類黃酮的生物活性作用及其在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

■李留學(xué) 趙玉超 蔣林樹* 屠 焰

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

隨著促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）被禁用，類黃酮成為國內(nèi)外研究替抗產(chǎn)品關(guān)注的熱點(diǎn)。類黃酮是一類天然植物的次生代謝產(chǎn)物，具有眾多生物活性作用，在飼料中添加類黃酮可提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能，增強(qiáng)其免疫力。類黃酮具有多種生物活性作用，如抑菌、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等，其廣泛的生物活性作用可能用于調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激—炎癥反應(yīng)—免疫調(diào)節(jié)三方聯(lián)動(dòng)反應(yīng)，減少非傳染性疾病的發(fā)生，維持動(dòng)物體內(nèi)自由基穩(wěn)態(tài)和免疫穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)機(jī)體健康。文章重點(diǎn)介紹了類黃酮的生物活性作用及其在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用，為類黃酮在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 類黃酮的分類

類黃酮（Flavonoids）是以苯并吡喃酮為基本母核的一類化合物，現(xiàn)在類黃酮泛指以兩個(gè)含有酚羥基的苯環(huán)（A 環(huán)和B 環(huán)）為基本骨架，通過中心三碳原子（通常會(huì)形成一個(gè)含氧雜環(huán)）相互連接形成的一類化合物。類黃酮在植物中以糖苷、苷元和甲基化衍生物的形式存在，其中糖苷是最主要的存在形式。根據(jù)三碳鏈（C3）的氧化程度、是否成環(huán)以及B 環(huán)連接位點(diǎn)等，可將類黃酮?jiǎng)澐譃辄S酮類、異黃酮類、查耳酮類、橙酮類、雙氫黃酮類等以及它們各自的衍生物。

2 類黃酮的生物活性

2.1 抗氧化

當(dāng)機(jī)體處于病理或外界有害刺激時(shí)，體內(nèi)的活性氧（ROS）產(chǎn)生速率大于機(jī)體抗氧化劑（內(nèi)源性）的清除速率，自由基就會(huì)在體內(nèi)大量積累。自由基具有高反應(yīng)性，會(huì)攻擊細(xì)胞膜上的脂質(zhì)、機(jī)體中的蛋白質(zhì)以及DNA，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變以及蛋白質(zhì)和DNA損傷。機(jī)體內(nèi)的抗氧化劑（內(nèi)源性）不足以清除累積的自由基時(shí)就需要從體外補(bǔ)充抗氧化劑（外源性）。類黃酮可通過酚羥基提供電子或氫原子與自由基發(fā)生反應(yīng)，從而終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其抗氧化作用主要包括：①抑制參與ROS 生成酶的活性（微粒體單加氧酶、P450 酶系、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、環(huán)氧化酶、線粒體琥珀氧化酶、黃嘌呤氧化酶、NADH 氧化酶等）；②螯合催化自由基產(chǎn)生的金屬離子（Fe3+、Cu2+）；③直接清除ROS；④保護(hù)和上調(diào)抗氧化系統(tǒng)；⑤促進(jìn)抗氧化物質(zhì)再生等。

類黃酮抗氧化活性的強(qiáng)弱與其結(jié)構(gòu)密不可分，一般認(rèn)為酚羥基的數(shù)量越多其抗氧化活性越強(qiáng)。Jeong等（2007）通過運(yùn)用DPPH 自由基溶液化學(xué)分析法對(duì)11種含有多種羥基的類黃酮抗氧化活性作出評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示木犀草素（3，5，7，3'，4'-OH）比槲皮素（5，7，3'，4'-OH）具有更高的抗氧化活性，但是，B環(huán)中酚羥基達(dá)到一定數(shù)量其抗氧化活性則不再增強(qiáng)。此外，羥基取代基的位置對(duì)其抗氧化活性也有顯著影響。類黃酮還可以通過增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）的活性，提高抗氧化酶清除自由基的能力，以此達(dá)到抗氧化效果。

2.2 抗炎

類黃酮主要是通過影響花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的代謝途徑、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑、炎性細(xì)胞因子分泌以及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮抗炎作用。在炎癥反應(yīng)中環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）可引起炎性細(xì)胞因子釋放，是炎癥反應(yīng)發(fā)生的起點(diǎn)，而且COX 和LOX 不僅與花生四烯酸的形成有關(guān)，還可催化花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎兀≒G）參與機(jī)體各種免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究表明，類黃酮如木犀草素、兒茶素、沒食子酸兒茶素和槲皮素等可以通過抑制COX 和LOX 的活性，影響前列 腺 素E2（PGE2）、白 三 烯（LTB）和 血 栓 素A2（TXA2）的前體物質(zhì)AA 的釋放進(jìn)而阻斷炎癥鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。類黃酮還可以通過影響絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮抗炎作用。Kang 等（2011）通過阻斷LPS 刺激小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞(RAW264.7)的NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路，檢測類黃酮（橙皮苷、川陳皮素和柚皮苷）在抑制促炎介質(zhì)方面的作用，結(jié)果表明，類黃酮通過抑制c-JunN 氨基末端激酶（JNK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的磷酸化，進(jìn)而抑制MAPK 信號(hào)通路的活化，發(fā)揮抗炎作用。

