載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復(fù)合體系的穩(wěn)定性

張辰辰， 程佳馨， 戴竹青， 何偉偉， 耿寧寧， 李 瑩， 李大婧， 宋江峰

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014； 2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.寶雞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西寶雞 721013)

葉黃素是一種重要的含氧類胡蘿卜素，可以保護視網(wǎng)膜免受光損傷，對老年性黃斑變性病、白內(nèi)障、青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變、色素性視網(wǎng)膜炎等眼疾有預(yù)防和緩解作用。此外，葉黃素還具有抗氧化、抑制炎癥、抗癌的功效。但是由于葉黃素多烯鏈結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在加工貯藏過程中易受pH值、光照、溫度等環(huán)境因素的影響而降解損失，同時其水溶性較差，因而利用增溶劑、兩親性聚合物等天然材料對葉黃素進行物理包埋，制備納米化葉黃素穩(wěn)定復(fù)合體系將有助于擴大葉黃素在食品、藥品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

甜菊苷由親水性的雙側(cè)糖基(葡萄糖基和鼠李糖基)和疏水性的甜菊醇基連接構(gòu)成，這種雙親性的分子結(jié)構(gòu)與三萜皂苷類較為相似。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，甜菊糖苷類物質(zhì)具有增溶特性，利用甜茶苷制備水溶性的姜黃色素制劑，具有良好的穩(wěn)定性和生物活性。筆者所在課題組前期利用天然甜菊苷兩親性結(jié)構(gòu)性質(zhì)制備出甜菊苷-葉黃素復(fù)合物，顯著提高了葉黃素的水溶性和生物利用率，但體系穩(wěn)定性較差。研究發(fā)現(xiàn)，植物蛋白分子具有良好的生物兼容性、降解性、乳化性及表面活性，能顯著提高復(fù)合體系的物理穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)分子因含有大量疏水性、親水性基團，具有表面活性，能產(chǎn)生乳化作用，常被用于包埋脂溶性功能物質(zhì)。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白負載白藜蘆醇后，乳狀液物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性得到了提高。李燕等用乳清分離蛋白-麥芽糖糊精美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物包埋-胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)此復(fù)合物能夠顯著降低乳狀液的粒徑，提高-胡蘿卜素對光熱的穩(wěn)定性。本研究利用鷹嘴豆分離蛋白和甜菊苷為材料制備載葉黃素的復(fù)合體系，研究pH值、鹽離子、凍融處理、不同貯藏條件對鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復(fù)合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復(fù)合體系穩(wěn)定性的影響及人工模擬胃腸液中復(fù)合體系的穩(wěn)定性，以期為葉黃素復(fù)合體系在功能食品和飲料中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葉黃素(含量≥90%)，購自上海源葉生物科技有限公司；鷹嘴豆分離蛋白(含量≥85%)，購自陜西帕尼爾生物科技有限公司；甜菊苷(含量≥90%)，購自上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶、豬膽鹽、胰脂肪酶、糖化酶，均為生化試劑，購自南京奧多福尼生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、二甲基亞砜、乙酸、乙醇、鹽酸、氯化鈉、氯化鈣、氫氧化鈉，均為國產(chǎn)分析純。試驗分別于2019年2—5月、2020年4月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實驗室進行。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波處理器(UP400S)，德國Hielscher公司；恒溫液浴循環(huán)兩用槽(7HD120)，英國Prima公司；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A)，上海亞榮生化儀器廠；數(shù)顯測速恒溫磁力攪拌器(85-2A)，常州市金壇華偉儀器廠；臺式高速離心機(TG16-WS)，湖南湘儀離心機儀器有限公司；電子分析天平(BSA224S)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；雙光束紫外可見分光光度計(UV-6300)，上海美譜達儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器(SHZ-82)，常州國宇儀器制造有限公司；納米粒度儀(Zetasizer Nano-ZS90)，英國Malvern公司；全自動色差計(CR-400)，日本柯尼卡美能達公司；pH計(PHS-5型)，上?？祪x儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052BS-Ⅲ)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復(fù)合體系的制備 參考李青等的方法并加以修改。將鷹嘴豆分離蛋白分散到10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中(pH值為7.0)，于室溫、500 r/min條件下磁力攪拌2 h。蛋白溶液使用超聲波破碎儀進行超聲處理，時間為10 min，振幅為37.5 μm，脈沖比為0.5。將超聲處理后的蛋白溶液離心(8 000 r/min)10 min，獲得的上清液即為蛋白納米溶液。用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7.0)配制甜菊苷溶液。將甜菊苷溶液和蛋白納米溶液混合，磁力攪拌5 min。將溶有葉黃素(20 mg/mL)的乙醇溶液倒入磁力攪拌的甜菊苷-蛋白溶液中，攪拌5 min后進行超聲處理，超聲條件：脈沖比0.65，振幅72 μm，時間6 min，甜菊苷質(zhì)量分數(shù)為0.5%。超聲結(jié)束后濃縮去除乙醇，即獲得載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復(fù)合體系(CPI-STE-LUT)。

