數(shù)箱形圖；D，基于Weighted Unifrac 距離PCoA主坐標分析，橫坐標表示一個主坐標成分，縱坐標表示另一個主坐標成分，百分比表示主成分對樣本差異的貢獻值；圖中的每個點表示一個樣本，每個橢圓為各組樣本的95%置信橢圓，同一組的樣本使用同種形狀表示

2.4.2 微生態(tài)制劑對比格幼犬腸道菌群門水平物種構成的影響 由圖5可知，在門水平上，幼犬腸道菌群主要為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroides)、梭桿菌門(Fusobacteriota)等。與對照組相比，微生態(tài)制劑組比格幼犬腸道菌群中擬桿菌門和放線菌門相對豐度顯著降低(P<0.05)；酸桿菌門(Acidobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)相對豐度顯著增加(P<0.05)。

A，門水平前十物種相對豐度堆積柱狀圖；B，門水平主要物種相對豐度比較

2.4.3 微生態(tài)制劑對比格幼犬腸道菌群屬水平物種構成的影響 由圖6可知，在屬水平上，幼犬腸道菌群主要為Escherichia-Shigella、鏈球菌屬(Streptococcus)、霍爾德曼氏菌屬(Holdemanella)、梭菌屬(Clostridiumsensustricto1)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等。 與對照組相比，微生態(tài)制劑組比格幼犬腸道菌群Escherichia-Shigella、霍爾德曼氏菌屬、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和布勞特氏菌屬(Blautia)相對豐度均顯著降低(P<0.05)；梭菌屬、梭桿菌屬(Fusobacteria)、乳球菌屬(Lactococcus)和片球菌屬(Pediococcus)相對豐度顯著增加(P<0.05)。

A，屬水平前十物種相對豐度堆積柱狀圖；B，屬水平主要物種相對豐度比較

2.4.4 微生態(tài)制劑對比格幼犬腸道菌群種水平物種構成的影響 由圖7可知，在種水平上，幼犬腸道菌群主要為大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、巴黎鏈球菌(Streptococcuslutetiensis)、Fusobacteriummortiferum和短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)等。與對照組相比，微生態(tài)制劑組比格幼犬腸道菌群大腸桿菌和短雙歧桿菌相對豐度均顯著降低(P<0.05)；犬大腸梭菌(Clostridiumcolicanis)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)、Vagococcusteuberi、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、糞腸球菌(Enterococcusfaecium)和死亡梭桿菌(Fusobacteriummortiferum)相對豐度均顯著增加(P<0.05)。

3 討 論

3.1 微生態(tài)制劑對比格幼犬體重的影響

本試驗中，灌喂微生態(tài)制劑的比格幼犬體重顯著增加，推斷該微生態(tài)制劑提高了處于發(fā)育期的比格幼犬對犬母乳的消化吸收水平。 朱群等[5]對乳仔豬連續(xù)灌喂1×109CFU干酪乳桿菌和糞腸球菌，發(fā)現(xiàn)灌服益生菌能顯著提高仔豬的平均日增重，與本試驗結果一致。 Cui等[6]在8周齡豬的玉米豆粕飼料中添加4.0×1011CFU/kg的枯草芽孢桿菌,發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能顯著提高豬的平均日增重并降低料重比。 Biourge等[7]對5～10歲德國向?qū)偷聡裂蛉辔?.5×108CFU釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、Sun等[2]對1～2歲的比格幼犬灌喂3.0×109CFU的WeissellacibariaJW15均未影響到試驗組犬對飼料干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的消化能力，與本試驗結果存在差異。犬攝取益生菌后，在消化吸收水平上存在較大差異，可能與服用益生菌種類、所處生理階段及食用飼糧類型等因素有關。

