巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物安全性評(píng)價(jià)

■潘 瓊 王余磊 宋春蓮 卜仕金 舒相華*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

中獸藥是中國(guó)傳統(tǒng)獸醫(yī)學(xué)的重要組成部分，歷史悠久[1]。在“限抗”與病毒性疫病肆虐的雙重壓力下，中獸藥作為新興產(chǎn)業(yè)受到越來越多的重視，主要是因?yàn)橹兴幘哂卸喾轿徽{(diào)節(jié)和治療作用，可提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力和抗應(yīng)激能力，中長(zhǎng)期使用僅有低毒副作用，藥物殘留少，能促進(jìn)生產(chǎn)性能發(fā)揮的同時(shí)滿足日益嚴(yán)格的食品安全需求[2]。

巖陀為虎耳草科鬼燈檠屬植物羽葉鬼燈檠（Rodgersia pinnata franch.）或西南鬼燈檠（Rodgersia sumbucifolia hemsl.）的干燥根莖[3]，用于治療骨折、風(fēng)濕痛、消化不良等疾病[4]。黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[5]。已有研究表明巖陀黃酮對(duì)大鼠的免疫功能有促進(jìn)作用[6]。黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）為唇形科植物黃芩的干燥根，黃芩多糖是黃芩黃酮提取過程中的副產(chǎn)物，比較容易獲得，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖和血脂、抗氧化性、抑菌抗炎和調(diào)節(jié)免疫等作用[7]。本試驗(yàn)通過急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)對(duì)巖陀黃酮和黃芩多糖復(fù)合物的毒性進(jìn)行了初步研究，為巖陀黃酮和黃芩多糖聯(lián)用在中獸醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康Wistar 大鼠，體重180～200 g；ICR 小鼠雄性，體重18～20 g，均由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0007，試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2017-0044。試驗(yàn)期間大、小鼠自由采食和飲水。試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，灌胃前12 h禁食不禁水。

1.1.2 受試藥物

巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物：巖陀粗黃酮含量為41.1%；黃芩粗多糖含量為40.3%，兩者按1∶1混合制成淡黃色粉末復(fù)合物，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供，4 ℃保存。

1.1.3 試驗(yàn)菌株

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames text）選用組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100 和TA102，由MOLTOX 公司提供。菌株儲(chǔ)存于-80 ℃。試驗(yàn)菌于37 ℃水浴振蕩培養(yǎng)24 h，4 ℃保存。菌株均經(jīng)過生物學(xué)鑒定合格后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.4 試驗(yàn)試劑

標(biāo)準(zhǔn)誘變劑：疊氮化鈉、2-乙酰氨基芴、敵克松、甲基磺酸甲酯均為分析純；環(huán)磷酰胺（20110703），山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H14023686；多氯聯(lián)苯（20150404），山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H14023686。

其他試劑：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、1%羧甲基纖維素鈉、二甲基亞砜、1%伊紅染色液、氯化鉀、甲醇（分析純）、PBS緩沖溶液等。

1.1.5 試驗(yàn)儀器

D98-9052B-2 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、Centrifuge 5415R 高速冷凍離心機(jī)、電熱恒溫水浴箱、菌落計(jì)數(shù)器、萬分之一電子天平、CX2型OLYMPUS顯微鏡及灌胃針頭等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)分組：2 個(gè)試驗(yàn)組，分別選擇Wistar 大鼠雌、雄各10 只，雌雄分籠飼養(yǎng)。大鼠禁食12 h 后分別稱體重、編號(hào)。

染毒和觀察：在4 h內(nèi)經(jīng)口灌服巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物溶液數(shù)次進(jìn)行染毒，染毒劑量達(dá)到9 g∕kg·BW。攻毒后分別在30 min、2 h、4 h進(jìn)行觀察，之后每天觀察1 次，連續(xù)14 d。主要觀察大鼠采食飲水情況、有無中毒癥狀及毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失的時(shí)間、中毒表現(xiàn)和死亡時(shí)間。14 d結(jié)束后處死存活大鼠，進(jìn)行病理變化檢查。

1.2.2 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

增菌培養(yǎng)及生物學(xué)特性鑒定：將冷凍保存的TA97、TA98、TA100 和TA102 菌株培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃，100 r∕min 培養(yǎng)10 h。細(xì)菌濃度大于2×109CFU∕mL。試驗(yàn)前采用鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)標(biāo)準(zhǔn)判斷法[8]進(jìn)行菌株的生物學(xué)特性和自發(fā)回變菌落數(shù)的檢測(cè)，符合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S9 的制備：150～200 g Wistar 大鼠3 只，采用多氯聯(lián)苯作為誘導(dǎo)劑，按500 mg∕kg·BW劑量腹腔注射后第5天脫頸處死，處死前12 h 禁食。無菌操作取出肝臟，除去結(jié)締組織，預(yù)冷無菌0.15 mol∕L 氯化鉀溶液潤(rùn)洗肝臟后，每克肝臟加入0.15 mol∕L 氯化鉀溶液3 mL。冰浴勻漿后4 ℃，9 000 g 離心10 min，取上清液分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?，即為S9。

