棉蚜ATP合成酶基因AgoATPb的克隆與表達(dá)

楊衛(wèi)軍，董艷蕾，吳秋芳，張美玲，韓麗濱，張?jiān)迹?

(1.安陽工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000；2.河南省太行山林業(yè)有害生物野外科學(xué)觀測研究站，河南 林州 456550)

棉蚜[(Glover)]是一種世界性分布的多食性害蟲，能夠危害300多種寄主植物，主要以葫蘆科、錦葵科、茄科和蕓香科植物為主。棉蚜以口器刺入植物韌皮部吸食汁液，常造成植物葉片蜷曲和植物矮縮；且可分泌蜜露導(dǎo)致細(xì)菌滋生，嚴(yán)重影響植物光合作用。此外，棉蚜是多種植物病毒的傳播載體，能夠?qū)е轮参锊《静〉念l繁發(fā)生。目前防治棉蚜主要以化學(xué)防治為主，然而農(nóng)藥對環(huán)境污染嚴(yán)重，對人畜有害，同時(shí)抗藥性也頻繁產(chǎn)生，亟需尋找對環(huán)境友好的害蟲防治新途徑，從基因水平上干擾昆蟲的生理系統(tǒng)來防治害蟲具有較好的發(fā)展前景。

ATP合成酶(ATP synthase)廣泛存在于生物細(xì)胞的細(xì)胞器中，通常由嵌入生物膜的疏水端F0亞基和生物膜外的親水端F1亞基組成，在動(dòng)物包括昆蟲細(xì)胞內(nèi)催化供能物質(zhì)ATP的合成。ATP合成酶B亞基在不同物種中保守性非常低，主要起連接和固定F0和F1復(fù)合體的裝配作用。ATP合成酶B亞基對于維持ATP合成酶的空間構(gòu)型非常重要，一旦缺失，將導(dǎo)致ATP合成酶構(gòu)象發(fā)生改變，影響ATP的合成。ATP合成酶B亞基在蚊子抗性品系中表達(dá)量顯著高于非抗性品系，表明其與昆蟲抗藥性有密切關(guān)系。在黑腹果蠅()生殖細(xì)胞中抑制ATP合酶B亞基的表達(dá)后，雄性果蠅生殖細(xì)胞不能發(fā)育成熟，從而導(dǎo)致生育能力的降低。缺少ATP合酶B亞基的褐飛虱()和果蠅死亡率明顯上升，同時(shí)該亞基屬于豌豆蚜()和柑橘木虱()唾液腺中的效應(yīng)蛋白。以上研究表明，ATP合成酶在昆蟲體內(nèi)主要參與氧化磷酸化過程中ATP的合成，對昆蟲的生長發(fā)育、繁殖，以及適應(yīng)環(huán)境起重要作用。若將ATP合成酶作為棉蚜控制的一個(gè)靶標(biāo)，不僅可以開辟害蟲分子調(diào)控的新領(lǐng)域，而且能夠有效提高對棉蚜的防治效果，為棉蚜防治提供新策略。

目前，已鑒定出多種昆蟲的ATP合成酶B亞基基因，尚未見有關(guān)棉蚜基因克隆與表達(dá)分析的研究報(bào)道。本研究以棉蚜為研究對象，克隆得到基因的全長序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析該基因在棉蚜不同組織和日齡，以及棉蚜取食不同寄主植物后的表達(dá)水平，為后續(xù)深入研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 棉蚜飼養(yǎng)

2017年4月10日在安陽工學(xué)院校內(nèi)木槿上采集棉蚜，帶回實(shí)驗(yàn)室將棉蚜轉(zhuǎn)接到棉花葉片上飼養(yǎng)，葉片葉柄用沾水的脫脂棉包被起來，放于直徑為15 cm的玻璃培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿用保鮮膜封口，并用昆蟲針刺破保鮮膜，保持空氣流通。棉蚜飼養(yǎng)的溫度、光周期和相對濕度分別設(shè)置為(25±1)℃、14 h/10 h(L/D)和60%±5%。

1.2 植物培養(yǎng)

