絞股藍(lán)多糖對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠肝臟抗氧化能力的影響

張潤(rùn)祥，白玉婷，張穎蕾，劉可可，王欣雨，董胤余，王曉麗

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005)

衰老是細(xì)胞甚至機(jī)體功能逐漸衰退的結(jié)果，可由氧化應(yīng)激等多種因素觸發(fā)[1]。研究證實(shí)，使用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)誘導(dǎo)的小鼠會(huì)有自然衰老的癥狀，可加速活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生并導(dǎo)致氧化應(yīng)激[2-3]。超量的ROS會(huì)損傷DNA、蛋白質(zhì)和磷脂的結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起生理功能受損、發(fā)病率增加和壽命縮短，這種由ROS引起的氧化損傷和不可逆的累積是影響衰老過程的關(guān)鍵因素[4-5]。肝臟是機(jī)體最主要的解毒器官，是多個(gè)生理過程的關(guān)鍵樞紐，也是產(chǎn)生超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等多種抗氧化酶的場(chǎng)所，因此肝臟是特別容易受到氧化應(yīng)激影響的器官之一[6-7]。

近年來，隨著中草藥多糖研究的開展，關(guān)于多糖抗衰老的探究也逐步深入。 絞股藍(lán)多糖(Gynostemmapentaphyllumpolysaccharides，GPP)是絞股藍(lán)的有效成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂及抗腫瘤等多種藥理活性[8-10]。目前，國(guó)內(nèi)外鮮見有關(guān)GPP對(duì)D-gal致衰小鼠，尤其是對(duì)D-gal 致衰小鼠肝臟保護(hù)影響的報(bào)道。為此，本研究以D-gal建立衰老模型，采用多種方法探究不同劑量GPP對(duì)D-gal致衰老小鼠肝臟的抗氧化能力，以期為絞股藍(lán)及GPP的進(jìn)一步研究與開發(fā)利用提供新的方向與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與樣品采集

60只4周齡SPF級(jí)昆明小鼠(許可證編號(hào)：SYXK桂2014-0001)，體重(20±1)g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中飼養(yǎng)，每籠5只。小鼠隨機(jī)分為6組(雌雄各半)：空白對(duì)照組(Control)、模型組(D-gal)、陽(yáng)性對(duì)照組(Vc)及絞股藍(lán)多糖低、中、高劑量組(GPP-L、GPP-M和GPP-H)，每組10只。空白對(duì)照組每天在頸背部皮下注射和腹腔注射生理鹽水；其余5組除每天頸背部皮下注射200 mg/kgD-gal外，腹腔注射依次為生理鹽水、Vc(200 mg/kg)、GPP(50、100和200 mg/kg)，42 d后稱重記錄，禁食，次日眼眶取血，處死后收集肝臟，部分組織置于Bouin氏固定液用于切片制作，其余組織液氮凍存，之后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 GPP提取與糖含量測(cè)定

絞股藍(lán)購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。經(jīng)洗凈、烘干、粉碎后3 cm過篩加工，避光干燥保存。采用水提醇沉法提取GPP，苯酚硫酸法測(cè)定GPP含量為71.1%。

1.3 體重與臟器系數(shù)測(cè)定

試驗(yàn)開始后，分別在1、7、14、21、28、35和42 d稱重并記錄。小鼠處死后，摘取肝臟生理鹽水清洗，濾紙吸干表面水分后稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。

臟器系數(shù)(%)=臟器重量(mg)/體重(g)×100%

1.4 血清總抗氧化能力檢測(cè)

各組小鼠眼眶取血后，置于EP管4 ℃靜置2 h，待血液凝固后，冷凍離心機(jī)3 500 r/min離心15 min，取上清液分裝,于-80 ℃保存。 參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書，采用酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)檢測(cè)血清總抗氧化能力(T-AOC)水平。

1.5 肝組織各指標(biāo)檢測(cè)

凍存肝臟組織解凍后，取部分樣品按1∶9(W/V)的比例預(yù)加冷生理鹽水，組織勻漿后離心取上清液，參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測(cè)SOD、GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量；取部分樣品加入適量PBS，勻漿后3 000 r/min離心20 min，取上清液按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測(cè)ROS含量。

1.6 石蠟切片與HE染色

肝臟組織固定后，修整、沖洗，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚7 μm，于37～40 ℃水浴鍋內(nèi)撈片，38 ℃烘箱內(nèi)拷片。常規(guī)HE染色，中性樹脂封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件處理，圖片應(yīng)用Image J軟件分析；組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GPP對(duì)D-gal致衰老小鼠體重的影響