類黃酮（如芹菜素、柚皮素、花青素、木犀草素和槲皮素等）還可以通過抑制白細(xì)胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等促炎因子的表達(dá)抑制或阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生。Zhang等（2020）選用169名血脂異常的受試者隨機(jī)分為6組，用于評(píng)估花青素在體內(nèi)對(duì)IL-6和TNF-α的影響，結(jié)果表明，受試者補(bǔ)充80 mg∕d花青素后，可顯著降低12 周時(shí)血清中IL-6 和TNF-α的含量，證明了花青素具有減輕炎癥反應(yīng)的作用。很多與炎癥反應(yīng)啟動(dòng)有關(guān)的炎性因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）以及誘生型一氧化氮合酶（iNOS）和環(huán)氧合酶（COX-2）等的轉(zhuǎn)錄受到NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控。機(jī)體內(nèi)高濃度的ROS不僅可以通過NF-κB信號(hào)通路上調(diào)促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-a）的表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)而且其還可與核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起與炎癥啟動(dòng)有關(guān)的COX 和LOX 基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。類黃酮還可通過抑制NF-κB信號(hào)通路中參與ROS生成酶的表達(dá)，減少機(jī)體ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

2.3 抗菌

類黃酮具有廣泛抗菌性，其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、李斯特菌和沙門氏菌等具有強(qiáng)烈抑制作用。類黃酮的抗菌活性與母核上羥基的數(shù)量和位置有關(guān)，特別是C-3、C-5和C-7上羥基取代基具有較強(qiáng)抑菌活性，而芳環(huán)甲基化則降低其抑菌活性。其次，有研究表明，類黃酮含有疏水取代基（烷基氨基鏈、烷基鏈、異戊二烯基、含氮或氧的雜環(huán)部分）或B環(huán)發(fā)生鹵化現(xiàn)象時(shí)會(huì)增強(qiáng)其抑菌活性。類黃酮主要是通過抑制或直接殺死細(xì)菌和減弱細(xì)菌毒性方面發(fā)揮抗菌作用，其發(fā)揮直接抗菌作用主要依賴于以下3 種機(jī)制：①抑制菌體核酸合成，類黃酮通過DNA 促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ干擾拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，導(dǎo)致細(xì)菌核酸合成受阻；②抑制菌體細(xì)胞膜功能，類黃酮通過增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性或減弱其流動(dòng)性破壞菌體胞漿膜結(jié)構(gòu)；③抑制菌體能量代謝，類黃酮可與三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）過程中的關(guān)鍵酶蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）結(jié)合導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和酶活性降低，從而抑制需氧菌的三羧酸循環(huán)，阻斷糖代謝過程，導(dǎo)致細(xì)菌體腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide reduced，NADH）合成受阻，進(jìn)而抑制菌體呼吸代謝過程，導(dǎo)致細(xì)菌生長受阻。

類黃酮還可以通過直接抑制菌體NADPH-細(xì)胞色素C 還原酶（NADPH-cytochrome C Reductase）的活性，阻礙菌體呼吸鏈電子傳遞，抑制呼吸代謝和能量代謝過程，抑制菌體生長。在減弱細(xì)菌毒素方面，類黃酮能抑制與細(xì)菌感染性相關(guān)的分選酶和脲酶活性，中和細(xì)菌毒素，抑制毒力因子釋放，發(fā)揮抗菌功效。

2.4 抗腫瘤

類黃酮因其具有獨(dú)特的生物活性，可作為抗腫瘤藥物的潛在候選物。其可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用。類黃酮通過上調(diào)促凋亡蛋白（Bax，Bad）和下調(diào)抗凋亡蛋白（Bcl-2，Bcl-6）的表達(dá)，引起由線粒體調(diào)節(jié)的內(nèi)部凋亡途徑啟動(dòng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并可通過促進(jìn)細(xì)胞色素C 的釋放誘導(dǎo)凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。類黃酮可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白（cyclinD，cyclinE）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinase, CDKs）影響腫瘤細(xì)胞分裂周期，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞停滯于G0或G1期，從而阻止其有絲分裂和DNA 復(fù)制過程，抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖。端粒酶是一種核糖核蛋白（RNP），在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但在惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)率卻可達(dá)80%以上，類黃酮可通過抑制端粒酶活性使其在腫瘤細(xì)胞中不發(fā)生表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。癌細(xì)胞不受控制地增殖、侵襲和遷移需要新生血管不斷為其提供營養(yǎng)物質(zhì)。有研究表明，類黃酮可以抑制腫瘤血管上皮的生長阻止新生血管的形成，阻止腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。