將棉花、黃瓜、西葫蘆和甜瓜種子播種于直徑為20 cm、高度為15 cm的花盆中，用2 m×2 m尼龍網(wǎng)網(wǎng)罩(200目)將花盆罩起來，放置于室外進(jìn)行培養(yǎng)，每間隔5 d澆一次水，植株6個(gè)葉片(含子葉)后取葉片用于飼養(yǎng)蚜蟲。本實(shí)驗(yàn)中所用棉花、黃瓜、西葫蘆和甜瓜品種分別為中棉所49、早青二號(hào)、歐曼和綠寶石，均購買于市場。

1.3 棉蚜AgoATPb基因部分片段克隆

隨機(jī)收集在棉花葉片上生長的仔蚜(1～5日齡)和母蚜(產(chǎn)仔后1～5 d)共30～50頭，立刻放置于TRIzol(Invitrogen)中，然后用TRIzol法提取總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳和Nano2000測定RNA的完整性和濃度。以700 ng RNA為模板，按照PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)說明書，合成cDNA模板。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列信息，獲得棉蚜基因的部分編碼區(qū)序列。設(shè)計(jì)引物ATPb-1F和ATPb-1R(表1)，以合成的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，對該基因的核苷酸序列進(jìn)行驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：10 μL PCR Mix，上下游引物(10 μmol·L)各0.5 μL，3 μL cDNA模板，ddHO 6 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min；10 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%～1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，切膠回收目的條帶?；厥债a(chǎn)物用DNA回收試劑盒(OMEGA)回收，將回收產(chǎn)物連接到pEASY-T3(全式金)克隆載體上，導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，鑒定陽性克隆質(zhì)粒，將陽性質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 棉蚜AgoATPb基因末端快速克隆

利用1.3節(jié)提取的RNA，按照寶生物SMARTer RACE 5′/3′ Kit試劑盒(Takara)說明書合成5′和3′端RACE擴(kuò)增模板。根據(jù)1.3節(jié)克隆的基因的部分核苷酸序列分別設(shè)計(jì)5′和3′端GSP引物和NGSP引物(表1)。按照試劑盒要求的PCR擴(kuò)增體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后用1.0%～1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，回收目的條帶，進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選和陽性克隆的測序，方法與1.3節(jié)相同。

表1 棉蚜AgoATPb基因克隆與qRT-PCR引物

1.5 棉蚜AgoATPb的序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

用在線工具ORF Finder預(yù)測基因的閱讀框架；用在線軟件ExPASy(https://web.expasy.org/translate/)預(yù)測氨基酸的等電點(diǎn)與分子量；利用在線工具h(yuǎn)ttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/預(yù)測跨膜區(qū)；用在線軟件Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行AgoATPb氨基酸序列比對，并下載其他物種同源序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹和多重連配圖的構(gòu)建；利用在線軟件SignalP 5.0 Server預(yù)測AgoATPb蛋白的信號(hào)肽。

1.6 棉蚜AgoATPb基因的時(shí)空表達(dá)分析

吸取50 μL PBS磷酸緩沖液(pH值8.0)滴在體式顯微鏡鏡頭中央，用毛筆挑取4日齡棉蚜置于PBS溶液中，用消毒昆蟲針和顯微手術(shù)鑷解剖分離唾液腺、腦、卵巢、中腸和脂肪體等部位。解剖完成后立即放入裝有200 μL TRIzol的1.5 mL離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ占咛テ凇?日齡、3日齡、5日齡、7日齡、9日齡、13日齡和17日齡的棉蚜，分別提取總RNA，經(jīng)過瓊脂糖電泳和Nano2000確定總RNA質(zhì)量與濃度后，放置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。以提取的總RNA為模板，按照PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用于qRT-PCR反應(yīng)，以確定基因的表達(dá)水平。每個(gè)部位收集50頭蚜蟲作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)齡期收集30頭蚜蟲作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)部位和每個(gè)日齡3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 棉蚜AgoATPb基因表達(dá)水平

