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    硫酸解交聯(lián)-考馬斯亮藍法測定醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中蛋白質(zhì)的含量

    2022-03-02 02:54:36郭利娟劉愛娟孫興霞
    理化檢驗-化學分冊 2022年2期
    關鍵詞:馬斯亮透明質(zhì)醫(yī)用

    郭利娟,劉愛娟,孫興霞,劉 葉,陳 方,沈 永

    (1.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院,濟南 250101;2.國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室,濟南 250101;3.山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室,濟南 250101)

    透明質(zhì)酸鈉是由D-葡萄糖醛酸和N-乙?;?D-葡萄糖胺通過β-(1-3)糖苷鍵連接而成的雙糖重復結(jié)構(gòu)單元組成的線性黏多糖類化合物[1]。透明質(zhì)酸廣泛分布在人體各部位,被稱為理想的天然保濕因子。由于具有優(yōu)良的生物相容性和填充效果,透明質(zhì)酸鈉被廣泛應用于美容整形領域[2-5]。透明質(zhì)酸鈉在進入人體后會被透明質(zhì)酸酶迅速降解,從而影響其臨床使用效果[6-7]。交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠是透明質(zhì)酸經(jīng)交聯(lián)劑[一般采用1,4-丁二醇二環(huán)氧甘油醚(BDDE)]交聯(lián)修飾得到的具有三維立體結(jié)構(gòu)的高分子凝膠,不僅生物相容性較好,且較透明質(zhì)酸鈉有更長的降解周期,可作為植入性醫(yī)療產(chǎn)品,用于鼻唇溝、淚溝、蘋果肌、額頭等部位的填補[8-11]。

    醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中不僅含有交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉(14~25 g·L-1),還包含添加劑(鹽酸利多卡因、游離透明質(zhì)酸等),屬于三類醫(yī)療器械用品。其重要原料透明質(zhì)酸鈉的制備方法包括動物組織提取法或微生物發(fā)酵法[12]。在制備過程中,可能產(chǎn)生動物源性蛋白質(zhì)及微生物菌體蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的殘留,如果將這類產(chǎn)品直接注入人體真皮,將會引起排異反應,危害人體健康安全,因此需要對醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠中蛋白質(zhì)含量進行監(jiān)控。

    常用的蛋白質(zhì)含量的測定方法有凱氏定氮法、福林酚法、雙縮脲法、2,2′-聯(lián)喹啉-4,4′-二羧酸法、考馬斯亮藍法、紫外-可見分光光度法等[13]。透明質(zhì)酸鈉中蛋白質(zhì)含量的測定方法有福林酚法和考馬斯亮藍法,相關標準有YY/T 1571-2017《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 透明質(zhì)酸鈉》和YY/T 0308-2015《醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠》,其中福林酚法為常用方法。福林酚法的檢測原理:在堿性介質(zhì)中,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的肽鍵會與Cu2+絡合形成蛋白質(zhì)-銅復合物,該復合物可與酚試劑形成藍色顯色體系,同時酚試劑中的磷鎢酸-磷鉬酸可與蛋白質(zhì)中含有酚羥基的氨基酸如絡氨酸、色氨酸、半胱氨酸反應形成藍色顯色體系,在750 nm 處有最大吸收,在一定條件下,吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比,以此測定蛋白質(zhì)含量,但該反應體系的干擾因素較多,如還原性物質(zhì)、其他酚類物質(zhì)、糖類物質(zhì)等??捡R斯亮藍法檢測原理:在酸性介質(zhì)中,考馬斯亮藍G-250可與蛋白質(zhì)中含堿性基團的氨基酸和芳香族氨基酸結(jié)合形成顯色體系,在595 nm 處有最大吸收,在一定條件下,吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比,以此測定蛋白質(zhì)含量,該反應體系的干擾因素較福林酚法的少[13]。醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠為高分子聚合物,難溶于水,不能直接采用YY/T 1571-2017和YY/T 0308-2015中所述方法測定,而相關方法還未見報道。

    本工作依據(jù)YY/T 1571-2017 和YY/T 0308-2015,以牛血清白蛋白作為定量分析的標準品制作標準曲線,用硫酸溶液將醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉解交聯(lián),對比福林酚法和考馬斯亮藍法測定結(jié)果的差異,選擇考馬斯亮藍法測定醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中的蛋白質(zhì)含量,可為相關產(chǎn)品的質(zhì)量控制和監(jiān)管提供方法指導。

    1 試驗部分

    1.1 儀器與試劑

    UV-2550 型紫外-可見分光光度計;Milli-Q Advantage A10型超純水機。

    牛血清白蛋白標準儲備溶液:102.17 mg·L-1(以純度折算),取10.32 mg牛血清白蛋白,用水溶解后定容至100 mL容量瓶中。

    牛血清白蛋白標準溶液:10.22 mg·L-1,取適量牛血清白蛋白標準儲備溶液,用水稀釋,配制成10.22 mg·L-1牛血清白蛋白標準溶液。

    牛血清白蛋白標準溶液系列:取0,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00 mL牛血清白蛋白標準溶液,分別加1.0,0.80,0.60,0.40,0.20,0 mL水,配制成0,2.04,4.09,6.13,8.17,10.22 mg·L-1的牛血清白蛋白標準溶液系列。

    考馬斯亮藍G-250 溶液:0.10 g·L-1,取50.13 mg考馬斯亮藍G-250,加入95%(體積分數(shù))乙醇溶液25 mL 和磷酸50 mL,混勻,用水定容至500 mL,并超聲使其充分溶解,用濾紙過濾后,濾液備用。