3 類黃酮在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 類黃酮對(duì)反芻動(dòng)物生長性能的影響

類黃酮具有眾多生物活性作用，在飼料中添加類黃酮可提高動(dòng)物生長性能，增強(qiáng)其免疫力。類黃酮對(duì)反芻動(dòng)物生長性能的影響主要體現(xiàn)在提高反芻動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率和日增重方面，從而促進(jìn)其生長。有研究表明，在荷斯坦奶牛日糧中添加適量苜蓿黃酮能提高奶牛采食量并對(duì)其產(chǎn)奶量有一定促進(jìn)作用，其中以添加60 g 苜蓿黃酮的效果最佳。陳圣陽等（2018）采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，分別在肉羊基礎(chǔ)日糧中添加0、11、22、33 mg∕kg 沙蔥黃酮研究沙蔥黃酮對(duì)肉羊生長性能的影響，結(jié)果表明，沙蔥黃酮可顯著提高肉羊的平均日采食量和降低料重比，其中以添加22 mg∕kg沙蔥黃酮組的平均日采食量最高，33 mg∕kg沙蔥黃酮組的料重比最低。劉艷豐（2019）試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿勒泰羊飼喂沙棘葉和沙棘黃酮，在不改變瘤胃發(fā)酵模式下，沙棘葉和沙棘黃酮可通過提高瘤胃VFA和降低NH3-N 濃度，促進(jìn)瘤胃代謝和微生物蛋白合成，提高阿勒泰羊的采食量和日增重，并可降低其脂肪率和腹脂率；通過對(duì)其血清生化指標(biāo)分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)沙棘葉和沙棘葉黃酮還可通過增加總蛋白和降低血清尿素氮促進(jìn)阿勒泰羊生長。Kong 等（2019）在研究桑葉黃酮和熱帶假絲酵母單獨(dú)或聯(lián)合添加對(duì)斷奶前后犢牛瘤胃發(fā)酵特性的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)添加桑葉黃酮時(shí)，犢牛在斷奶后和整個(gè)斷奶期間的平均日增重和飼料效率均顯著提高。另有研究發(fā)現(xiàn)，在東北細(xì)毛羊日糧中添加大豆黃酮可顯著提高其采食量和日增重，并可顯著提高羊只屠宰率和胴體重。楊春濤（2016）在研究日糧中添加桑葉黃酮對(duì)斷奶前后犢牛生長的影響中發(fā)現(xiàn)，在斷奶犢牛日糧中添加桑葉黃酮可提高犢牛免疫力，降低腹瀉率，提高飼料轉(zhuǎn)化率，提高犢牛的日增重。由此可見，日糧中添加適量類黃酮可通過改變瘤胃發(fā)酵類型，提高機(jī)體免疫力和采食量進(jìn)而間接促進(jìn)反芻動(dòng)物的生長。

3.2 類黃酮對(duì)反芻動(dòng)物泌乳性能和乳品質(zhì)的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，在荷斯坦奶牛日糧中添加大豆異黃酮能顯著提高產(chǎn)奶量，其中，添加30 mg∕kg 大豆異黃酮的試驗(yàn)組在第42天的產(chǎn)奶量與對(duì)照組相比提高了21.8%，且對(duì)乳蛋白和乳脂率無影響。另有研究發(fā)現(xiàn)，不同水平的大豆異黃酮可提高泌乳早期荷斯坦奶牛的平均日產(chǎn)奶量，且添加劑量為30 mg∕kg時(shí)可提高乳蛋白含量，這與上述試驗(yàn)在同一添加劑量時(shí)對(duì)乳蛋白的影響不一致，可能是由于兩組試驗(yàn)選擇的奶牛泌乳期不同造成的。大豆黃酮不僅能夠提高奶牛產(chǎn)奶量，還能顯著提高牛奶中乳脂、乳蛋白和乳糖的含量，進(jìn)而提高乳品質(zhì)。Li 等（2020）在探究日糧中添加桑葉黃酮對(duì)水牛產(chǎn)奶量的影響中發(fā)現(xiàn)，添加45 g∕d的桑葉黃酮可顯著提高水牛的日產(chǎn)奶量、乳蛋白和乳脂率。Cui 等（2015）分別在荷斯坦奶牛日糧中添加0、1.5、3.0、4.5 mg∕kg 蘆丁，探究其對(duì)奶牛泌乳性能的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，添加3.0 mg∕kg 和4.5 mg∕kg 蘆丁的奶牛產(chǎn)奶量顯著高于對(duì)照組，分別提高10.06%和3.37%，但乳蛋白、乳糖和乳無脂固形物含量在各組間差異不顯著。另有研究發(fā)現(xiàn)，一些類黃酮對(duì)反芻動(dòng)物產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)無影響。Zhan 等（2017）采用4×4 拉丁方設(shè)計(jì)探究苜蓿黃酮類化合物對(duì)奶牛生產(chǎn)性能和瘤胃發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，苜蓿黃酮對(duì)產(chǎn)奶量、乳中脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖含量無影響，但隨著苜蓿黃酮添加量的增加，乳中總固形物含量呈線性下降。Dschaak 等（2017）在研究堅(jiān)木單寧提取物（CTE）對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵和泌乳性能的影響試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在日糧中添加CTE 對(duì)泌乳奶牛產(chǎn)奶量和乳成分沒有影響。

