一株假單胞菌的分離鑒定及其在青海地區(qū)堆肥中的應(yīng)用潛力

張鑫鵬，王 信，孫 健，伊國云，李松齡

(青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016)

油菜是青海省的第三大種植作物，目前種植面積在14.67萬hm左右。油菜秸稈既含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，又含有較多的纖維素，而纖維素在堆肥過程中較難降解。在利用油菜秸稈堆肥時(shí)，向其中加入纖維素降解菌劑，利用微生物降解纖維素，是解決這一問題的有效措施之一。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已篩選出部分纖維素高效降解菌株，并將其應(yīng)用到玉米、水稻、小麥秸稈上。例如：王洪媛等篩選出3株纖維素降解真菌，其中，W4菌株表現(xiàn)出較好的秸稈降解能力；于慧娟等篩選出5株真菌，以綠色木霉作為對照菌株，進(jìn)行小麥秸稈降解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)篩選出的真菌的降解率比綠色木霉高2倍以上；Abdel-Rahman等向水稻秸稈堆肥中添加纖維素降解菌，發(fā)現(xiàn)添加菌劑的處理，堆肥腐熟快，且產(chǎn)品質(zhì)量高；謝宇新等從環(huán)境中分離到一株低溫降解菌，在-20 ℃的低溫堆肥中加入此菌能使堆溫迅速升高，堆肥1～2 d后堆溫可達(dá)55～65 ℃；孟建宇等從內(nèi)蒙古地區(qū)的土壤中分離出36株纖維素降解菌，其中，屬于假單胞菌屬(sp.)的有10株，且這些菌在10 ℃以下環(huán)境中的酶活相對較高。

基于上述研究，本文首先在青海當(dāng)?shù)胤蛛x土著菌，從中篩選出纖維素降解能力強(qiáng)的菌株，制成微生物菌劑，然后以豬糞、油菜秸稈為原料，加入制成的微生物菌劑，研究堆肥理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，以期篩選出適宜青海當(dāng)?shù)貧夂驐l件堆肥發(fā)酵的微生物菌劑，為實(shí)現(xiàn)當(dāng)?shù)赜筒私斩挼绒r(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來源

土壤樣品于2019年4月在青海省西寧市北山土樓觀(36°38′28″N，101°46′18″E，海拔2 380 m)采集，采樣時(shí)的環(huán)境溫度為20 ℃。取樣地土壤類型為灰鈣土，土壤顏色為紅色，pH值為7.5，質(zhì)地為黏土，砂石含量30%，植被類型為常綠針葉林油松林。采樣區(qū)氣候冷涼，屬高原大陸性半干旱氣候，年平均氣溫6 ℃，晝夜溫差大。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集液體培養(yǎng)基：酵母粉2 g，NaCl 0.1 g，KHPO1.0 g，CaCl0.1 g，NaNO2.5 g，F(xiàn)eCl0.01 g，MgSO0.3 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

細(xì)菌培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10.0 g，KNO1.0 g，KHPO0.5 g，MgSO0.5 g，NaCl 1.5 g，剛果紅0.2 g，瓊脂16 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：油菜秸稈粉10 g(粉碎后過2 mm篩)，KHPO1 g，MgSO0.3 g，NaNO2.5 g，CaCl·6HO 0.1 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eCl0.01 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

1.1.3 堆肥原料

堆肥原料中的豬糞取自青海泰和源農(nóng)牧科技有限公司，秸稈由互助縣青海昱青生物科技有限責(zé)任公司提供。油菜秸稈截成3～5 cm小段。將上述2種堆肥原料的部分理化性質(zhì)整理于表1。

表1 堆肥原料的部分理化性質(zhì)

