豬繁殖與呼吸綜合征病毒-脂多糖刺激對中性粒細(xì)胞黏附豬肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

王兆麗，楊思宇，吳艷梅，宋曉曉，穆 祥，張 濤

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cells，MVECs)是動物體內(nèi)的功能多樣性細(xì)胞[1]，是調(diào)控血液內(nèi)中性粒細(xì)胞(neutrophils，Neu)向炎癥組織募集的樞紐性結(jié)構(gòu)，Neu與MVECs的黏附及其跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移是Neu向炎癥組織募集的基礎(chǔ)[2]。研究MVECs與Neu黏附及其調(diào)控機(jī)制對闡明MVECs在相關(guān)疾病中的作用具有重要意義，可為有效發(fā)揮Neu的防御功能及控制其組織損傷作用提供試驗(yàn)依據(jù)。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染仔豬常引起肺臟的彌漫性間質(zhì)炎癥，混合感染或繼發(fā)感染細(xì)菌等病原微生物時(shí)，患豬的臨床癥狀和肺臟病變更顯著，易發(fā)生急性肺損傷而引起患豬死亡[3-4]。研究表明，Neu在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，遷移到肺臟組織的Neu可通過氧化和非氧化機(jī)制及釋放胞外誘捕網(wǎng)對病原體起到殺滅和清除作用[5]，而其過度積累和激活又是急性肺損傷的主要病理特征[6]。MVECs損傷是誘發(fā)急性肺損傷的病理基礎(chǔ)，這已在流感病毒[7]、禽流感病毒[8]和2019新型冠狀病毒[9]的致病機(jī)制中得到證明。也有研究顯示，PRRSV感染可顯著增加豬肺泡灌洗液中Neu的數(shù)量[10-11]。然而，MVECs在其中的作用鮮見報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)體外分離培養(yǎng)豬肺MVECs及豬外周血Neu，檢測PRRSV聯(lián)合脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激時(shí)，Neu與MVECs黏附的數(shù)量變化，旨在了解MVECs在PRRSV單獨(dú)和繼發(fā)細(xì)菌感染時(shí)肺臟募集Neu過程中的作用，以期為闡明PRRSV的致病機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PRRSV毒株及試驗(yàn)動物

PRRSV HN株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所惠贈，在Marc-145細(xì)胞上連續(xù)復(fù)壯3次后，收取病毒，測定其TCID50后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。仔豬購自北京市SPF豬育種管理中心。

1.2 主要試劑及儀器

Ⅱ型膠原酶(LS004176)購自Worthington公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(H2387)和胎牛血清(10099-141)均購自Gibco公司；D-Hank’s(H1040)、RPMI 1640培養(yǎng)基(31800)、豬外周血中性粒細(xì)胞分離液試劑盒(P4140)、脂多糖(L8880)和虎紅鈉鹽(G8540)均購自北京索萊寶科技有限公司；瑞士染色液(C0135)和免疫染色封閉液(P0102)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；E-選擇素抗體(bs-1273R)、P-選擇素抗體(bs-0561R)、CD34抗體(bs-0646R)、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(bs-0295G-HRP)及DAB染色試劑盒(C02-04001)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

倒置熒光數(shù)碼顯微鏡(IX71)購自O(shè)lympus公司；多功能酶標(biāo)儀(Synergy 4)購自Biotek公司；二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-17AC)購自Sanyo公司。

1.3 豬外周血Neu的分離

臨床健康豬血采自北京市某屠宰場，加入35 U/L肝素溶液抗凝，參照姜代勛等[12]相關(guān)方法，于黏附試驗(yàn)前1 d分離、提取豬外周血Neu，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL，于37 ℃孵育、備用。