3.3 類黃酮對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵的影響

瘤胃是反芻動(dòng)物的天然發(fā)酵罐，瘤胃中的微生物與反芻動(dòng)物存在一種共生關(guān)系，反芻動(dòng)物為瘤胃微生物提供適宜的生存環(huán)境，而瘤胃微生物則通過降解飼料中碳水化合物等物質(zhì)產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA）和微生物蛋白，為反芻動(dòng)物提供能量和蛋白質(zhì)來源。據(jù)研究表明，反芻動(dòng)物通過瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生VFA 能為機(jī)體提供70%～80%的能量，產(chǎn)生的微生物蛋白占小腸可吸收蛋白的50%～80%。在體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在底物中添加1.0 mmol∕L和2.0 mmol∕L槲皮素顯著提高了底物在24 h內(nèi)的總產(chǎn)氣量；添加1 mmol∕L槲皮素顯著提高了發(fā)酵液中乙酸和丁酸濃度；添加2 mmol∕L槲皮素顯著提高了發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸及總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）濃度。包玲玲等（2015）研究表明，日糧中添加沙蔥黃酮類化合物能顯著提高瘤胃產(chǎn)氣量并在添加劑量為0.032 mg 時(shí)提高幅度最大。柚皮苷的體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柚皮苷提高了發(fā)酵液24 h內(nèi)的總產(chǎn)氣量、TVFA 濃度以及乙酸和丁酸的比例，降低了戊酸比例。反芻動(dòng)物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊日糧中分別添加0、0.1%、0.2%和0.4%苜蓿黃酮能減小綿羊24 h內(nèi)瘤胃pH的變化范圍，增加VFA 的變化幅度，提高TVFA 濃度；在添加0.2%和0.4%苜蓿黃酮時(shí)增加了綿羊氨態(tài)氮濃度，表明苜蓿黃酮能夠改善綿羊瘤胃發(fā)酵功能。包玲玲（2015）研究表明，日糧中添加沙蔥黃酮類化合物降低了氨態(tài)氮濃度，提高了菌體蛋白的合成，顯著提高了TVFA 的濃度，降低了乙酸和丙酸的比例。以上體內(nèi)外研究表明，類黃酮可改變瘤胃發(fā)酵，主要體現(xiàn)在影響揮發(fā)性脂肪酸的比例和降低氨態(tài)氮濃度及產(chǎn)氣量方面。

4 小結(jié)

類黃酮以其來源廣泛、無毒、無副作用等特點(diǎn)和多種生物活性優(yōu)勢可作為一種具有廣闊應(yīng)用前景的飼料添加劑應(yīng)用到反芻動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中。但目前類黃酮在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用仍存在許多問題。首先，雖然類黃酮種類眾多，在自然界中的數(shù)量高達(dá)9 000 多種，但其在反芻動(dòng)物中的研究甚少，且不同類黃酮在同一反芻動(dòng)物中或同一類黃酮在不同反芻動(dòng)物中有不同的最佳添加劑量，不能形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。其次，雖然對(duì)類黃酮的生物活性作用已有了較多研究，但其在反芻動(dòng)物機(jī)體中的作用機(jī)制和發(fā)揮活性作用的主效因子尚不清楚，不能科學(xué)闡釋其在反芻動(dòng)物體內(nèi)是如何發(fā)揮作用進(jìn)而提高生長性能。所以，后期可從類黃酮的開發(fā)、單一類黃酮化合物在反芻動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的吸收、分布、代謝方面出發(fā)，深入探究其在機(jī)體內(nèi)的代謝途徑與機(jī)制及發(fā)揮活性作用的主效因子，為類黃酮在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。