將在棉花上長期飼養(yǎng)的棉蚜，轉(zhuǎn)接到西葫蘆葉片上3代后，將1日齡棉蚜分別轉(zhuǎn)接到棉花、黃瓜、西葫蘆和甜瓜葉片上，每個(gè)葉片轉(zhuǎn)接15頭仔蚜，待在4種植物上生長3個(gè)世代后，收集10頭4日齡的仔蚜，提取總RNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和Nano2000確定總RNA質(zhì)量，根據(jù)試劑盒要求反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。每種植物3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 qRT-PCR

為了避免基因組DNA對qRT-PCR反應(yīng)的影響，棉蚜700 ng 總RNA用gDNA Eraser去除基因組DNA。之后，根據(jù)PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa)試劑盒的說明，以處理過的總RNA為模板合成cDNA。目的基因特異性引物ATPb-2F和ATPb-2R用于確定的表達(dá)水平。選取-為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因的引物為β-actin-F和β-actin-R。引物設(shè)計(jì)在Primer Premier 5.0中進(jìn)行，引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)在ABI 7500(Carlsbad)上進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照說明書進(jìn)行設(shè)置。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

基因的表達(dá)水平用2法計(jì)算。棉蚜不同部位、不同日齡和不同植物寄主棉蚜基因表達(dá)差異用單因素方差分析(ANOVA)方法的鄧肯氏檢驗(yàn)進(jìn)行比較，差異水平=0.05。所有數(shù)據(jù)分析都在SPSS軟件中完成(Version 14.0)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉蚜AgoATPb基因的克隆

以棉蚜cDNA為模板擴(kuò)增獲得了基因的部分核苷酸序列，測序結(jié)果表明，該片段長度為697 bp，與預(yù)期大小相同。根據(jù)獲得的部分核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，通過RACE技術(shù)，得到了棉蚜基因的全長序列。該基因全長1 247 bp，其中，閱讀框822 bp，5′端非編碼區(qū)128 bp，3′端非編碼區(qū)297 bp，共編碼274個(gè)氨基酸殘基(圖1)。利用生物信息學(xué)在線工具(https://web.expasy.org/translate/)對氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測棉蚜AgoATPb蛋白分子量為31.40 ku，等電點(diǎn)為8.95。SignalP Server和TMHMMServer預(yù)測結(jié)果表明，該基因的氨基酸序列無信號(hào)肽和跨膜區(qū)。

紅色代表為起始密碼子；*代表終止密碼子；黑色橫線部分為加尾信號(hào)(AATAAA)。

2.2 棉蚜AgoATPb基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，昆蟲的親緣關(guān)系越近，ATP合成酶B亞基氨基酸序列一致性越高，棉蚜、高粱蚜()、豌豆蚜()、大豆蚜()等聚集在一起，與褐飛虱()、茶翅蝽()、二化螟()親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。多重連配結(jié)果表明，AgoATPb與其他昆蟲同源氨基酸序列有78個(gè)高度保守位點(diǎn)，存在ATP合成酶家族的典型結(jié)構(gòu)域(圖3)。將基因的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，其與其他昆蟲的一致性為47%～99%。

采用鄰接法，自舉檢驗(yàn)1 000次；圖中標(biāo)尺為遺傳距離。

黑色橫線部分代表ATP合成酶B亞基的典型結(jié)構(gòu)域。黑色陰影為氨基酸具有100%一致性，灰色表示一致性在50%以上，白色表示一致性在50%以下。AaeATPb，埃及伊蚊；CquATPb，致倦庫蚊；GmeATPb，大蠟螟；SfrATPb，草地貪夜蛾；AgoATPb，棉蚜；MpeATPb，桃蚜；ApiATPb，豌豆蚜。

2.3 棉蚜AgoATPb基因時(shí)空表達(dá)分析

基因在棉蚜唾液腺、腦、卵巢、中腸、脂肪體中都有表達(dá)，且在不同部位表達(dá)水平存在顯著差異(=37.429，<0.001)。在唾液腺和腦中的表達(dá)水平雖無顯著差異，但是二者表達(dá)量均顯著高于卵巢和脂肪體，而在中腸表達(dá)水平最低；總體上基因在卵巢、中腸和脂肪體中相對表達(dá)量較低(圖4)。