用藥開始后，每周稱量小鼠體重并記錄，經(jīng)計(jì)算得出小鼠體重和增重的變化情況，結(jié)果見表1、2。由表1可知，隨日齡增長(zhǎng)各組小鼠體重均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，7、21、28和35 d時(shí)GPP-M組小鼠體重顯著低于D-gal和GPP-H組(P<0.05)；42 d時(shí)GPP-M組小鼠體重顯著低于GPP-H組(P<0.05)，但與其他試驗(yàn)組間差異均不顯著(P>0.05)。

表1 各組小鼠體重(n=10)

由表2可知，空白對(duì)照、D-gal、Vc、GPP-M和GPP-H組小鼠增重在29～35 d時(shí)達(dá)到最低，隨后出現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，而GPP-L組在22～28 d時(shí)先降低，經(jīng)過29～35 d小幅度上升后再次出現(xiàn)下降趨勢(shì)；1～7 d時(shí)，GPP-M組小鼠增重顯著低于D-gal組(P<0.05)；15～21 d時(shí)，GPP-M組小鼠增重低于D-gal組，顯著低于GPP-H組(P<0.05)；29～35 d時(shí)，GPP-M組增重顯著低于GPP-L組(P<0.05)。 綜合來看，1～42 d GPP-M組小鼠增重最少。

表2 各組小鼠增重的變化(n=10)

2.2 GPP對(duì)D-gal致衰老小鼠肝臟指數(shù)及血清T-AOC的影響

由表3可知，GPP各劑量組肝臟指數(shù)均高于D-gal組，其中GPP-H組小鼠肝臟指數(shù)顯著高于D-gal 組(P<0.05)，與Vc和空白對(duì)照組相比均無顯著性差異(P>0.05)；不同劑量GPP組血清T-AOC活性與D-gal組相比均有所增強(qiáng)，且小鼠血清T-AOC活性隨GPP濃度的升高而增強(qiáng)，其中GPP-H組小鼠血清T-AOC活性最高，與D-gal組相比差異顯著(P<0.05)。

表3 衰老小鼠肝臟指數(shù)及血清中T-AOC水平

2.3 GPP對(duì)D-gal致衰老小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活性和ROS、MDA含量的影響

由表4可知，GPP各劑量組的小鼠肝臟組織SOD活性與D-gal組相比均無顯著差異(P>0.05)；不同劑量GPP處理后的小鼠肝臟中GSH-Px、CAT活性與D-gal組相比均有所增強(qiáng)，其中GPP-M組小鼠肝臟中GSH-Px活性顯著高于D-gal組(P<0.05)，GPP-L組小鼠肝臟中CAT活性顯著高于D-gal 組(P<0.05)，與Vc和空白對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05)，3個(gè)劑量組間均無顯著差異(P>0.05)；不同劑量GPP處理后的小鼠肝臟組織中ROS、MDA含量與D-gal組相比均顯著下降(P<0.05)，其中GPP-L組小鼠肝臟組織中的ROS含量顯著低于GPP-M和GPP-H組(P<0.05)，且與Vc和空白對(duì)照組相比均有顯著差異(P<0.05)，GPP-L和GPP-H組肝臟中MDA含量與GPP-M組相比下降明顯，但3個(gè)GPP劑量組間差異均不顯著(P>0.05)。

表4 衰老小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活性及ROS、MDA含量

2.4 GPP對(duì)D-gal致衰老小鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

各組小鼠肝臟經(jīng)HE染色后，觀察肝臟組織形態(tài)，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常(圖1A)，中央靜脈無任何異常，肝索有規(guī)律的整齊排列，肝血竇無擴(kuò)張；D-gal組小鼠肝細(xì)胞變大(圖1B)，胞漿嗜酸性增強(qiáng)，胞核增大，染色增強(qiáng)，且出現(xiàn)明顯的雙核肝細(xì)胞，肝細(xì)胞之間連接松散，部分肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見小的脂肪顆粒，肝血竇擴(kuò)張明顯；而經(jīng)過Vc處理的小鼠肝細(xì)胞索排列整齊緊密(圖1C)，少量肝細(xì)胞可見雙核，與D-gal組相比出現(xiàn)脂肪顆粒的肝細(xì)胞減少；GPP-L組肝血竇擴(kuò)張明顯(圖1D)，雙核肝細(xì)胞較多，肝細(xì)胞連接松散；GPP-M組肝血竇縮小(圖1E)，肝細(xì)胞索排列較整齊緊密，部分肝細(xì)胞可見雙核；GPP-H組與D-gal組相比肝血竇縮小(圖1F)，肝細(xì)胞連接緊密，存在脂肪顆粒的肝細(xì)胞明顯減少。

①A，空白對(duì)照組；B，D-gal組；C，Vc組；D，GPP-L組；E，GPP-M組；F，GPP-H組。②HC，肝細(xì)胞；BH，雙核肝細(xì)胞；HS，肝血竇；FP，脂肪顆粒；CV，中央靜脈