陽性對(duì)照設(shè)定：（+S9 組別）TA97、TA98、TA100、TA102菌株陽性對(duì)照均為2-乙酰氨基芴（2-AF）；（-S9組）TA97、TA98 菌株為5 mg∕mL 敵克松，TA100 菌株為疊氮鈉，TA102菌株為甲基磺酸甲酯。

受試藥物的配制：采用平板摻入法。準(zhǔn)確稱取受試藥物1.000 g，高壓滅菌后加無菌二甲基亞砜（DMSO）配制為濃度100 mg∕mL 的母液，取適量分別稀釋為10.000、2.000、0.400、0.080、0.016 mg∕皿。

試驗(yàn)步驟：取2 mL 45 ℃水浴保溫的頂層培養(yǎng)基，依次加入受試藥物溶液0.1 mL，測(cè)試菌液0.1 mL（+S9 組同時(shí)加入10% S9 混合液0.5 mL），迅速混勻，倒在底層培養(yǎng)基上，輕柔晃動(dòng)使頂層培養(yǎng)基均勻分布，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果，每組8個(gè)重復(fù)。若第一次平板摻入法結(jié)果為陰性，重復(fù)一次試驗(yàn)；若第一次平板摻入法結(jié)果為陽性，重復(fù)兩次試驗(yàn)。

1.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

動(dòng)物分組及染毒：將50 只雄性小鼠隨機(jī)均分為高（2 500 mg∕kg·BW）、中（1 250 mg∕kg·BW）、低（625 mg∕kg·BW）復(fù)合物劑量組、陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺40 mg∕kg·BW）和陰性對(duì)照組（純化水），5 個(gè)處理組。使用1%羧甲基纖維素鈉對(duì)復(fù)合物和環(huán)磷酰胺進(jìn)行梯度稀釋，按相同體積不同劑量進(jìn)行灌胃，陰性對(duì)照給予相同體積純化水。連續(xù)染毒5 d，第35天取材[9]。

染毒后取材：脫頸法處死小鼠，取出兩側(cè)副睪，在無菌PBS中用眼科剪將副睪縱向剪2刀，靜止3 min，輕輕搖動(dòng)，用4層擦鏡紙過濾去除組織碎片，吸濾液至載玻片涂片，自然風(fēng)干后用甲醇固定10 min，待干燥后用1%伊紅染色1 h，以常水沖洗干凈，自然風(fēng)干后鏡檢[10]。

1.2.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

分組：50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。復(fù)合藥物組設(shè)高、中、低三個(gè)劑量組，即2 500 mg∕kg·BW、1 250 mg∕kg·BW、625mg∕kg·BW，陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺）和陰性對(duì)照組（1%羧甲基纖維素鈉）。

染毒[11]：1%羧甲基纖維素鈉梯度稀釋受試復(fù)合物，按不同濃度、相同體積灌胃，現(xiàn)用現(xiàn)配。陽性對(duì)照按0.01 mL∕g·BW 腹腔注射環(huán)磷酰胺，陰性對(duì)照按0.01 mL∕g·BW口服1%羧甲基纖維素鈉。30 h內(nèi)給藥兩次，每次給藥間隔24 h，第36 h取胸骨骨髓進(jìn)行制片。

觀察：每只小鼠制2 張片，雙盲法在油鏡下選擇細(xì)胞分散好、形態(tài)完整及染色良好的部位，進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE）含微核嗜多染紅細(xì)胞數(shù)（MN）及成熟紅細(xì)胞（RBC）數(shù)，求出PCE∕RBC、MN∕PCE[12]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)：菌株回變菌落數(shù)表述為“（）∕皿”，受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照組的2 倍以上，且具有劑量反應(yīng)關(guān)系的判為陽性，達(dá)不到2倍以上則判定為合格。

小鼠精子畸形試驗(yàn)精子畸形率按X2檢驗(yàn)（α=0.05）作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，評(píng)價(jià)精子畸形陽性的標(biāo)準(zhǔn)為畸形率至少為陰性對(duì)照組的倍量或經(jīng)統(tǒng)計(jì)有顯著意義，并有劑量反應(yīng)關(guān)系。