3.2 微生態(tài)制劑對比格幼犬血液學指標的影響

血液學指標可以反映犬的生理狀態(tài)和免疫系統(tǒng)狀態(tài)。當體內(nèi)外環(huán)境發(fā)生一定變化時，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡被打破，機體內(nèi)相關指標隨之變化[8]。紅細胞是血液運輸氧氣的主要媒介，通過HGB與氧氣結合，使氧氣到達全身。本試驗結果表明，微生態(tài)制劑組比格幼犬血液紅細胞數(shù)、HGB量均顯著增高，說明其血氧容量得到提高。AKP廣泛分布于動物肝臟、骨骼、腸、腎臟和胎盤等組織，經(jīng)肝臟向膽外分泌，血清中AKP活性可以反映動物生長速率和生產(chǎn)性能[9-10]。無機磷與動物機體骨骼發(fā)育密切相關，鈣磷比例是否平衡關系到幼犬正常生長發(fā)育過程。涉及血脂水平的機制尚未完全闡明，可能是因為益生菌可發(fā)酵難以消化的碳水化合物，分泌短鏈脂肪酸[11-12]，促進膽固醇從血漿中再分配至肝臟，從而降低血脂水平[13]。Baillon等[14]給健康犬連續(xù)灌喂28 dLactobacillusacidophilusDSM 13241，結果顯示，犬的RBC數(shù)、RBC壓積、HGB濃度均顯著升高,犬免疫力得到了提高。Sun等[2]對1～2歲的比格犬灌喂WeissellacibariaJW15發(fā)現(xiàn)，比格犬血清TG和高密度脂蛋白水平會隨Weissellacibaria灌喂量增加而顯著降低；Cui等[6]在8周齡豬的玉米豆粕飼料中添加4.0×1011CFU/kg的枯草芽孢桿菌后發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌同樣能顯著降低血清TG水平， 與本試驗中幼犬TG含量降低趨勢一致， 表明微生態(tài)制劑可以提高比格幼犬血氧容量，并降低其血脂水平。Silva-Morita等[15]對20只小鼠灌喂50 g/kg果寡糖，發(fā)現(xiàn)小鼠血清TCHO顯著下降。本試驗比格犬血清TCHO水平差異不顯著，可能是由于飼喂時間與動物物種等存在一定的差異性。

3.3 微生態(tài)制劑對比格幼犬血清免疫指標的影響

IL-1β為一種致炎細胞因子，由單核和巨噬細胞分泌，廣泛參與動物機體組織破壞、水腫形成等多種病理損傷過程[16]。LPS是革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，在腸壁完整時血液中的LPS含量較低，但是當腸黏膜出現(xiàn)損傷時，細菌會穿越腸黏膜進入血管，血清LPS水平上調(diào)[17]，通過檢測血清IL-1β和LPS水平，可在一定程度上反映動物腸道損傷情況。本試驗結果表明，微生態(tài)制劑組幼犬IL-1β和LPS水平與對照組相比無顯著差異，說明微生態(tài)制劑對健康幼犬IL-1β和LPS水平影響較低。Yu等[18]對30只BALB/c小鼠灌喂165 mg/kg?；撬?，發(fā)現(xiàn)小鼠血清LPS水平顯著下降，但本研究中比格犬血清LPS水平無顯著差異，可能與飼料劑量和物種存在關聯(lián)。IgG是血清中免疫球蛋白的主成分，具有抗病毒、中和病毒、抗菌及免疫調(diào)節(jié)的功能[19]。IgA分為血清型IgA和分泌型IgA，其水平可反映機體免疫能力的強弱，它可以維持腸道穩(wěn)態(tài)、調(diào)控腸道菌群等，對維持機體免疫系統(tǒng)的功能具有重要的意義[20]。在本試驗中，微生態(tài)制劑組幼犬IgG和IgA水平與對照組相比無顯著差異，說明微生態(tài)制劑對健康幼犬血清IgG和IgA水平影響較低。Rossi等[21]使用嗜熱鏈球菌DSM 32245(StreptococcusthermophilusDSM 32245)、 雙歧桿菌DSM 32246和嗜酸乳桿菌DSM 32241等益生菌混合制成的微生態(tài)制劑灌喂2～4歲的20只不同品種的健康犬，每日灌喂菌量4.0×1011CFU，結果顯示，灌喂微生態(tài)制劑組的糞便中IgA和血清IgG水平顯著增加，該報道與本試驗結果不一致，可能是因為本試驗中比格幼犬處于哺乳期，尚未進食商品化犬糧有關。相比于商品化犬糧，母乳中IgA和IgG含量較高[22-23]，影響了幼犬血清IgA和IgG水平。