隨機(jī)選取每組小鼠肝臟切片3張，每張隨機(jī)選擇3個(gè)視野，運(yùn)用Image J軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。由表5可知，經(jīng)GPP-H處理的小鼠肝臟肝索面積占比與D-gal組相比有所增加，與空白對(duì)照和Vc組相比占比相當(dāng)，差異不顯著(P>0.05)；GPP-M和GPP-H組小鼠肝臟肝索面積占比顯著高于GPP-L組(P<0.05)。

表5 小鼠肝臟組織切片中肝索面積占比

3 討 論

3.1 D-gal衰老模型的建立

動(dòng)物衰老模型是研究衰老及其機(jī)理以及抗衰老相關(guān)藥物等的前提和基礎(chǔ)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中，有D-gal衰老模型、β-淀粉樣蛋白衰老模型、氯化鋁衰老模型、臭氧損傷衰老模型、γ-射線輻射衰老模型、胸腺摘除致衰老模型及各種轉(zhuǎn)基因衰老模型[11]。其中D-gal誘導(dǎo)的衰老以其操作簡(jiǎn)單、成本低廉、周期短等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于制備衰老模型。D-gal是一種天然存在于人體內(nèi)的正常營(yíng)養(yǎng)素，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)D-gal濃度過高，無法被半乳糖氧化酶催化生成醛糖和過氧化氫時(shí)會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子，氧化產(chǎn)生大量自由基，超出機(jī)體清除能力，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化；同時(shí)，最終分解產(chǎn)物可直接或間接與蛋白質(zhì)、核酸、磷脂等物質(zhì)結(jié)合，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而導(dǎo)致重要器官代謝紊亂，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老[12-14]。張?chǎng)蔚萚15]用D-gal誘導(dǎo)小鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞成功建立了衰老模型；張常娥等[16]用D-gal皮下注射8周，復(fù)制出與24月齡老年大鼠自然衰老程度相似的亞急性衰老模型。因此，本研究選擇D-gal致衰老模型來研究GPP對(duì)致衰老小鼠肝臟的保護(hù)作用。

3.2 GPP對(duì)D-gal致衰老小鼠體重、肝臟指數(shù)和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

小鼠的體重增長(zhǎng)是反映各組小鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況的一個(gè)重要指標(biāo)，而臟器指數(shù)的變化又可以體現(xiàn)出細(xì)胞衰老程度。葛水蓮等[17]、陳興浩等[18]研究發(fā)現(xiàn)，衰老模型組小鼠臟器指數(shù)顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)，D-gal組小鼠肝臟指數(shù)低于其他各組，且顯著低于GPP-H組，表明GPP改善了肝臟的衰老程度；各組小鼠體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，D-gal組小鼠1～14 d增重高于其他各組，推測(cè)可能是由于致衰早期代謝物質(zhì)在體內(nèi)累積造成的，15～42 d增重低于GPP組，可能是由于GPP保護(hù)了致衰導(dǎo)致的臟器功能，促進(jìn)了機(jī)體代謝和物質(zhì)吸收。

肝細(xì)胞是肝臟的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，不僅可以調(diào)節(jié)碳水化合物、脂肪酸的代謝以及合成白蛋白、脂蛋白和膽固醇等物質(zhì)，還可以促進(jìn)藥物和外源性物質(zhì)代謝等[19]。此外，肝細(xì)胞還可以釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，以此來控制肝臟的生長(zhǎng)和修復(fù)[20]。隨著年齡的增長(zhǎng)，肝細(xì)胞基因組逐漸出現(xiàn)不穩(wěn)定，肝細(xì)胞數(shù)量減少，多核肝細(xì)胞數(shù)量增加，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物積累和核DNA損傷[21]，衰老相關(guān)的信號(hào)通路如p16、p21和p53失調(diào)[22]。本研究從形態(tài)學(xué)角度發(fā)現(xiàn)，GPP可以改善由D-gal致衰導(dǎo)致的肝血竇變寬、雙核細(xì)胞增多、肝索面積減少、肝細(xì)胞內(nèi)脂肪顆粒增多等，表明GPP可以恢復(fù)致衰小鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)，保證其功能的完整性。

3.3 GPP對(duì)D-gal致衰老小鼠血清T-AOC的影響

正常情況下，氧自由基和抗氧化防御系統(tǒng)在機(jī)體內(nèi)是動(dòng)態(tài)平衡的。當(dāng)異常情況發(fā)生時(shí)，由于機(jī)體防御自由基的系統(tǒng)失衡，致使各種酶活性降低、免疫功能下降等，從而導(dǎo)致機(jī)體的衰老和死亡。T-AOC可以反映出機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)自由基的總體抵抗能力。陳玉興等[23]、陳英等[24]研究發(fā)現(xiàn)，益智湯、石榴汁、小麥胚活性肽均可以提高衰老小鼠血清中T-AOC活性；趙蓮芳等[25]指出，黃芪多糖可以提高衰老小鼠血清和肝臟中T-AOC活性。本研究發(fā)現(xiàn)，GPP各劑量組也能使衰老小鼠血清T-AOC水平上升，表明GPP可以提高衰老小鼠對(duì)自由基過氧化的總體抵抗能力。