精子畸形率（%）=[畸形精子數(shù)∕（正常精子檢測(cè)數(shù)+畸形精子數(shù)）×100

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)：每一試驗(yàn)動(dòng)物作為一個(gè)觀察組，每一組動(dòng)物雌雄合并計(jì)算該組微核數(shù)的均值，如一組動(dòng)物內(nèi)雌雄之間微核有明顯的性別差異時(shí)，則分別計(jì)算。分析測(cè)試結(jié)果用“”表示，微核發(fā)生率按X2檢驗(yàn)（α=0.05）作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)（見表1）

由表1可知，觀察期內(nèi)所有大鼠臨床表現(xiàn)正常，無明顯神經(jīng)癥狀，皮膚和被毛無異常，且采食、飲水和排便等正常，未表現(xiàn)中毒反應(yīng)，第15天所有大鼠均存活。試驗(yàn)結(jié)束后剖檢20只大鼠，眼觀病理學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化。結(jié)果表明，巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物對(duì)大鼠的經(jīng)口染毒半致死量（LD50）大于5 g∕kg·BW，依據(jù)國(guó)標(biāo)GB 15193.3—2014劑量分類表，屬于實(shí)際無毒。

表1 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)[13]（見表2）

由表2可知，兩次鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果基本一致。巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物每皿劑量在10～0.016 mg范圍內(nèi)，4種試驗(yàn)用鼠傷寒沙門氏菌株菌苔生長(zhǎng)正常，各菌株反應(yīng)均為合格；有或無代謝活化系統(tǒng)（S9）時(shí)，每皿平均回變菌落數(shù)與陽性誘變劑組比較差異顯著，與對(duì)照（DMSO）比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未見劑量反應(yīng)關(guān)系，結(jié)果為合格。

表2 巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物的鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果（）

表2 巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物的鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果（）

項(xiàng)目第1次第2次組別(mg∕皿)10.000 2.000 0.400 0.080 0.016 DMSO陽性10.000 2.000 0.400 0.080 0.016 DMSO陽性TA97-S9 109.67±13.58 116.33±32.93 130.67±39.80 104.67±18.18 105.67±15.57 125.00±28.58 2 121.67±59.48**102.00±7.81 125.67±36.00 106.00±26.00 131.67±37.11 106.33±14.01 106.00±10.82 2 039.67±37.55**敵克松（50 μg）+S9 148.67±19.14 115.67±13.43 118.67±15.04 165.00±25.98 147.00±10.00 117.33±33.47 1 329.33±171.16**134.67±41.67 145.00±40.63 105.67±15.04 120.00±38.57 119.00±8.72 125.00±29.14 1 280.33±31.90**2-AF（10 μg）TA98-S9 40.00±9.17 42.00±7.55 40.00±8.89 42.67±8.39 37.67±6.66 40.00±7.00 1 074.67±33.01**44.00±7.21 39.00±3.00 42.67±11.02 35.00±6.25 44.33±4.04 37.33±3.06 1 125.67±139.89**敵克松（50 μg）+S9 43.00±2.65 34.00±2.65 41.33±10.02 33.67±4.04 43.67±7.77 38.33±7.37 5 101.33±119.78**38.00±6.93 31.67±1.53 45.00±5.57 37.67±7.51 37.00±9.54 40.00±8.54 5 036.67±187.03**2-AF（10 μg）

結(jié)果表明：受試藥物對(duì)TA97、TA98、TA100 和TA102 四種試驗(yàn)用鼠傷寒沙門氏菌株在加S9 和不加S9試驗(yàn)中結(jié)果均為陰性，可見本試驗(yàn)條件下巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌無致突變性。

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)（見表3）

由表3 可知，巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物3 個(gè)劑量組的精子畸形率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與陰性對(duì)照組比較差異不顯著性（P＞0.05），陽性對(duì)照組與3 個(gè)給藥劑量組、陰性對(duì)照組比較差異均極顯著（P＜0.01）。巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物致小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性，可判斷該復(fù)合物不具有生殖遺傳毒性。

表3 巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率影響(n=10）

2.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)分析（見表4）

表2（續(xù)） 巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物的鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果（）

表2（續(xù)） 巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物的鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果（）

