復(fù)合益生菌對(duì)肉雞腸道微生物區(qū)系的影響

張利環(huán)，賈 浩，張若男，王燕飛，劉 璇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為在體內(nèi)定植達(dá)到一定數(shù)量時(shí)可使機(jī)體受益的活性微生物[1]，其中干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌與雙歧桿菌被統(tǒng)稱為“健康三益菌”，常用作食品添加劑[2]。研究表明，益生菌可以增加腸道中的有益菌，調(diào)節(jié)腸道健康[3]。益生菌代謝還是刺激上皮細(xì)胞增殖和分化的能源，通過刺激肽和緊密連接蛋白的產(chǎn)生來發(fā)揮抗菌作用，維持腸道屏障內(nèi)微生物穩(wěn)態(tài)[4]。在集約化的肉雞養(yǎng)殖中，腸道炎癥是導(dǎo)致肉雞生產(chǎn)性能下降甚至死亡的主要原因之一。腸道炎癥會(huì)促進(jìn)黏膜氧化應(yīng)激，引起腸道微環(huán)境變化，導(dǎo)致有益細(xì)菌種類數(shù)量減少，而致病菌種類相對(duì)增多[5]。雛雞腸道微生物的首要來源為蛋殼和飼料中的微生物群，剛孵化的雛雞補(bǔ)充益生菌后，盲腸會(huì)被兼性需氧菌定植，這些細(xì)菌可消耗腸道內(nèi)氧氣且產(chǎn)生大量有機(jī)酸，導(dǎo)致腸道pH變低，從而抑制致病菌的生長和定植，改善腸道炎癥[6-7]。研究表明，乳桿菌可增加肉雞腸道中乳酸菌和雙歧桿菌屬等有益菌，減少大腸桿菌等致病菌，改善宿主的腸道微生物組成，降低死亡率[8-10]。Hong等[11]研究表明，補(bǔ)充2.0×1010CFU/g芽孢桿菌可增加厚壁菌門豐度，促進(jìn)肉雞生長。張李榮等[12]研究發(fā)現(xiàn)，雛雞飼料中添加乳雙歧桿菌后，可通過改善盲腸微生物的組成結(jié)構(gòu)來提高生長性能。因此，可通過在雛雞飲食中添加適量益生菌來調(diào)控雛雞腸道微生物群的組成、降低致病菌的數(shù)量，改善其生長性能[13]。近年來研究顯示，干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌對(duì)肉雞生長有益，然而3種益生菌的混合物對(duì)肉雞腸道微生物群的影響尚不清楚。因此，本研究將幼齡黃麻肉雞作為研究對(duì)象，探討復(fù)合益生菌對(duì)肉雞生長性能及腸道微生物區(qū)系的影響，以期為復(fù)合益生菌在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物飼養(yǎng)

“健康三益菌”(干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳雙歧桿菌)凍干菌粉購自陜西瑞茂生物科技有限責(zé)任公司，按1∶1∶2的劑量比例配制成復(fù)合菌，有效活菌數(shù)>3.4×109CFU/g。將200只1日齡雄性黃麻肉雞隨機(jī)分為2組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。復(fù)合菌制劑按1%比例補(bǔ)充于益生菌組肉雞的飲用水中，以正常飲水的肉雞為對(duì)照?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。飼喂周期為42 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平

肉仔雞皆按規(guī)定接種疫苗，采用3層立籠式飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院動(dòng)物房，每天上午08:00和下午20:00定時(shí)飼喂，雞舍整潔且定期消毒，試驗(yàn)過程中雞舍內(nèi)保持24 h光照，確保肉雞正常采食和飲水。室溫從育雛第1周的33 ℃每日降低1 ℃，降至23℃結(jié)束。相對(duì)濕度第1周為65%～70%，之后降至60%左右保持不變。每天記錄各組肉雞的采食量。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 生產(chǎn)性能 飼喂結(jié)束前12 h，肉雞停止進(jìn)食，但可繼續(xù)自由飲水，各組肉雞以重復(fù)單位稱取體重。根據(jù)試驗(yàn)期間的記錄統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算肉雞的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。每個(gè)處理取40只42日齡肉雞屠宰，分別測定屠宰率和全凈膛率。