1.3.2 pH值對葉黃素復(fù)合體系穩(wěn)定性的影響 測定pH值為3、4、5、6、7、8條件下鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復(fù)合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復(fù)合體系的平均粒徑、葉黃素乳化產(chǎn)率，用0.1%～1.0%乙酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系的pH值。

1.3.3 Na濃度對葉黃素復(fù)合體系穩(wěn)定性的影響 分析添加0、10、20、30、40、60 mmol/L NaCl溶液后鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復(fù)合體和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復(fù)合體系的平均粒徑、葉黃素乳化產(chǎn)率。

1.3.4 凍融處理對葉黃素復(fù)合體系穩(wěn)定性的影響 將鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復(fù)合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復(fù)合體系在-20 ℃冷凍12 h后常溫解凍(反復(fù)凍融3次)，測定其平均粒徑、葉黃素的乳化產(chǎn)率。

1.3.5 不同貯藏條件下葉黃素復(fù)合體系的穩(wěn)定性 分別將50 mL鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復(fù)合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復(fù)合體系轉(zhuǎn)移至離心管中，在不同溫度(4、25、37 ℃)、避光、非避光條件下進行貯藏試驗。分別貯藏0、5、10、15、20、25、30 d后進行取樣，測定其平均粒徑、葉黃素保留率及色澤的變化。

1.3.6 模擬胃腸液中葉黃素復(fù)合體系的穩(wěn)定性 將鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復(fù)合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復(fù)合體系進行胃液、腸液2個階段的模擬消化，整個過程在恒溫振蕩水浴系統(tǒng)中進行，溫度控制為37 ℃。取10 mL乳液，加入 20 mL 模擬胃液(含2 mg/mL NaCl、3.2 mg/mL胃蛋白酶)，調(diào)節(jié)pH值至1.2，在恒溫振蕩水浴鍋內(nèi)消化1.5 h。再調(diào)節(jié)pH值為7.0，在上述溶液中繼續(xù)加入7.5 mL模擬腸液(含5 mg/mL膽汁鹽、10 mmol/L CaCl、150 mmol/L NaCl、2.4 mg/mL 胰脂肪酶、2.4 mg/mL糖化酶)，于恒溫振蕩水浴鍋中繼續(xù)消化6 h，分別在1、2、3、4、5、6 h取樣，測定葉黃素含量并計算葉黃素的保留率。

1.3.7 理化指標的測定

1.3.7.1 粒度 將鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷-葉黃素復(fù)合體系和鷹嘴豆分離蛋白-葉黃素復(fù)合體系用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值為7)稀釋100倍，采用納米激光粒度儀測量其粒徑，儀器設(shè)定散射光角度為90°，測定溫度為25 ℃，每個樣品至少重復(fù)測試3次，取平均值。

1.3.7.2 葉黃素含量 取100 μL樣液溶于 9.900 mL 二甲基亞砜(DMSO)中，用紫外分光光度計在460 nm處測定其吸光度。標準曲線的繪制方法：精確稱取葉黃素標準品(溶于DMSO中)，配制成1～10 mg/L的標準溶液，在460 nm處測量吸光度，以葉黃素含量為橫坐標()、吸光度為縱坐標()繪制標準曲線。得到標準曲線方程為=46592 0-0005 6，=0.999 7。根據(jù)標準曲線方程確定樣液中的葉黃素含量。

1.3.7.3 葉黃素乳化產(chǎn)率 取新鮮制備的葉黃素復(fù)合體系，靜置1 h后測定葉黃素濃度，按照公式(1)計算葉黃素乳化產(chǎn)率：

(1)

1.3.7.4 葉黃素保留率 葉黃素保留率的計算方法見公式(2)：

(2)