注：“**”表示各試驗(yàn)組與陽性對(duì)照組比較P＜0.01，差異極顯著。

項(xiàng)目第1次第2次組別(mg∕皿)10.000 2.000 0.400 0.080 0.016 DMSO陽性10.000 2.000 0.400 0.080 0.016 DMSO陽性TA100-S9 121.33±2.31 140.33±34.36 131.33±7.51 122.67±3.79 147.33±35.73 144.67±35.22 2 657.67±82.28**162.33±27.61 145.33±30.83 125.67±6.03 172.67±14.74 168.33±41.93 162.00±24.98 2 652.00±189.90**疊氮鈉（1.5 μg）+S9 177.00±21.70 149.67±5.86 166.33±16.92 162.00±11.14 151.00±26.51 177.33±7.37 2 579.33±98.72**158.33±30.66 150.00±34.66 167.00±32.51 147.67±14.98 161.00±34.22 163.67±36.00 2 678.00±23.52**2-AF（10 μg）TA102-S9 258.67±20.13 276.00±34.18 277.67±38.73 285.00±37.80 277.33±9.45 264.33±16.01 5 540.00±84.93**264.33±18.88 286.33±16.50 263.33±19.43 266.67±23.09 283.00±16.09 273.33±23.18 5 594.00±17.52**甲基磺酸甲酯（1.0 μL）+S9 270.00±30.27 281.33±17.62 275.33±32.62 303.33±20.82 244.67±2.31 270.33±26.51 551.33±44.38**278.67±22.05 275.00±28.58 261.00±30.51 260.67±9.02 265.00±22.65 273.00±7.00 557.33±21.73**2-AF（10 μg）

由表4可知，巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物高、中、低三個(gè)劑量組致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率與陰性對(duì)照組相比，差異無顯著性（P＞0.05），與陽性對(duì)照組相比差異有顯著性（P＜0.01），可判斷巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物不具有遺傳毒性。

表4 巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物對(duì)動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率（n=10）

3 討論

中獸藥是我國(guó)傳統(tǒng)獸醫(yī)學(xué)重要組成部分，被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療畜禽疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料報(bào)酬。巖陀富含黃酮類成分，可通過乙醇提取。研究表明巖陀乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌等多種細(xì)菌有良好抑制效果[13-14]；巖陀乙醇浸膏在抑制病毒試驗(yàn)中不僅能抑滅DNA 病毒，而且能抑制RNA病毒[15]；巖陀黃酮在大鼠試驗(yàn)中能夠顯著緩解由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫抑制情況[6]。黃芩多糖是提取黃芩苷的副產(chǎn)物，比較容易獲得[16]。黃芩多糖具有抗氧化、抗炎活性，飼料中添加一定比例的黃芩多糖能夠顯著提升肉仔雞的體重、降低料重比、提高仔雞生長(zhǎng)性能，還能提高仔雞免疫功能[17]。中藥的聯(lián)用可以提高藥效并提升動(dòng)物綜合免疫力。劉偉等[18]研究表明益母草、野菊花復(fù)方水煎液的降壓作用比單方水煎液降壓作用明顯。張雪等[19]研究表明燈盞花黃酮和馬蹄香多糖復(fù)合物可刺激仔豬淋巴細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)免疫抑制大鼠的免疫功能。所以本試驗(yàn)認(rèn)為巖陀黃酮和黃芩多糖提取復(fù)合物具有獸藥開發(fā)利用價(jià)值。

前人對(duì)巖陀黃酮和黃芩多糖的功效研究已經(jīng)非常深入，但缺乏巖陀黃酮和黃芩多糖提取復(fù)合物的安全性研究。為了確定在飼料中添加藥用植物產(chǎn)品的安全性，必須利用各種試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行系統(tǒng)的毒理學(xué)研究，以預(yù)測(cè)其毒性，并為選擇動(dòng)物安全劑量設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。

急性毒性試驗(yàn)主要測(cè)定LD50，觀察急性中毒表現(xiàn)并初步估計(jì)試驗(yàn)藥物對(duì)人類或動(dòng)物的危害性。鄢鵬飛等[20]通過急性毒性試驗(yàn)確定富硒油菜粉LD50為11.75 g∕kg·BW，確定其為實(shí)際無毒物質(zhì)。本試驗(yàn)通過巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物L(fēng)D50大于10 g∕kg·BW，判定其為實(shí)際無毒物質(zhì)，但未確定實(shí)際LD50，應(yīng)在急性毒性試驗(yàn)中設(shè)置不同濃度，為巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物的安全劑量范圍提供有效參考數(shù)據(jù)。

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)用于鑒定可產(chǎn)生基因損傷導(dǎo)致基因突變的物質(zhì)，其敏感性、特異性、準(zhǔn)確性較高[21]；精子畸形試驗(yàn)可識(shí)別誘發(fā)精子致病功能障礙的化學(xué)物質(zhì)，靈敏可靠；微核試驗(yàn)可檢測(cè)到誘變物質(zhì)改變細(xì)胞分裂過程中染色體的分布[22]?；貜?fù)突變?cè)囼?yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)結(jié)果陰性，表明巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物在本試驗(yàn)條件下無遺傳毒性。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物屬實(shí)際無毒物質(zhì)，在2 500 mg∕kg·BW 內(nèi)試驗(yàn)動(dòng)物未出現(xiàn)急性毒性和遺傳毒性反應(yīng)，可初步推斷中藥巖陀黃酮與黃芩多糖復(fù)合物在2 500 mg∕kg·BW范圍內(nèi)作為中獸藥安全性較好。