圖中的數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

基因在不同日齡棉蚜間表達(dá)水平存在著顯著差異(=23.343，<0.001)。除了在胚胎期不表達(dá)外，在其他日齡均有表達(dá)，從胚胎期開始表達(dá)量上升，3日齡棉蚜中表達(dá)水平最高，之后降低，在17日齡表達(dá)量最低(圖5)。

圖5 AgoATPb基因在胚胎和不同日齡棉蚜中表達(dá)水平

2.4 不同寄主植物上棉蚜AgoATPb基因的表達(dá)水平

在棉蚜取食不同植物后，基因表達(dá)水平存在顯著差異(=64.822，<0.001)。在棉花上棉蚜體內(nèi)基因表達(dá)水平最高，顯著高于黃瓜、甜瓜和西葫蘆，在黃瓜和西葫蘆上表達(dá)水平相當(dāng)，甜瓜上表達(dá)水平最低，顯著低于在其他植物上(圖6)。

圖6 不同寄主植物上4日齡棉蚜體內(nèi)AgoATPb基因的表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

ATP合成酶B亞基是昆蟲催化供能物質(zhì)ATP合成的關(guān)鍵基因，但對重要害蟲棉蚜ATP合成酶B亞基基因的研究目前還未見有報(bào)道?；诖耍狙芯繌拿扪赁D(zhuǎn)錄組中篩選出了ATP合成酶B亞基基因的部分核苷酸序列，結(jié)合RACE技術(shù)獲得了棉蚜ATP合成酶B亞基基因的1 247 bp全長序列，其閱讀框?yàn)?22 bp，5′端非編碼區(qū)128 bp，3′端非編碼區(qū)297 bp，共編碼274個(gè)氨基酸殘基，其分子量為31.40 ku，等電點(diǎn)為8.95。通過在GenBank數(shù)據(jù)庫中的Blastp進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，AgoATPb氨基酸序列與其他物種同源氨基酸序列一致性均在47%以上。

根據(jù)基因在不同部位表達(dá)和齡期的表達(dá)，可以推測基因的功能。通常認(rèn)為ATP合成酶B亞基與能量物質(zhì)ATP的合成有重要關(guān)系，而脂肪體是昆蟲能量儲(chǔ)存和代謝的主要部位，推測應(yīng)該在脂肪體具有高水平的表達(dá)；然而，本研究發(fā)現(xiàn)該基因在脂肪體的表達(dá)含量最低，這也說明該基因不僅僅參與能量物質(zhì)的合成。同時(shí)，基因在棉蚜唾液腺中表達(dá)水平最高，這可能與棉蚜適應(yīng)寄主植物有關(guān)。因?yàn)橥僖合偌饶軌驇椭涛嚼ハx應(yīng)對植物的防御反應(yīng)，又能夠幫助其順利取食植物韌皮部的汁液?；蛟诿扪恋亩鄠€(gè)部位均有表達(dá)，說明其具有多種生理功能?；虺嗽谂咛テ诓槐磉_(dá)外，在棉蚜其他各個(gè)日齡均有不同水平的表達(dá)，表明其在棉蚜生長發(fā)育過程中也起著重要作用。

對豌豆蚜和柑橘木虱唾液腺的研究發(fā)現(xiàn)，ATP合成酶B亞基基因存在于昆蟲的唾液腺中，推測其與適應(yīng)寄主植物有關(guān)。本研究中，棉蚜取食黃瓜、棉花、西葫蘆和南瓜后其體內(nèi)基因表達(dá)水平存在著顯著差異?；虮磉_(dá)水平與昆蟲適應(yīng)寄主植物有密切關(guān)系，因此昆蟲在取食新寄主植物時(shí)基因表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變。基因在不同寄主植物上表達(dá)水平變化也有可能與棉蚜適應(yīng)寄主植物有關(guān)，基因在棉蚜適應(yīng)寄主植物中的生理功能有待深入驗(yàn)證。