1.3.7.5 溶液色澤的測定 使用CR-400全自動色差計測定溶液色澤，每次使用前分別進行黑板、白板校正，測定時取2 mL液體于樣品池中，測頭對準樣本發(fā)光3次后，記錄、、值，表示亮度值；表示紅綠值；表示藍黃值，色差值Δ描述待測樣品顏色變化，由、、通過計算得到，以空白試驗葉黃素乳液為參比標準溶液，注意不要漏光，重復(fù)測定3次。色差值(Δ)及飽和度值(Δ)通過公式(3)和(4)計算：

Δ=Δ+Δ+Δ)12；

(3)

Δ=(Δ+Δ)12。

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿穩(wěn)定性

不同pH值條件下載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復(fù)合體系(CPI-STE-LUT)的平均粒徑見圖1。可以看出，當(dāng)pH值為4～9時，復(fù)合體系的平均粒徑隨著pH值的升高而大幅減?。划?dāng)pH值為4～6時，體系的平均粒徑大于1 000 nm，出現(xiàn)絮凝、聚結(jié)和分層現(xiàn)象，可能因為鷹嘴豆分離蛋白的等電點(PI)在4.5～5.0范圍內(nèi)，此時蛋白質(zhì)的溶解度減小，所帶正負電荷恰好相等，沒有相同電荷互相排斥，粒子間相互聚集，進而發(fā)生絮凝沉淀，這與崔健等的研究結(jié)果相似；當(dāng)pH值>7時，體系的平均粒徑在200 nm左右。在酸性條件下，CPI-STE-LUT三元復(fù)合體系的平均粒徑大于CPI-LUT二元復(fù)合體系，當(dāng)pH值為8.0時，三元復(fù)合體系的粒徑最小，僅為196.28 nm，這可能是因為部分甜菊苷分子附著在鷹嘴豆分離蛋白顆粒表面，使蛋白質(zhì)分子間的靜電引力減小，從而減少了顆粒間的相互聚集。

如圖2所示，葉黃素的乳化產(chǎn)率隨著pH值的提高而升高，在酸性條件下，其乳化產(chǎn)率低于80%，在中性及堿性條件下，其乳化產(chǎn)率均達80%以上。其原因可能是在酸性條件下，鷹嘴豆分離蛋白溶解度下降，導(dǎo)致體系的葉黃素乳化率降低，此外，葉黃素在酸性環(huán)境中發(fā)生共軛體系碳原子的質(zhì)子化，加速了葉黃素的降解。對比發(fā)現(xiàn)，在中性和堿性條件下CPI-STE-LUT三元復(fù)合體系的葉黃素乳化率高于CPI-LUT二元復(fù)合體系。

2.2 耐鹽穩(wěn)定性

如圖3所示，復(fù)合體系的平均粒徑隨著Na濃度的升高而增大，這與朱振寶等的研究結(jié)果相似，即Na離子會引起體系的不穩(wěn)定。隨著離子強度的提高，復(fù)合體系中水相離子強度增加，在乳狀液中產(chǎn)生靜電屏蔽，從而降低粒子間的靜電排斥力，誘發(fā)粒子絮凝或聚合。并且當(dāng)鹽離子濃度增大時，會引起蛋白質(zhì)的鹽析作用，從而影響其溶解度，降低體系的穩(wěn)定性。當(dāng)Na濃度高于60 mmol/L時，三元體系粒徑的變大趨勢變緩，當(dāng)Na濃度為100 mmol/L時，二元體系的平均粒徑達450 nm，而三元體系的粒徑僅為350 nm，可見甜菊苷的引入使得復(fù)合體系的耐鹽性更好。

由圖4可以看出，在復(fù)合體系中，隨著Na濃度的升高，葉黃素的乳化產(chǎn)率變化不明顯，但在不同Na濃度下，CPI-STE-LUT體系的葉黃素乳化產(chǎn)率均高于CPI-LUT。