1.2 微生物菌劑制備

1.2.1 纖維素降解菌株初篩

取10 g土壤樣品加入90 mL裝有濾紙的富集液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床振蕩，待濾紙斷裂后，取5 mL樣品轉(zhuǎn)接至富集液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)轉(zhuǎn)接3次。取10 mL經(jīng)富集的樣品于90 mL無菌水中，置于恒溫?fù)u床振蕩30 min，得到10濃度梯度的菌懸液，然后依次制成10～10濃度梯度的菌懸液。取0.1 mL的各濃度梯度的菌懸液涂布于CMC-Na固體平板上，每一梯度重復(fù)3次，25 ℃培養(yǎng)24～72 h后，挑選單菌落反復(fù)劃線于CMC-Na固體平板上，25 ℃培養(yǎng)48 h，然后向培養(yǎng)皿中加入剛果紅進(jìn)行染色，測量菌株的菌落透明圈直徑(，cm)與菌落直徑(，cm)，計(jì)算二者的比值，選擇比值較大的菌株進(jìn)行保存。

1.2.2 纖維素降解菌株復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種到細(xì)菌培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min培養(yǎng)24 h，制成孢子懸浮液。按照2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min培養(yǎng)24 h，4 ℃、6 000 r·min離心10 min，上清液即為測定纖維素酶活所需的粗酶液。用DNS法測定纖維素酶活，具體包括羧甲基纖維素(CMC)酶活、濾紙酶活和外切--葡聚糖酶活。

CMC酶活測定：向試管中加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CMC-Na溶液、0.5 mL粗酶液、0.5 mL pH值為4.5的檸檬酸緩沖液，混合均勻后，放置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，取出后加入1.5 mL二硝基水楊酸(DNS)，搖勻，100 ℃水浴10 min，待冷卻后，加入10 mL蒸餾水，測定波長540 nm處的吸光值。

濾紙酶活測定：向試管中加入50 mg的濾紙、0.5 mL粗酶液、1.5 mL pH值為4.5的檸檬酸緩沖液，其余方法同CMC酶活測定。

外切--葡聚糖酶活測定：向試管中加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的微晶素底物溶液，其余方法同CMC酶活測定。

基于測定的各菌株的纖維素酶活，對降解菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.3 菌株鑒定

菌株形態(tài)觀察和生理生化特性檢測參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行。

菌株的16S rDNA基因檢測：采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取菌株DNA。采用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10×PCR緩沖液2 μL，引物(10 μmol·L)各0.5 μL，Plus DNA Polymerase(5 U·μL)0.5 μL，dNTP(10 mmol·L)0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddHO 14 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 8 min。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，應(yīng)用MEGA 5.0軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.2.4 微生物液體菌劑的制備

將篩選出的纖維素降解菌株接種于細(xì)菌培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min振蕩培養(yǎng)36 h，待菌液濃度達(dá)到1×10CFU·mL，即為液體微生物菌劑。

1.3 堆肥試驗(yàn)設(shè)計(jì)

堆肥試驗(yàn)于2020年6月1日—7月20日在青海大學(xué)教學(xué)實(shí)踐基地溫室大棚中進(jìn)行，共持續(xù)50 d。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理，分別為試驗(yàn)組和對照組，每組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

堆肥時(shí)，用新鮮豬糞和油菜秸稈按體積比3∶1的比例進(jìn)行混合。同時(shí)，分別按照物料總質(zhì)量的0.1%和1%的比例添加麩皮和麻渣。混勻后，建成長、寬、高分別為1.8、1.5、0.6 m的條垛式堆體，堆體的C/N在(25～30)∶1，水分含量控制在55%～60 %。試驗(yàn)組按照10 mL·kg的比例添加液體微生物菌劑，對照組不添加微生物菌劑，其他物料添加量均與試驗(yàn)組相同。

各組中的物料攪拌均勻后，用塑料覆蓋保溫，成堆進(jìn)行發(fā)酵。采用人工翻堆的方式補(bǔ)充堆內(nèi)的新鮮空氣。自堆制開始，第3天進(jìn)行第一次翻堆，之后每隔3 d翻堆一次。

取樣時(shí)，采用五點(diǎn)取樣法于四周和中心分別取樣，取樣高度為堆高的1/2處，每樣點(diǎn)取500 g樣品，混合后分為2份：一份于4 ℃保存；一份風(fēng)干后粉碎，過40目篩。自制堆開始，分別于0、7、16、24、32、40、50 d取樣。