1.2.2 腸道菌群高通量測序 斷頸處死抽樣雞后解剖，無菌剪刀沿腹底部向上剖開腹腔，剪切下回腸與盲腸組織，使用無菌鑷子分別從回腸與盲腸中挑取中心內(nèi)容物于無菌離心管中(使用前用液氮預(yù)凍)，-80 ℃保存。

腸道內(nèi)容物樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在IlluminaMiSeqPE300系統(tǒng)上進(jìn)行高通量測序。原始的測序序列通過fastp(v 0.19.6)軟件進(jìn)行質(zhì)量過濾，通過FLASH(v 1.2.11)軟件進(jìn)行拼接。生成的序列通過USEARCH(v 7.0)軟件根據(jù)97%的相似度進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，并識(shí)別和移除嵌合體序列。 利用RDP classifier(v 11.5)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，使用置信閾值為70%的QIIME2(v 2020.11)平臺(tái)計(jì)算門-屬水平上微生物群落的相對(duì)豐度。以觀測到的OTU數(shù)為基礎(chǔ)，利用QIIME2算法進(jìn)行分類信息的注釋，通過7個(gè)指數(shù)(包括Sobs、Chao、Shannon、Simpson、Shannoneven、Pd和Coverage)分析樣本的物種豐富度、多樣性、均一性與覆蓋度，并利用QIIME2軟件計(jì)算Beta多樣性距離矩陣，基于Bray-Curtis距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM)，在OTU水平上比較各樣本微生物區(qū)系的組成，使用R語言(v 2.15.3)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。利用NetworkX軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，得到菌群在不同樣本中的共存關(guān)系，凸顯樣本之間的相似性和差異性，采用線性判別分析(LDA)對(duì)各組差異菌群進(jìn)行鑒定，以P<0.05和LDA=4用作LEfSe分析的閾值，并利用在線軟件(http:∥huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_upload)進(jìn)行非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。使用PICRUSt(v 1.1.0)軟件通過16S rDNA基因序列預(yù)測腸道菌群的功能組成概況，統(tǒng)計(jì)Level 3功能類別上的KEGG直系同源物。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，高通量測序數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)確定各處理間的差異。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合益生菌對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，益生菌組肉雞的平均日增重顯著增加(P<0.05)，平均日采食量、屠宰率和全凈膛率增加，料重比降低，但差異均不顯著(P>0.05)。

表2 各組肉雞生產(chǎn)性能

2.2 腸道菌群的Alpha多樣性

測序后通過高質(zhì)量篩選和去除冗余序列，共獲得1 303 882條高質(zhì)量序列，分屬于772個(gè)OTUs，459種，296屬，160科，98目，41綱，18門。每個(gè)樣本觀測到的OTU數(shù)目的稀釋曲線和Core分析均表明本次測序的測序量接近飽和，大部分多樣性已產(chǎn)生，即使增加測序量也很少會(huì)有新物種出現(xiàn)(圖1A、1B)。在回腸中，對(duì)照組的Sob、Chao、Shannon、Shannoneven、Pd和Simpson指數(shù)分別為154.00、196.51、2.06、0.41、16.54和0.28，益生菌組分別為123.38、171.70、1.43、0.29、12.21和0.44；在盲腸中，對(duì)照組分別為278.88、332.66、2.93、0.52、22.51和0.19，益生菌組分別為257.25、313.63、2.96、0.53、21.26和0.17。益生菌組較對(duì)照組腸道菌群多樣性有降低趨勢(P>0.05)。此外，盲腸的Sob、Chao、Shannon和Pd指數(shù)顯著或極顯著高于回腸(P<0.05；P<0.01)(圖1C～1H)。所測樣本的Coverage指數(shù)均高于0.99(圖1I)，表明本次測序覆蓋率高。

①A、B，分別為腸道微生物區(qū)系OTU水平的稀釋與核心曲線；C～I(xiàn)，分別為腸道微生物區(qū)系OTU水平的Sob、Chao、Shannon、Simpson、Shannoneven、Pd與Coverage指數(shù)。②CI、CC、PI、PC，分別為對(duì)照組回腸、對(duì)照組盲腸、益生菌組回腸與益生菌組盲腸。③*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。圖7同