1.4 MVECs分離培養(yǎng)

參照Li等[13]方法分離培養(yǎng)MVECs，即仔豬按0.1 mL/kg BW注射速眠新Ⅱ注射液麻醉，無菌剖開胸腔取出肺臟，用預(yù)冷的D-Hank’s液洗去血污，剪取肺臟邊緣組織，撕去被膜并剪碎，置于37 ℃ 0.2% Ⅱ型膠原酶溶液消化約60 min，至吹打后無大塊肺臟組織，將消化液過孔徑75 μm細(xì)胞篩，濾液1 000 r/min離心5 min，將沉淀重懸于含1%雙抗、20%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/mL后接種于培養(yǎng)板，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，洗去未貼壁細(xì)胞，更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至亞匯合狀態(tài)，用0.05%胰蛋白酶-0.005% EDTA溶液消化脫壁后傳代培養(yǎng)，并采用CD34免疫熒光染色法鑒定。

1.5 Neu與MVECs黏附試驗(yàn)

Neu與MVECs黏附試驗(yàn)分2次，分別檢測PRRSV處理和PRRSV-LPS聯(lián)合處理對其影響。將MVECs接種于24孔板，生長至亞匯合狀態(tài)，每孔更換為0.45 mL含2%胎牛血清的維持培養(yǎng)基，孵育過夜后，按照表1、2進(jìn)行分組處理，每組3孔重復(fù)。

表1 PRRSV刺激對Neu黏附MVECs影響試驗(yàn)的分組與處理

PRRSV處理試驗(yàn)孵育培養(yǎng)18 h，或PRRSV-LPS聯(lián)合處理試驗(yàn)繼續(xù)孵育培養(yǎng)6 h，吸棄MVECs培養(yǎng)基，每孔加入0.2 mL相應(yīng)處理的Neu，孵育1 h，PBS溶液洗去未黏附細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min，瑞氏染色后觀察，拍照分析。

表2 PRRSV-LPS聯(lián)合刺激對Neu黏附MVECs影響試驗(yàn)的分組及處理

1.6 選擇素表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色

為了解MVECs表達(dá)選擇素的特點(diǎn)，試驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測E-選擇素和P-選擇素的表達(dá)。將MVECs細(xì)胞接種于預(yù)置有圓形蓋玻片的培養(yǎng)板，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛溶液室溫固定30 min。試驗(yàn)分為3組：陰性對照組、P-選擇素組和E-選擇素組，每組3個(gè)重復(fù)，陰性對照組將選擇素抗體替換為PBS溶液，常規(guī)方法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡觀察、拍照分析。

1.7 Neu與MVECs黏附中選擇素的作用

為進(jìn)一步研究選擇素在PRRSV-LPS刺激Neu黏附MVECs過程中的作用，本試驗(yàn)檢測了E-選擇素和P-選擇素的影響。將MVECs接種于96孔培養(yǎng)板孵育培養(yǎng)，生長至匯合后加入0.18 mL維持培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，分組與各時(shí)間點(diǎn)處理見表3，每組3個(gè)重復(fù)，孵育1 h。吸棄MVECs培養(yǎng)基，每孔加入0.1 mL相應(yīng)處理的Neu，再孵育1 h，PBS溶液洗去未黏附細(xì)胞，每孔加入0.25%虎紅溶液0.1 mL，室溫靜置10 min，PBS洗去游離虎紅，每孔加0.2 mL乙醇-PBS溶液(1∶1)，室溫靜置1 h，用酶標(biāo)儀測定D570 nm值。

表3 選擇素對PRRSV-LPS致Neu黏附MVECs影響試驗(yàn)的分組及處理

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

Neu黏附試驗(yàn)每組隨機(jī)選擇3～5個(gè)視野拍照，分別對黏附的Neu數(shù)量計(jì)數(shù)；選擇素在Neu黏附MVECs中的作用試驗(yàn)，計(jì)數(shù)各重復(fù)孔虎紅染色后酶標(biāo)儀測定的D570 nm值。 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均利用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及后續(xù)Tukey檢驗(yàn)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 MVECs體外生長特征

體外分離培養(yǎng)的MVECs顯微鏡下折光性良好，呈不規(guī)則多角形，胞質(zhì)豐富，一般有2個(gè)以上長突起，傳代培養(yǎng)約3～5 d生長至匯合狀態(tài)(圖1A)；CD34免疫熒光染色結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)物呈陽性著色，陽性細(xì)胞比率約為92%(圖1B)。