1.4 指標(biāo)測定

自堆肥開始，于每日10：00和16：00各測量1次堆體溫度，在堆體中上部(30 cm)隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)，各使用1只LCD-105型插入式數(shù)字溫度計(jì)(衡水正旭電子科技有限公司)進(jìn)行測量，以5個(gè)點(diǎn)的平均值作為該時(shí)間點(diǎn)堆體的實(shí)際溫度，以每日2個(gè)時(shí)段堆體溫度的平均值作為當(dāng)日的堆體溫度，同時(shí)記錄堆肥周圍的環(huán)境溫度。

稱取樣品5 g，用50 mL蒸餾水(經(jīng)煮沸驅(qū)除CO)浸提，160 r·min振蕩30 min，后靜置10 min，用雷磁PHS-3E型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)和DDS-307A型電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測定樣品pH值和電導(dǎo)率(EC)。

參照文獻(xiàn)[12]中的方法測定種子發(fā)芽指數(shù)(GI)，參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2012《有機(jī)肥料》測定樣品的全氮含量和有機(jī)質(zhì)含量。

稱取一定質(zhì)量的樣品裝于鋁盒(質(zhì)量已知)中，放入105 ℃烘箱烘干，直到前后2次稱量(間隔2 h)的質(zhì)量差小于0.01 g為止，再次稱量。根據(jù)樣品的質(zhì)量變化，計(jì)算含水率。

堆肥開始前，向堆體中放入12個(gè)裝有20 g油菜秸稈的尼龍袋，分別在堆肥的1、15、30、50 d各取出3個(gè)尼龍袋(每袋作為1個(gè)重復(fù))，測定剩余秸稈的質(zhì)量，基于油菜秸稈的質(zhì)量變化計(jì)算降解率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析，對有顯著(<0.05)差異的，采用Student’stest進(jìn)行檢驗(yàn)。采用Origin 2019軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選與鑒定

從采集的土壤樣本中分離純化得到5株濾紙降解能力較強(qiáng)的菌株，分別將其編號(hào)為HK-15-4、HK-15-5、HK-15-6、HK-15-7、HK-15-8?；趧偣t染色法測定的菌株透明圈()和菌落直徑()(表2)，選擇值較高的3株菌(HK-15-6、HK-15-7、HK-15-8)進(jìn)行復(fù)篩。經(jīng)檢測，HK-15-6菌株的纖維素酶活在供試菌株中最高(表3)。綜合上述結(jié)果，選擇菌株HK-15-6作為后續(xù)研究的對象。

表2 供試菌株的透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)

表3 部分供試菌株的纖維素酶活性

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)與生理生化鑒定

菌株HK-15-6在細(xì)菌培養(yǎng)基平板上于25 ℃培養(yǎng)24 h，呈黃色半透明圓形菌落，表面光滑且濕潤，質(zhì)地均勻，有光澤，邊緣整齊呈地毯狀。

生理生化測試結(jié)果表明：菌株HK-15-6為好氧性細(xì)菌，可分解葡萄糖產(chǎn)酸，但不能分解蔗糖產(chǎn)酸，革蘭氏染色、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)均為陰性，菌株具有運(yùn)動(dòng)力。

2.2.2 分子鑒定

用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增菌株HK-15-6，測序后，經(jīng)Blast比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果顯示，該菌株與sp.(MW936631)的親緣關(guān)系最近。

圖1 菌株HK-15-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和分子鑒定結(jié)果，將菌株HK-15-6鑒定為假單胞菌屬(sp.)。

2.3 堆肥過程中堆體理化性質(zhì)的變化

2.3.1 溫度

一般來說，堆肥過程會(huì)經(jīng)歷升溫期、高溫期、降溫期、腐熟期。與對照組相比，試驗(yàn)組的堆體溫度上升較快，在堆肥第1天就達(dá)到51.5 ℃，而對照組在第2天才升至50 ℃。對照組和試驗(yàn)組堆體溫度維持在50 ℃以上的時(shí)間分別為14 d和26 d，最高溫度分別為66.8 ℃和69.2 ℃。進(jìn)入降溫期后，對照組和試驗(yàn)組的堆體溫度差值縮小，分別在36 d和32 d堆體溫度降至50 ℃以下。與對照組相比，試驗(yàn)組堆體升溫較快，且高溫(>50 ℃)期的持續(xù)時(shí)間長，堆體進(jìn)入降溫期的時(shí)間較早，說明添加菌劑加快了堆肥的腐熟進(jìn)程。