2.3 腸道微生物群落的組成結(jié)構(gòu)

由圖2A可知，在對(duì)照組回腸中，厚壁菌門(Firmicutes,92.69%)豐度最高，其次是放線菌門(Actinobacteriota,5.73%)；在盲腸中，厚壁菌門(Firmicutes,97.51%)豐度最高，其次是擬桿菌門(Bacteroidota,2.06%)。與對(duì)照組相比，益生菌組回腸厚壁菌門的豐度(98.55%)增加，放線菌門的豐度(0.74%)降低；盲腸厚壁菌門的豐度(98.27%)增加，擬桿菌門的豐度(1.41%)降低。說明厚壁菌門在肉雞腸道菌群中具主體地位，復(fù)合益生菌可增加其豐度。

由圖2B可知，在對(duì)照組回腸中，乳桿菌屬(Lactobacillus,43.38%)、腸球菌屬(Enterococcus,19.05%)、分節(jié)絲狀菌屬(Candidatus_Arthromitus,8.06%)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia,4.82%)、葡葡萄球菌屬(Staphylococcus,4.77%)等為主要屬；在盲腸中，羅姆布茨菌屬(Romboutsia,28.54%)、未分類的毛螺菌科細(xì)菌(unclassified_f__Lachnospiraceae,20.64%)、布勞特氏菌屬(Blautia,12.21%)、罕見小球菌屬(Subdoligranulum,6.54%)等為主要屬。與對(duì)照組相比，益生菌組回腸中未見梭菌屬(Lachnoclostridium)，乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬和羅姆布茨菌屬的豐度(8.41%、45.51%和13.09%)增加，腸球菌屬、分節(jié)絲狀菌屬和葡葡萄球菌屬的豐度(18.94%、0.60%和0.93%)降低；益生菌組盲腸中羅姆布茨菌屬與罕見小球菌屬的豐度(28.23%、5.06%)降低，未分類的毛螺菌科與布勞特氏菌屬的豐度(26.71%、13.86%)增加。說明復(fù)合益生菌可降低腸道病原菌的豐度。

A、B，分別為在門和屬水平上的腸道微生物組成，豐度<1%的類群被納入“其他”類群

2.4 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異

由圖3可知，對(duì)照組與益生菌組的回腸、盲腸的共有OTUs數(shù)分別為99和197，在對(duì)照組回腸、對(duì)照組盲腸、益生菌組回腸、益生菌組盲腸中獨(dú)有OTUs數(shù)分別為127、42、10和14。益生菌組較對(duì)照組回腸、盲腸菌群的OTUs總數(shù)由469、488分別降低至327、466。共線性網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與益生菌組回腸中各有3個(gè)獨(dú)有的屬，包括g_Gilliamella、迪茨氏菌屬(Dietzia)、魏斯氏菌屬(Weissella)與乳球菌屬、雞桿菌屬(Gallibacterium)、g_unclassified_o__Lactobacillales；對(duì)照組與益生菌組盲腸中分別有9和5個(gè)獨(dú)有的屬，包括顫桿菌屬(Oscillibacter)、g__Colidextribacter、g__Negativibacillus等與g_Anaerostipes、g__Butyricicoccus、g_Eisenbergiella、g__Tuzzerella等(圖4)。

圖3 腸道微生物的OTU數(shù)目Venn圖

圖4 細(xì)菌群落中50個(gè)最豐富屬的共線性網(wǎng)絡(luò)分析

由圖5可知，第一主成分和第二主成分分別能解釋對(duì)照組與益生菌組總差異的42.46%和12.63%。在ANOSIM分析中發(fā)現(xiàn)，R值為0.5705，P<0.001，表明本試驗(yàn)分組有意義，組間差異顯著大于組內(nèi)差異。

圖5 OTU水平的PCoA分析

為確定各類群從門到屬水平上的特化類群特征，使用LEfSe方法對(duì)樣品中的所有有效序列進(jìn)行分析，在回腸中，共富集了2門、1綱、2目、3科、4屬(圖6A)，放線菌門、布勞特氏菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)在對(duì)照組回腸中富集，其中放線菌門的豐度最高；而厚壁菌門、乳球菌屬在益生菌組回腸中富集，其中乳球菌屬的豐度最高。在盲腸中，共富集了1目、2科、1屬，其相對(duì)豐度均在對(duì)照組盲腸中富集，其中顫螺旋菌目的豐度最高(圖6B)。