A，顯微形態(tài)；B，CD34免疫熒光陽性著色

2.2 PRRSV處理對Neu黏附MVECs的影響

由圖2可知，正常情況下，Neu與MVECs僅有少量黏附；PRRSV HN株處理Neu和MVECs其中1種或2種細(xì)胞時(shí)，黏附MVECs的Neu數(shù)量均有增加；由圖3可知，與正常對照組相比，Neu處理組與雙處理組的黏附細(xì)胞數(shù)量分別顯著和極顯著增加(P<0.05;P<0.01)，MVECs處理組無顯著差異(P>0.05)。

A，正常對照組；B，MVECs處理組；C，Neu處理組；D，雙處理組。圖3同

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 PRRSV-LPS聯(lián)合刺激對Neu黏附MVECs的影響

由圖4可知，與LPS直接刺激相比，PRRSV HN株預(yù)先處理MVECs和/或Neu，然后再用LPS刺激時(shí)，Neu黏附數(shù)量均有不同程度增加；由圖5可知，雙處理組與LPS對照組有顯著差異(P<0.05)，而MVECs處理組和Neu處理組與LPS對照組均無顯著差異(P>0.05)。

A，LPS對照組，B，MVECs處理組，C，Neu處理組，D，雙處理組。圖5同

圖5 PRRSV-LPS聯(lián)合處理時(shí)黏附MVECs的Neu計(jì)數(shù)結(jié)果

2.4 MVECs表達(dá)選擇素特點(diǎn)

MVECs免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，E-選擇素和P-選擇素均呈陽性著色，著色部位在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，陽性細(xì)胞率約為100%；陰性對照組以PBS替代選擇素抗體時(shí)，未見明顯陽性著色(圖6)。

A，E-選擇素組；B，P-選擇素組；C，陰性對照組

2.5 選擇素對PRRSV-LPS致Neu黏附MVECs的影響

由圖7可知，PRRSV HN株單獨(dú)處理和PRRSV-LPS共同處理時(shí)，Neu黏附數(shù)量顯著或極顯著增加(P<0.05；P<0.01)；而E-選擇素和P-選擇素抗體封閉后，Neu黏附數(shù)量均有一定下降，但仍高于正常對照組，方差分析顯示，E-選擇素封閉時(shí)，2種處理組的Neu黏附數(shù)量下降均有顯著差異(P<0.05)，而P-選擇素封閉時(shí)，均無顯著差異(P>0.05)。

A,正常對照組；B,PRRSV組；C，PRRSV-E組；D，PRRSV-P組；E，PRRSV-LPS組；F，PRRSV-LPS-E組；G，PRRSV-LPS-P組

3 討 論

Neu和巨噬細(xì)胞是參與急性肺損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞[14]，MVECs在Neu等向組織器官募集和遷移時(shí)起著“看門人”的角色。鑒于炎癥反應(yīng)是PRRSV感染誘導(dǎo)急性肺損傷時(shí)的典型病理變化，本試驗(yàn)旨在明確PRRSV及聯(lián)合LPS刺激時(shí)Neu與MVECs黏附的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRRSV HN株顯著增加Neu黏附于MVECs的數(shù)量，并提高后繼LPS刺激所致Neu與MVECs的黏附數(shù)量。PRRSV HN株對Neu黏附于MVECs的促進(jìn)作用，為Neu在肺臟組織的大量募集奠定了基礎(chǔ)，這在一定程度上解釋了前述報(bào)道PRRSV感染豬肺泡灌洗液Neu數(shù)量增加的原因，此結(jié)果與流感病毒[15]、2019新型冠狀病毒[16]等感染時(shí)Neu在肺臟的募集相似。