國家標(biāo)準(zhǔn)GB 7959—2012《糞便無害化衛(wèi)生要求》指出，堆肥過程中堆體溫度達(dá)50 ℃以上并至少持續(xù)10 d才可殺死糞便中的致病菌及其有害物質(zhì)。對照此標(biāo)準(zhǔn)，對照組和試驗(yàn)組均滿足要求。

圖2 堆肥過程中的溫度變化

2.3.2 pH值

堆肥過程中，微生物活性與pH值密切相關(guān)，當(dāng)pH值為7.0～8.5時(shí)，堆肥中微生物的活性和繁殖力最優(yōu)。同時(shí)，pH值也是評價(jià)堆肥是否腐熟的重要指標(biāo)。本研究中，試驗(yàn)組和對照組的pH值總體來說均呈先升高后降低再上升最后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(圖3)：在堆肥升溫期，堆體的pH值穩(wěn)定在8左右；當(dāng)堆肥進(jìn)行到24 d時(shí)，pH值迅速下降，之后又急劇上升，于32 d時(shí)達(dá)到峰值，之后又緩慢下降；至堆肥腐熟階段，堆體的pH值穩(wěn)定在7.8～8.1。2個(gè)處理的pH值均達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2012《有機(jī)肥料》對pH值的要求(pH值為5.5～8.5)。

點(diǎn)上無相同小寫字母的表示同一測定時(shí)間不同處理下差異顯著(P<0.05)，無相同大寫字母的表示同一組不同測定時(shí)間下差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3.3 EC值

EC值可反映堆肥中可溶性鹽的含量，若EC值過高，說明堆肥中鹽類過多，對植物生長會(huì)有抑制作用。隨堆肥時(shí)間延長，試驗(yàn)組和對照組堆體的EC值均呈逐漸增加的趨勢，到腐熟階段趨于穩(wěn)定(圖4)。在堆肥的16—50 d，試驗(yàn)組的EC值顯著(<0.05)低于對照組。至堆肥結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組、對照組的EC值分別為0.88、1.02 mS·cm。研究表明，堆體的EC值小于4 mS·cm，說明堆肥已腐熟，達(dá)到安全使用標(biāo)準(zhǔn)。本研究堆肥結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組和對照組的EC值均符合此要求。

圖4 堆肥過程中電導(dǎo)率(EC)的變化

2.3.4 發(fā)芽指數(shù)(GI)

GI是評價(jià)堆肥腐熟的重要指標(biāo)。當(dāng)GI達(dá)80%～85%時(shí)，說明堆肥已基本腐熟。隨堆肥時(shí)間延長，試驗(yàn)組和對照組的GI均呈上升趨勢(圖5)。堆肥前期(0—16 d)，試驗(yàn)組和對照組的GI值差異較小，僅7 d時(shí)差異達(dá)顯著水平(<0.05)；隨后，兩組的差值逐漸擴(kuò)大，試驗(yàn)組的GI顯著(<0.05)高于對照組。至50 d時(shí)，僅試驗(yàn)組的GI達(dá)85%以上，為90%，比對照組高出12百分點(diǎn)。這說明，添加菌劑對堆肥的促腐效果明顯。

圖5 堆肥過程中種子發(fā)芽指數(shù)(GI)的變化

2.3.5 含水率

堆體含水率是影響堆肥進(jìn)行的重要因素。堆肥開始時(shí)，堆體含水率在55%～65%較為適宜，超過65%時(shí)，堆肥會(huì)變成厭氧發(fā)酵。由于堆肥過程中堆體的含水量調(diào)節(jié)成本高且不易控制，為此，本研究特在堆肥初期將含水率控制在58%。隨著堆肥時(shí)間推進(jìn)，無論是試驗(yàn)組還是對照組，堆體的含水率均顯著(<0.05)下降(圖6)。兩組相比，除0、16 d外，其他時(shí)間對照組的含水率均顯著(<0.05)高于試驗(yàn)組。至堆肥結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組含水率為24.29%，對照組含水率為28.75%，均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2012《有機(jī)肥料》的相關(guān)要求。