2.3 凍融穩(wěn)定性

反復(fù)凍融處理后，載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復(fù)合體系的平均粒徑如圖5所示。可以看出，凍融處理后CPI-STE-LUT、CPI-LUT復(fù)合體系的粒徑明顯增大，體系出現(xiàn)絮凝沉淀現(xiàn)象，且甜菊苷的加入并不能抵抗凍融處理對體系的破壞作用。如圖6所示，經(jīng)過凍融處理后，CPI-STE-LUT、CPI-LUT復(fù)合體系的葉黃素乳化產(chǎn)率較低，表明復(fù)合體系結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，不能有效負載葉黃素。凍融處理對復(fù)合體系的破壞力極大，因為體系在冷凍過程中，水快速結(jié)冰，造成體系體積變大而形成網(wǎng)狀冰晶結(jié)構(gòu)，且冰晶大小、分布都不均勻，不規(guī)則的冰晶會插入蛋白質(zhì)顆粒中，引起界面蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，從而破壞了構(gòu)建的多元復(fù)合體系顆粒結(jié)構(gòu)，進而使粒子間的相互作用力失衡，系統(tǒng)穩(wěn)定性下降；較大的冰晶顆粒會對復(fù)合體系顆粒造成擠壓，使它們粘連在一起，導(dǎo)致平均粒徑異常變大，其次，在解凍過程中，冰晶所構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)塌陷，冰晶融化、形成空隙，造成復(fù)合顆粒結(jié)構(gòu)被進一步破壞。研究發(fā)現(xiàn)，在凍融處理過程中，蛋白質(zhì)會發(fā)生變性，如物理、化學(xué)及膠束變化，這也會影響體系的穩(wěn)定性。

2.4 貯藏穩(wěn)定性

不同貯藏溫度及光照條件下載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復(fù)合體系的平均粒徑變化規(guī)律見圖7?？梢钥闯觯谫A藏過程中體系的平均粒徑呈現(xiàn)增大趨勢。貯藏溫度對體系平均粒徑的影響大于光照。在貯藏前5 d，體系粒徑增加得最快，而后趨于平緩。在4 ℃避光條件下，體系最為穩(wěn)定，平均粒徑基本沒有變化。

如圖8所示，隨著貯藏時間的延長，葉黃素保留率逐漸降低且在貯藏前的下降速度最快， 其后趨于平緩。在37 ℃光照條件下，葉黃素降解得最快，在貯藏30 d后，葉黃素保留率僅為10%左右，而在4 ℃避光條件下，葉黃素保留率達50%以上。伍敏暉等研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白負載姜黃色素在4 ℃貯藏 25 d 后，色素保留率僅為50%，在37 ℃貯藏30 d后不足5%。除25、37 ℃光照條件外，復(fù)合體系在貯藏末期無分層現(xiàn)象，仍保持澄清透明的橙黃色液體狀態(tài)。

2.5 模擬胃腸液中的穩(wěn)定性

如圖10所示，CPI-STE-LUT和CPI-LUT 2種復(fù)合體系在胃液中消化1.5 h時，葉黃素保留率均在90%以上。在模擬胃腸液的消化過程中，隨著消化時間的增加，葉黃素的保留率下降，模擬胃腸液消化1 h后，CPI-LUT復(fù)合體系中葉黃素的保留率下降得較快，但CPI-STE-LUT復(fù)合體系中葉黃素保留率下降得較緩慢；模擬胃腸液消化2～3 h時，CPI-STE-LUT復(fù)合體系的葉黃素保留率下降得較快；模擬胃腸液消化3 h后，葉黃素保留率的下降趨勢變緩；模擬胃腸液孵育7 h后，2種復(fù)合體系葉黃素的保留率在80%左右?？梢钥闯?，三元體系能夠有效負載葉黃素不被腸道中的消化酶降解，可能由于甜菊苷減少了蛋白質(zhì)表面基團與胃腸液中的消化酶反應(yīng)，能夠保持復(fù)合體系結(jié)構(gòu)的完整，從而減少葉黃素損失。

3 結(jié)論

載葉黃素的鷹嘴豆分離蛋白-甜菊苷復(fù)合體系是一種較好的營養(yǎng)補充劑，CPI-STE-LUT三元復(fù)合體系的耐鹽性及耐酸性高于CPI-LUT二元復(fù)合體系，且CPI-STE-LUT三元復(fù)合體系在中堿性及低鹽條件下的穩(wěn)定性良好。凍融處理會破壞復(fù)合納米顆粒的結(jié)構(gòu)，進而使復(fù)合體系失穩(wěn)。貯藏溫度對體系色澤的影響作用大于光照，適宜在4 ℃避光條件下貯藏。CPI-STE-LUT三元復(fù)合體系在胃腸液中的穩(wěn)定性高于CPI-LUT二元復(fù)合體系，其能更加有效的負載葉黃素，不被胃腸液中的消化酶降解。CPI-STE-LUT三元復(fù)合體系在不同功能食品與飲料中的應(yīng)用有待進一步展開。