由于PRRSV感染豬常繼發(fā)細(xì)菌感染，故本試驗(yàn)研究了PRRSV HN株處理后，再以LPS刺激時(shí)Neu的黏附情況，結(jié)果顯示，LPS單獨(dú)刺激時(shí)Neu與MVECs的黏附顯著增加，與朱雯宇等[17]研究結(jié)果相似。值得注意的是，PRRSV處理后再用LPS刺激時(shí)，Neu的黏附數(shù)量顯著高于LPS單獨(dú)刺激時(shí)，這提示PRRSV繼發(fā)細(xì)菌感染時(shí)，Neu在豬肺臟的募集數(shù)量可能會多于單獨(dú)細(xì)菌感染。而據(jù)Labarque等[18]報(bào)道，無論有無PRRSV感染，LPS刺激時(shí)仔豬肺臟Neu的浸潤數(shù)量相似，但該研究未關(guān)注Neu與MVECs黏附，亦未深入研究感染不同時(shí)間點(diǎn)Neu黏附數(shù)量的動態(tài)變化。Labarque等[18]及van Gucht等[19]研究報(bào)道均認(rèn)為，PRRSV-LPS共同刺激時(shí)，豬肺臟組織的炎性病變和損傷均更為嚴(yán)重。Neu作為非特異性免疫細(xì)胞，適度募集對抵御外來病原體具有一定作用，而過度募集或清除障礙則會導(dǎo)致組織損傷。PRRSV促進(jìn)后繼LPS刺激時(shí)Neu黏附MVECs數(shù)量的結(jié)果也提示，這可能是PRRSV繼發(fā)細(xì)菌感染時(shí)患豬肺組織損傷等病理反應(yīng)更為嚴(yán)重的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，MVECs感染PRRSV約72 h才能在細(xì)胞內(nèi)檢測到病毒核酸的顯著擴(kuò)增，感染約5 d時(shí)才出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)[13]。本試驗(yàn)側(cè)重于PRRSV感染后MVECs早期功能變化，選擇了感染時(shí)間為18 h。研究結(jié)果顯示，PRRSV單獨(dú)感染MVECs時(shí)，Neu黏附數(shù)量的增加無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，PRRSV作用于Neu或MVECs后再給予LPS刺激時(shí)，Neu黏附數(shù)量的增加與LPS單獨(dú)刺激亦無顯著差異，其原因可能與PRRSV HN株的作用時(shí)間有一定關(guān)系。另一方面，PRRSV只感染MVECs時(shí)，正常Neu的黏附數(shù)量亦有一定程度增加，這提示MVECs在其中有潛在的調(diào)控作用。

白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附主要由選擇素介導(dǎo)，其成員主要有L-、E-和P-選擇素3種[20]。L-選擇素主要表達(dá)于白細(xì)胞表面，血管內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)另外2種選擇素[21]。本研究結(jié)果表明，E-選擇素和P-選擇素在豬肺MVECs均呈陽性表達(dá)，在PRRSV誘導(dǎo)的Neu黏附中均有一定作用，但E-選擇素的作用更為顯著，這與選擇素在Neu黏附豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中的作用特點(diǎn)相似[22]。Neu滲出是多種類型黏附分子參與調(diào)控的一系列過程，黏附后的激活和滲出主要由MVECs表達(dá)的整合素和VCAM-1、ICAM-1等介導(dǎo)。Liu等[23]研究認(rèn)為，PRRSV誘導(dǎo)的Neu滲出有ICAM-1依賴和非ICAM-1依賴模式。所以，MVECs在PRRSV感染誘導(dǎo)的Neu跨內(nèi)皮遷移中黏附后階段的作用，有待進(jìn)一步深入研究。鑒于MVECs在病毒感染中的關(guān)鍵作用[24]，通過調(diào)控MVECs對選擇素的表達(dá)，在Neu跨內(nèi)皮遷移的早期黏附階段予以干預(yù)，對抑制PRRSV感染誘導(dǎo)的炎性損傷應(yīng)具有潛在的意義。

4 結(jié) 論

PRRSV HN株處理能顯著促進(jìn)Neu黏附MVECs，亦能顯著提高后繼LPS刺激時(shí)Neu黏附數(shù)量；MVECs能表達(dá)E-選擇素和P-選擇素，尤以E-選擇素在MVECs介導(dǎo)PRRSV HN株誘導(dǎo)Neu黏附增加中具有重要作用。本研究為PRRSV感染促進(jìn)Neu在豬肺組織的募集提供了佐證，表明MVECs在PRRSV感染中具有重要作用。