A、B，分別為對(duì)照組回腸與益生菌組回腸之間、對(duì)照組盲腸與益生菌組盲腸之間微生物類群和LDA得分的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

使用Wilcox秩和檢驗(yàn)評(píng)估LEfSe結(jié)果見圖7。由圖7可知，與對(duì)照組回腸相比，益生菌組回腸厚壁菌門、乳球菌屬的豐度顯著或極顯著增加(P<0.05;P<0.01)，放線菌門、葡萄球菌屬、布勞特氏菌屬及棒狀桿菌屬的豐度顯著或極顯著降低(P<0.05;P<0.01)；與對(duì)照組盲腸相比，益生菌組盲腸DTU089的豐度顯著降低(P<0.05)。

①A、B，門與屬水平下的對(duì)照組與益生菌組回腸間物種豐度的差異；C，屬水平下的對(duì)照組與益生菌組盲腸間物種豐度的差異。②X軸，某一物種在不同分組的平均相對(duì)豐度；Y軸，在特定分類級(jí)別下物種的名稱。③*,差異顯著(P<0.05);**,差異極顯著(P<0.01)

2.5 腸道微生物功能預(yù)測

基于肉雞腸道菌群COG代謝途徑的豐度分析，利用PICRUSt工具將肉雞腸道微生物劃分為23個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫功能類群(圖8)。其中E與G類(氨基酸和碳水化合物的運(yùn)輸和代謝)、J類(核糖體的結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生)、K與L類(復(fù)制、重組和修復(fù))是肉雞腸道的優(yōu)勢代謝功能。此外，統(tǒng)計(jì)分析表明，1個(gè)未知的功能S保持著最高的豐度。而基于肉雞腸道菌群KEGG途徑 (第3級(jí)) 的豐度分析表示，代謝途徑、不同環(huán)境中的微生物代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸的生物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、碳代謝與核糖體途徑的豐度在肉雞腸道中顯著富集(圖9)。

圖8 肉雞腸道菌群COG代謝途徑的豐度分析

圖9 肉雞腸道菌群KEGG(第3級(jí))途徑的豐度分析

3 討 論

腸道菌群是體內(nèi)最大、最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。多種共生微生物形成一個(gè)微生物屏障，保護(hù)腸道功能以調(diào)節(jié)能量代謝和吸收；微生物群介導(dǎo)的先天免疫防御可抑制侵入病原體的增殖，維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)[14]。宿主和腸道菌群在正常條件下處于動(dòng)態(tài)平衡，若平衡被破壞則會(huì)導(dǎo)致各種疾病發(fā)生。Rehman等[15]研究表明，可以通過飲食因素如飼料添加劑來恢復(fù)和重建腸道復(fù)雜的微生物群，提高禽類的生長性能。生態(tài)學(xué)理論表明，腸道微生物物種的豐富性與微生態(tài)的穩(wěn)定性有關(guān)。本研究表明，在42 d肉雞腸道中，復(fù)合益生菌可使腸道微生物區(qū)系的Alpha多樣性略為降低，這與Li等[16]研究結(jié)果一致，補(bǔ)充嗜酸乳桿菌可降低回腸微生物群的Shannon指數(shù)，恢復(fù)由壞死性腸炎破壞的肉雞的微生物群落組成。益生菌降低微生物群的多樣性指數(shù)可能是由于pH的降低為乳酸菌科這一優(yōu)勢菌群的增殖創(chuàng)造了良好的環(huán)境，限制了腸桿菌的生長[17]。 此外，本研究中對(duì)照組與益生菌組之間的細(xì)菌群落簇相互靠近，說明復(fù)合益生菌可以改善微生物群落結(jié)構(gòu)，且影響較小。