3.4 GPP對(duì)D-gal致衰老小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT、ROS和MDA的影響

SOD可以清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基，從而能夠使細(xì)胞生物膜免受損傷，起到抗氧化作用。陳興浩等[18]研究發(fā)現(xiàn)，D-gal致衰老小鼠體內(nèi)SOD活性大大降低，而牛乳清粉可以提高D-gal致衰小鼠SOD活性；汪群紅等[26]研究發(fā)現(xiàn)，西紅花可以很好地提升衰老大鼠SOD活性。本研究發(fā)現(xiàn)，GPP-M組能夠提升衰老小鼠肝組織中SOD活性，提示GPP能夠保護(hù)機(jī)體細(xì)胞膜，從而提高了衰老小鼠的抗氧化能力。

GSH-Px能夠?qū)⑦^氧化物和還原性谷胱甘肽催化還原，保護(hù)細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)和功能上的完整，從而達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的目的。武錚等[27]研究發(fā)現(xiàn)，D-gal致衰老小鼠腦內(nèi)的GSH-Px活性大大下降，而當(dāng)歸多糖可以明顯提高腦內(nèi)GSH-Px活性；馮沼潤(rùn)[28]研究發(fā)現(xiàn)，天葵子可以改善D-gal致衰老小鼠血清和肝臟的GSH-Px活性。本研究發(fā)現(xiàn)，GPP可以很好地提高衰老小鼠肝臟的GSH-Px活性，表明GPP能夠保護(hù)和維持機(jī)體生物膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而提高了衰老小鼠肝臟的抗氧化能力。

CAT的主要功能就是清除H2O2，抑制活性極強(qiáng)的羥自由基的生成，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體不受到羥自由基氧化損傷的作用。Lu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，衰老小鼠CAT活性明顯降低，而烏索酸可以提高D-gal致衰老小鼠的CAT活性，起到神經(jīng)保護(hù)作用；顏燕等[29]研究指出，絞股藍(lán)、山楂提取物可以提高D-gal致衰老小鼠肝臟的CAT活性。本研究發(fā)現(xiàn)，GPP也可以提高衰老小鼠肝臟的CAT活性，說明GPP可以增強(qiáng)衰老小鼠肝臟清除H2O2的能力，從而提高了衰老小鼠肝臟的抗氧化能力。

ROS是伴隨體內(nèi)氧化過程產(chǎn)生的，如果超出了機(jī)體的清除能力，將會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化；同時(shí)，這些最終分解產(chǎn)物可直接或間接與蛋白質(zhì)、核酸、磷脂和其他物質(zhì)結(jié)合，破壞細(xì)胞內(nèi)生命物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致重要器官代謝的紊亂，使得機(jī)體衰老[30]。唐漢慶等[31]研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛可以很好地降低小鼠體內(nèi)ROS含量，提高其抗氧化能力；張秀麗[32]研究發(fā)現(xiàn)，梓醇可以降低腦中ROS含量，很好地保護(hù)衰老小鼠的神經(jīng)細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，GPP各劑量組均可以降低致衰老小鼠肝臟中ROS含量，表明GPP可以通過降低ROS含量提高其抗氧化能力，延緩衰老。

MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，而機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平便是由MDA含量的多少?zèng)Q定的[18]。MDA與蛋白質(zhì)、核酸等交聯(lián)物具有異常的氫鍵，經(jīng)溶酶體吞噬后不會(huì)被溶解消化，反而儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)成為脂褐素，而脂褐素的大量堆積會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，從而造成細(xì)胞的死亡。同時(shí)MDA作為細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，可以反映機(jī)體內(nèi)的氧化程度。葛水蓮[17]指出，經(jīng)太行菊黃酮處理的D-gal致衰老小鼠肝臟、腦等組織中MDA含量均有所下降；汪群紅等[26]發(fā)現(xiàn)，西紅花可以明顯降低腦、肝臟、腎臟勻漿中MDA含量，延緩衰老。本研究發(fā)現(xiàn)，GPP各劑量組均可以降低衰老小鼠肝臟中MDA含量，表明GPP可以減少體內(nèi)脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)。

4 結(jié) 論

GPP可以有效提高D-gal致衰老小鼠肝臟抗氧化能力，延緩衰老，其中100 mg/kg GPP對(duì)D-gal致衰小鼠肝臟抗氧化效果最明顯。