3.4 微生態(tài)制劑對比格幼犬腸道菌群的影響

動物腸道內(nèi)棲息著數(shù)量巨大且種類龐大的微生物群，腸道菌群不僅通過營養(yǎng)吸收影響宿主，而且通過微生物代謝物的下游效應在宿主體內(nèi)發(fā)揮著重要作用[24]。腸道菌群對維護動物體胃腸道正常生理狀態(tài)、提高胃腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收起到不可替代的作用[25]，是動物體抵抗外界病原物質(zhì)損傷的重要腸道屏障。在屬水平上，Escherichia-Shigella多為條件致病菌，在一定條件下可以引起人和動物發(fā)生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染[26]。鏈球菌屬和梭菌屬的種間差異較大，需結合種水平變化進一步分析。霍爾德曼氏菌屬一般為腸道致病菌，可分解腸道黏液、增加腸道疼痛，同時提高其他細菌的感染風險，其含量偏低時有利于健康[27]。乳酸桿菌、片球菌為發(fā)酵糖類產(chǎn)乳酸的益生菌。 在種水平上，大腸桿菌和巴黎鏈球菌是動物腸道內(nèi)條件致病菌，在一定條件下可以引起人和動物的疾病[28]。產(chǎn)氣莢膜梭菌和犬大腸梭菌相對豐度顯著增高，致使梭菌屬相對豐度顯著增高，產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于環(huán)境、動物以及人的胃腸道中，是重要的條件致病菌[29]。Vagococcusteuberi首次分離于馬里地區(qū)的發(fā)酵牛奶中[30]。貝萊斯芽孢桿菌首次分離自咸水湖中，尚未發(fā)現(xiàn)有致病現(xiàn)象[31]。屎腸球菌是人及動物腸道中正常菌群的一部分，具有抑菌作用[32]。本試驗中，微生態(tài)制劑組比格幼犬糞便物種豐富度顯著增加，結合門、屬、種水平的物種構成發(fā)現(xiàn)，Escherichia-Shigella、霍爾德曼氏菌屬等多數(shù)條件致病菌相對豐度顯著降低，Vagococcusteuberi等產(chǎn)酸細菌相對豐度顯著增高。提示該微生態(tài)制劑對比格幼犬腸道菌群結構起到了一定優(yōu)化作用，說明該微生態(tài)制劑可以明顯改善腸道菌群結構，有益于哺乳期比格幼犬腸道菌群的建立，維護腸道健康。動物雙歧桿菌能夠在體外抑制大腸桿菌和李斯特菌等病原菌的生長[33]，且能黏附在腸道黏膜抑制黏液中鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等有害菌的含量。Rossi等[21]給試驗犬灌喂嗜熱鏈球菌DSM 32245、雙歧桿菌DSM 32246、嗜酸乳桿菌DSM 32241混合制成的微生態(tài)制劑后，試驗犬腸道菌群中乳酸桿菌、雙歧桿菌相對豐度顯著增加，產(chǎn)氣莢膜梭菌相對豐度顯著降低。 本試驗中，微生態(tài)制劑組乳酸桿菌相對豐度顯著增加，與上述報道結果一致，但微生態(tài)制劑組產(chǎn)氣莢膜梭菌相對豐度顯著提高，雙歧桿菌顯著降低，與上述報道結果不一致，其具體原理機制還待進一步探究。

4 結 論

復合微生態(tài)制劑可以促進幼齡比格幼犬體重增長，提高其血氧含量。菌群測序結果顯示，復合微生態(tài)制劑可顯著改變比格幼犬腸道菌群結構，提高腸道菌群物種相對豐度，優(yōu)化腸道菌群組成，從而維護腸道健康，表明該犬用復合微生態(tài)制劑是一種安全、有益的犬用營養(yǎng)補充劑。