肉雞腸道有900種以上細(xì)菌，其中最豐富的是厚壁菌門、變形菌門與擬桿菌門[18]，本研究結(jié)果與其一致。健康動(dòng)物的腸道與菌群之間通過和諧的相互作用來保持生物穩(wěn)態(tài)，當(dāng)菌群的成分或功能失調(diào)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腸道和腸道外疾病[19]。變形菌門細(xì)菌(如霍亂弧菌、大腸桿菌與沙門氏菌等)在肉雞腸道定植會(huì)導(dǎo)致腸道感染。研究表明，乳桿菌復(fù)合菌可降低變形菌門數(shù)量并逆轉(zhuǎn)沙門氏菌感染[20-21]。本研究表明，復(fù)合益生菌可提高肉雞腸道內(nèi)厚壁菌門的豐度，降低放線菌門、擬桿菌門與變形菌門的豐度，改善腸道健康。厚壁菌門和擬桿菌門作為肉雞腸道中數(shù)量最多的兩個(gè)門，兩者的豐度之比(F/B)是衡量腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。在體重較高和料重比較低的肉雞糞便中F/B增加[22]。本研究中，復(fù)合益生菌影響腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)，可通過增加腸道內(nèi)F/B來促進(jìn)肉雞體重的增加，提高肉雞的生長性能。Chen等[23]研究表明，膳食中補(bǔ)充芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)品也有類似效應(yīng)，可改變能量收集、脂質(zhì)代謝及內(nèi)分泌功能，影響宿主代謝。 F/B的增加與肥胖有關(guān)，主要是由于厚壁菌門細(xì)菌獲取能量的能力較高[24]。

毛螺菌科和消化鏈球菌科家族是一種厭氧、芽孢形成的細(xì)菌，可以降解淀粉和非淀粉多糖，將復(fù)雜的多糖轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸[25-26]。由于家禽體內(nèi)缺乏消化非淀粉多糖的內(nèi)源性酶，因此限制了高纖維含量飼料的利用，而在本試驗(yàn)中，盲腸毛螺菌科的豐度增加，表明復(fù)合益生菌可增加盲腸發(fā)酵降解非淀粉多糖的能力，提高飼料利用率。梭菌屬細(xì)菌可引起腸道感染，如常見的彎曲桿菌病，會(huì)引起血液炎癥，導(dǎo)致腹瀉、痙攣和疼痛等[27]，而乳酸菌是肉雞消化道的優(yōu)勢細(xì)菌之一，可以產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和抗菌因子，限制腸道病原體的增殖，預(yù)防腸道感染和腹瀉。Lin等[28]研究表明，膳食中補(bǔ)充地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)品可抑制金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長，緩解肉雞壞死性腸炎，改善生長性能。Hossain等[29]和劉鳳美等[30]也指出，復(fù)合益生菌會(huì)引起腸道中乳酸桿菌增加，梭狀芽孢桿菌和大腸桿菌減少。本研究中也有相同的結(jié)論，復(fù)合益生菌可使回腸產(chǎn)生特有的乳球菌屬細(xì)菌，增加了乳桿菌屬的豐度，同時(shí)降低梭菌屬、腸球菌與葡萄球菌屬的豐度，改善腸道健康。益生菌可產(chǎn)生抗菌性環(huán)狀脂肽，通過破壞細(xì)菌膜來表現(xiàn)其抗病活性，益生菌這種衍生表面活性素的抗菌機(jī)制可能會(huì)導(dǎo)致肉雞形成獨(dú)特的微生物組[31]。綜上，復(fù)合益生菌可增加乳酸桿菌種類，降低病原菌的生存能力，改善腸道細(xì)菌平衡，還可通過促進(jìn)黏蛋白的產(chǎn)生來增強(qiáng)黏膜屏障，從而穩(wěn)定腸道菌群。盲腸是各種復(fù)雜微生物群的理想棲息地，在肉雞整個(gè)腸道中具有最豐富的代謝功能，而糖類運(yùn)輸途徑的豐度富集在回腸。本研究中復(fù)合益生菌可調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，但不會(huì)影響腸道多種代謝功能。

4 結(jié) 論

復(fù)合益生菌可通過增加肉雞回腸乳桿菌屬豐度、降低病原菌豐度來改善腸道菌群的組成、功能和多樣性；同時(shí)通過增加盲腸毛螺菌科豐度來提高盲腸發(fā)酵降解非淀粉多糖的能力，進(jìn)而提高飼料利用效率，促進(jìn)肉雞生長。