    牛血清白蛋白批號為WXBC4547V,純度為99%;考馬斯亮藍G-250、硫酸為分析純;試驗用水為超純水;醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品來自4個不同廠家。

    1.2 試驗方法

    按質(zhì)量體積比2∶1(g∶m L)加入醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品約0.5 g和0.5 mol·L-1硫酸溶液0.25 mL,密封后置于沸水浴中加熱10 min,使其完全溶解。冷卻至室溫,加入與上述0.5 mol·L-1硫酸溶液等體積的1 mol·L-1氫氧化鈉溶液,搖勻后即得供試品溶液。在供試品溶液中加入考馬斯亮藍G-250 溶液5.0 mL,混合均勻后放置10 min,以空白牛血清白蛋白標準溶液為參比,測量上述體系在595 nm 處的吸光度。隨同做樣品空白試驗。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 試驗方法的選擇

    福林酚法和考馬斯亮藍法是測定蛋白質(zhì)含量的常用方法,將醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠解交聯(lián)后,分別采用福林酚法(參考YY/T 1571-2017)和考馬斯亮藍法測定,所得結(jié)果分別為2089%(福林酚法)和<0.024%(考馬斯亮藍法),兩種方法的測定結(jié)果差異較大。在對鹽酸利多卡因、D-葡萄糖醛酸、N-乙?;?D-葡萄糖酰胺、3-[4-(2,3-二羥基丙氧基)丁氧基]丙烷-1,2-二醇(BDDE 水解產(chǎn)物)等4種共存雜質(zhì)進行干擾試驗時發(fā)現(xiàn),福林酚法和考馬斯亮藍法所得牛血清白蛋白的回收率分別為932.5%,1006.6%,436.4%,405.6% 和94.1%,93.9%,88.6%,88.0%,說明共存雜質(zhì)對福林酚法所得結(jié)果的干擾極大。這是由于在酸性加熱條件下,交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉中的醚鍵及糖苷鍵斷裂產(chǎn)生的D-葡萄糖醛酸、N-乙?;?D-葡萄糖酰胺、3-[4-(2,3-二羥基丙氧基)丁氧基]丙烷-1,2-二醇及樣品中的添加劑鹽酸利多卡因等均可與酚試劑反應顯藍色,從而導致測定結(jié)果偏高?;诖?試驗選擇以考馬斯亮藍法測定醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉中蛋白質(zhì)含量。

    2.2 解交聯(lián)劑種類及其用量、解交聯(lián)時間的選擇

    醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠難溶于水,但是在沸水浴加熱和酸性條件下,交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉中的醚鍵可發(fā)生水解形成均一溶液,因此試驗考察了沸水浴條件下,1 mol·L-1鹽酸溶液和0.5 mol·L-1硫酸溶液對交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉解交聯(lián)效果的影響。取2組樣品于樣品管中,按照試驗方法分別比較了1 mol·L-1鹽酸溶液和0.5 mol·L-1硫酸溶液的解交聯(lián)效果。結(jié)果顯示,1 mol·L-1鹽酸溶液所得吸光度均為負值,這是由于沸水浴條件下,鹽酸揮發(fā)將會導致樣品溶液顯堿性,不利于考馬斯亮藍G-250-蛋白質(zhì)顯色體系的穩(wěn)定,因此試驗選擇0.5 mol·L-1硫酸溶液作解交聯(lián)劑。

    試驗還考察了解交聯(lián)劑用量分別為0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35 mL,解交聯(lián)時間分別為2,5,8,10 min時對交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的解交聯(lián)效果的影響,結(jié)果見表1。其中:“×”表示樣品管中仍殘留有凝膠狀樣品,說明樣品未完全解交聯(lián);“√”表示樣品管中溶液為澄清透明均一溶液,說明樣品解交聯(lián)完全。

    表1 樣品解交聯(lián)條件的選擇Tab.1 Selection of sample de-crosslinking conditions

    由表1可知:當解交聯(lián)時間小于8 min,解交聯(lián)劑用量為0.10~0.35 mL 時,交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉均不能被完全解交聯(lián);當解交聯(lián)時間達到10 min,解交聯(lián)劑用量不小于0.20 mL 時,交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉均可被完全解交聯(lián)。綜合考慮,試驗選擇的解交聯(lián)劑的用量為0.25 mL,解交聯(lián)時間為10 min。

    2.3 標準曲線和檢出限

    按照試驗方法分別測定牛血清白蛋白標準溶液系列,以牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應的吸光度為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果顯示,考馬斯亮藍法標準曲線的線性范圍為2.04~10.22 mg·L-1,線性回歸方程為y=8.444×10-3x-6.322×10-3,相關系數(shù)為0.997 3。

    基于中華人民共和國藥典(2020 年版)(Ch P 2020)中9101分析方法驗證指導原則[13],按照試驗方法重復測定空白樣品溶液7次,計算測定值的標準偏差(s),以3.3s與標準曲線斜率(k)的比值計算檢出限(3.3s/k),所得檢出限為1.353 mg·L-1。

    2.4 精密度和回收試驗

    按照試驗方法分析4種醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠,所得蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)小于0.024%,符合標準YY/T 1571-2017規(guī)定的限值(0.1%)要求。選擇其中一個陰性樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗(加標物為牛血清白蛋白),每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表2。

    表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

    由表2 可知:蛋白質(zhì)的回收率為99.3%~100%,RSD 為1.3%~3.5%,均 符合Ch P 2020 中9101分析方法驗證指導原則中的指標要求[13]。

    本工作提出了硫酸解交聯(lián),考馬斯亮藍法測定醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中蛋白質(zhì)含量的方法,該方法前處理簡單、分析快速、準確度高、精密度好,可用于醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠中蛋白質(zhì)含量的測定。

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