圖6 堆肥過程中含水率的變化

2.3.6 全氮和有機(jī)質(zhì)

堆肥前后相比，無論是試驗(yàn)組還是對照組，其全氮含量均無顯著差異；但兩組相比，堆肥結(jié)束后，試驗(yàn)組的全氮含量顯著(<0.05)高于對照組。與全氮含量變化不同的是，無論是試驗(yàn)組還是對照組，堆肥后的有機(jī)質(zhì)含量均較堆肥前顯著(<0.05)降低，降幅分別為27.8%和18.4%；堆肥結(jié)束后，試驗(yàn)組的有機(jī)質(zhì)含量顯著(<0.05)低于對照組。這說明，添加菌劑更有利于堆體物料中有機(jī)質(zhì)的降解。

2.3.7 降解率

整體來看，隨著堆肥進(jìn)行，試驗(yàn)組和對照組的降解率均顯著(<0.05)升高，且在堆肥期間(15—50 d)試驗(yàn)組和對照組的降解率差異顯著(<0.05)。這說明，菌劑的加入在堆肥過程中加速了纖維素的降解。堆肥結(jié)束時(shí)，對照組的降解率僅為30.8%，而試驗(yàn)組達(dá)45.6%，較對照組提高14.8百分點(diǎn)。

表4 堆肥過程中全氮和有機(jī)質(zhì)含量的變化

圖7 堆肥過程中降解率的變化

3 討論

篩選出適合青藏高原冷涼氣候條件，且纖維素降解能力強(qiáng)的菌株，對于青海地區(qū)數(shù)量巨大的油菜秸稈和豬糞等廢棄物的資源化利用來說十分關(guān)鍵。目前，已經(jīng)篩選出的纖維素降解菌數(shù)目龐大，但適宜青海地區(qū)堆肥發(fā)酵的菌株相對較少。本研究在常溫條件下篩選得到1株纖維素降解能力強(qiáng)的菌株HK-15-6，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬。該菌屬于常溫菌，在30 ℃的培養(yǎng)條件下可生產(chǎn)、制作成微生物菌劑。經(jīng)檢測，HK-15-6菌株的濾紙酶活為20.58 U·mL，低于尚曉瑛等篩選的B6-15菌株(同為假單胞菌屬)的濾紙酶活(24.94 U·mL)，這可能是因?yàn)楸狙芯课磳υ摼甑漠a(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。后續(xù)試驗(yàn)可考慮對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，這樣將更有利于該菌株在青海地區(qū)堆肥發(fā)酵中的應(yīng)用。

將分離得到的菌株制成液體微生物菌劑，用于豬糞和油菜秸稈的堆肥試驗(yàn)，結(jié)果表明，添加菌劑的試驗(yàn)組，堆溫升至高溫期的用時(shí)較短且高溫持續(xù)時(shí)間長，至堆肥結(jié)束時(shí)，其全氮含量和種子發(fā)芽指數(shù)都更高。李曉宇等篩選出3株芽孢桿菌，研究其在牛糞堆肥上的效果，結(jié)果表明，添加菌劑的處理在堆肥第3天即進(jìn)入高溫期并持續(xù)了16 d，最高堆溫為65.4 ℃；李昌寧等的堆肥試驗(yàn)，在堆肥第2天即進(jìn)入高溫期，高溫期持續(xù)25 d；孫元烽等的堆肥試驗(yàn)中，55 ℃以上的高溫期維持10 d。與上述研究相比，本研究在堆溫方面的表現(xiàn)最好，堆體很快地進(jìn)入高溫期(2 d)，高溫持續(xù)時(shí)間長(26 d)，且最高溫度為69.2 ℃。雖然青海地區(qū)晝夜溫差大，但該菌株仍表現(xiàn)出較好的堆肥效果，顯示出較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。