超高效液相色譜法快速測定陳皮及其提取物中4種黃酮類化合物的含量

王文昌 ,徐 猛 ,趙益菲 ,張玉芬 ,張曉芳*

(1.河北晨光檢測技術(shù)服務(wù)有限公司,邯鄲 057250;2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司,邯鄲 057250)

陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮[1],具有理氣健脾、燥濕化痰等功效,在許多中藥復(fù)方制劑中均有添加。陳皮的活性成分主要為黃酮類化合物,包括橙皮苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷以及多甲氧基黃酮(如川陳皮素和紅橘素等)[2-5]。目前,陳皮的質(zhì)量控制主要集中在單一物質(zhì)即橙皮苷的定性、定量上,如《中華人民共和國藥典》2015年版(ChP 2015)將橙皮苷含量作為衡量陳皮質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。但是采用單一指標(biāo)成分無法全面評價陳皮飲片質(zhì)量,無法體現(xiàn)陳皮多成分、多功效的特點(diǎn)。陳皮提取物主要含有揮發(fā)油、黃酮等活性成分,作為功能食品基料和藥品原料,具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。

目前,陳皮及其制品中黃酮類化合物的測定方法主要有薄層色譜法[6]、紫外分光光度法[7]、高效液相色譜法[8-9]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]等。其中,薄層色譜法主要用于鑒別橙皮苷,紫外分光光度法的專屬性較差。高效液相色譜法在黃酮類化合物含量測定方面的應(yīng)用較多,所用流動相主要為乙腈-水體系[1,12-13]和甲醇-水體系[8,14-15],但以甲醇-水體系作流動相時,色譜峰峰形較差,且分析時間長。而鮮有文獻(xiàn)對陳皮提取物中活性成分的測定進(jìn)行報道。

鑒于此,本工作以含乙酸的乙腈溶液作流動相,采用超高效液相色譜法測定陳皮及陳皮提取物中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量,以期為陳皮及陳皮提取物中相應(yīng)成分的分析檢測和質(zhì)量控制提供方法指導(dǎo)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WATERS ACQUITY Arc型超高效液相色譜儀,配2489型紫外-可見檢測器;TH-600型超聲波清洗器;AUY220型分析天平;DK-98-IIA 型電熱恒溫水浴鍋;FW100型萬能粉碎機(jī)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:0.4 g·L-1,分別取0.01 g蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇超聲溶解后定容至25 mL容量瓶中。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用甲醇逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為2.5,12.5,25,50,100,200,400 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于98%;甲醇和乙腈為色譜純;冰乙酸為優(yōu)級純;試驗(yàn)用水為超純水,電阻率不小于18.2 MΩ·cm。

陳皮購買于藥店,陳皮提取物由本公司自制。

1.2 儀器工作條件

Waters Cortecs C18色譜柱(100 mm×3 mm,2.7μm);柱溫35 ℃;流動相為體積比17∶83的乙腈-1%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸溶液;洗脫方式為等度洗脫;流量0.5 mL·min-1;進(jìn)樣量3μL;檢測波長283 nm;檢測時間8 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 陳皮提取物

取0.04 g(精確至0.000 1 g)陳皮提取物,用甲醇超聲溶解并定容至100 mL容量瓶中,過0.22μm濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

1.3.2 陳 皮

將陳皮樣品粉碎,使至少95%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))樣品能通過孔徑為0.425 mm(40目)的篩網(wǎng)。取篩下物于專用樣品袋中,搖晃混勻5 min 以上。取0.5 g(準(zhǔn)確至0.000 1 g)樣品于具塞錐形瓶中,加入甲醇100 mL,稱取質(zhì)量。于70℃水浴回流90 min,再次稱取質(zhì)量,并用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻后靜置15 min,取上清液過0.22μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按照儀器工作條件測定100 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別于1 d內(nèi)連續(xù)測定6次和每天測定1次、連續(xù)測定6 d,計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷等4種黃酮類化合物的日內(nèi)、日間RSD 分別為0.44%～0.46%和0.42%～0.92%,說明儀器的精密度較好,所得色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solution

由圖1可知,柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的分離度均較好(分離度均大于1.5,拖尾因子為1.0),說明方法的系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

2.2 陳皮取樣量的選擇

當(dāng)提取劑甲醇的用量為100 mL 時,考察了陳皮取樣量分別為0.5,1.0,1.5,2.0 g時對其中4種黃酮類化合物峰面積的影響。結(jié)果顯示,陳皮樣品中僅檢出了蕓香柚皮苷和橙皮苷,二者的峰面積均隨取樣量的增加而降低。因此,試驗(yàn)選擇的取樣量為0.5 g。

2.3 回流時間的選擇

試驗(yàn)考察了回流時間分別為30,60,90,120,150,180 min時對陳皮樣品中蕓香柚皮苷和橙皮苷峰面積的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 回流時間對蕓香柚皮苷和橙皮苷峰面積的影響Fig.2 Effect of reflux time on the peak areas of narirutin and hesperidin

由圖2可知:兩種黃酮類化合物的峰面積隨回流時間的延長先增加后減小;當(dāng)回流時間為90 min時,二者的峰面積均較大。因此,試驗(yàn)選擇的回流時間為90 min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以4種黃酮類化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,4種黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為2.5～400 mg·L-1,其他線性參數(shù)見表1。

以3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(3S/N),所得結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.5 精密度試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法平行制備6份陳皮及陳皮提取物的樣品溶液,并分別在1 d和連續(xù)6 d(1 d測一個)對其中4種黃酮類化合物進(jìn)行測定,計算檢出成分測定值的RSD。結(jié)果顯示:陳皮提取物中蕓香柚皮苷的日內(nèi)、日間RSD 分別為0.32%和0.38%,橙皮苷的日內(nèi)、日間RSD 分別為0.41%和0.43%;陳皮中蕓香柚皮苷的日內(nèi)、日間RSD 分別為0.83%和0.56%,橙皮苷的日內(nèi)、日間RSD 分別為0.88%和0.60%,說明本方法的精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法制備陳皮及其提取物的樣品溶液,均放置0,4,8,12,16,20,24 h后對其中黃酮類化合物進(jìn)行測定。結(jié)果顯示,僅檢出蕓香柚皮苷和橙皮苷,這兩種黃酮類化合物測定值的RSD 均小于1.5%,說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法分析陳皮,其中蕓香柚皮苷和橙皮苷的質(zhì)量濃度依次為0.020 8,0.136 7 mg·L-1,色譜圖見圖3。對該樣品進(jìn)行加標(biāo)(加標(biāo)量為100倍檢出物含量)回收試驗(yàn),計算回收率,二者的回收率分別為98.7%,99.4%。

圖3 陳皮樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of the dried tangerine peel sample

本工作采用甲醇提取結(jié)合超高效液相色譜法測定陳皮及其提取物中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量。該方法精密度和準(zhǔn)確度均較好,可用于陳皮及其提取物中蕓香柚皮苷、橙皮苷的日常分析和質(zhì)量控制。