Gitelman綜合征診斷的研究進展

許益寧，閆朝麗

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，呼和浩特 010050； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，呼和浩特 010050)

Gitelman綜合征(Gitelman syndrome，GS)又稱家族性低鉀低鎂血癥，是一種常染色體隱性遺傳病，由位于染色體16q13的溶質(zhì)載體家族12成員3(solute carrier family 12 member 3，SLC12A3)基因突變引起。該基因編碼噻嗪類利尿劑敏感的離子通道蛋白——鈉氯協(xié)同轉運蛋白(Na-Cl cotransporter，NCC)。NCC是參與腎臟重吸收功能的重要蛋白，SLC12A3基因突變導致NCC的合成、加工、轉運及降解出現(xiàn)異常，引起腎臟鈉離子、鉀離子排泄增多。有研究報道，亞洲GS的患病率高于歐洲，為1/40 000～1/4 000[1]，主要在青少年及成年人中發(fā)病，也有少數(shù)兒童期發(fā)病的報道，最早可見于新生兒期[2]。GS臨床可表現(xiàn)出由低血鉀、低氯性堿中毒、低血鎂、低尿鈣及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)異常激活所致的相應癥狀以及血壓正常或偏低。GS與甲狀腺疾病及糖尿病之間存在一定的聯(lián)系，且與Batter綜合征的臨床癥狀多有重疊，進一步增加了GS的診斷難度[3-6]?，F(xiàn)就GS診斷的研究進展予以綜述。

1 GS臨床表型

近年來隨著基因技術的發(fā)展，國內(nèi)外有關GS的報道逐漸增多。國外較大宗的報道來自歐洲腎臟病協(xié)作組，包含448例GS患者[7]，國內(nèi)較大數(shù)量的報道分別出自青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院(67例)[8]、中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院(64例)[9]及上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院(47例)[10]。雖然GS的發(fā)病年齡主要集中在青少年及成年人群，但發(fā)病年齡越小臨床表型可能越嚴重[11]。如果未得到及時診治可導致患兒生長發(fā)育遲緩、骨骼畸形和心律失常等嚴重并發(fā)癥甚至危及生命[11]。對于基因型相同但性別不同的GS患者，男性較女性發(fā)病更早、血鉀更低、尿電解質(zhì)排泄分數(shù)更高[8]。

臨床中GS患者常因低血鉀、口渴、嗜鹽、肌無力、手足抽搐、橫紋肌溶解、癱瘓、低血壓、心悸或疲勞等非特異性表現(xiàn)而就醫(yī)?；純焊彩诚淌扯翘鹗常捎猩L發(fā)育遲緩及青春期延遲的表現(xiàn)。生長激素/胰島素樣生長因子Ⅰ軸的改變與內(nèi)環(huán)境離子紊亂的共同作用導致患兒出現(xiàn)生長遲緩、青春期延遲、身材矮小等發(fā)育問題。成年后發(fā)病的患者可能會出現(xiàn)軟骨鈣質(zhì)沉著癥及關節(jié)痛，或出現(xiàn)葡萄糖耐量異?；蛞葝u素抵抗[1]。鎂離子是組織非特異性堿性磷酸酶的重要激活劑，可以增加焦磷酸鈣晶體的溶解度，將焦磷酸鈣水解成無機磷，因而低鎂血癥可促進關節(jié)和鞏膜焦磷酸鈣晶體的形成，導致軟骨鈣質(zhì)沉著。此外，GS患者的骨密度值較高，其原因可能為腎臟對鈣的重吸收增加導致骨鈣沉積。鉀離子和鎂離子的缺乏會延長心肌細胞動作電位的持續(xù)時間，并增加室性心律失常的發(fā)生率，大約50%的GS患者心電圖顯示QT間期存在輕至中度延長[12]。一些患者在晚年可能出現(xiàn)高血壓，考慮為慢性高腎素血癥和長期容量不足導致腎小球旁器增生的繼發(fā)性癥狀。有研究表明，GS基因攜帶者可發(fā)生低血壓，但部分攜帶者可能受其他因素所致高血壓的影響而無低血壓表現(xiàn)；遠曲小管重吸收氯化鈉障礙和集合管氯化鈉濃度增加導致多尿、夜尿增多[13]。

2 GS的實驗室檢查

2.1GS生化特征 2017年《Gitelman綜合征診治專家共識》[14]建議同一患者同時采集尿液和血液標本，對于補充電解質(zhì)且電解質(zhì)水平接近正常的患者停藥48 h后進行檢測，以免對檢查結果產(chǎn)生影響。GS的生化特征主要包括[12]：①在未使用排鉀藥物的情況下，血清鉀<3.5 mmol/L，伴有腎性失鉀(隨機尿，尿鉀/尿肌酐比值>2.0)。尿鉀增多可能與以下情況有關：早期遠端小管氯化鈉重吸收障礙，鈉水重吸收減少，小管腔內(nèi)負電荷增加，鉀通道開放增多，膜兩側鉀離子跨膜梯度增大，鉀離子排泄增加；醛固酮水平升高，激活腎外髓質(zhì)鉀通道促進鉀離子排泄；此外，低鎂血癥也與尿鉀增多有關。②當小管上皮細胞中的鉀離子分泌到細胞外，小管上皮細胞內(nèi)負電荷增大，氫離子開始進入細胞內(nèi)，腎小管上皮細胞內(nèi)出現(xiàn)酸中毒，近端小管及遠端小管分泌更多氫離子，碳酸氫鹽重吸收增多，出現(xiàn)代謝性堿中毒。③血清鎂<0.7 mmol/L，伴腎性失鎂(鎂排泄分數(shù)>4%)，這可能與負責鎂主動轉運的瞬時受體電位陽離子通道亞家族M成員6的下調(diào)有關。④成人可出現(xiàn)低鈣尿(隨機尿，尿鈣/尿肌酐比值<0.2)。⑤活性或血漿腎素水平升高。⑥氯離子排泄分數(shù)>0.5%。如患者出現(xiàn)低鉀血癥、低鎂血癥，且不能用嘔吐、腹瀉、口服利尿劑等常見原因解釋，可進一步完善上述化驗檢查，進行GS實驗室診斷。

2.2GS與氯離子清除試驗 氯離子清除試驗包括氫氯噻嗪試驗和呋塞米試驗。氫氯噻嗪、呋塞米是臨床常用的利尿劑和降壓藥，其作用位點分別為腎臟的NCC和鈉鉀氯協(xié)同轉運蛋白2，通過抑制NCC及鈉鉀氯協(xié)同轉運蛋白2的功能，減少鈉離子、氯離子的重吸收。在疑似GS的患者中，氫氯噻嗪試驗不僅可以評價NCC是否存在功能缺陷，還能反映其損傷程度，并與臨床表現(xiàn)嚴重程度相關。在氫氯噻嗪基礎上進一步完善呋塞米試驗，能進一步提高診斷GS的敏感性及特異性，可鑒別絕大多數(shù)的GS和Batter綜合征患者。

國外對氯離子清除試驗的研究始于1997年，Colussi等[15]發(fā)現(xiàn)經(jīng)臨床診斷的GS患者中有6例對氫氯噻嗪試驗反應不明顯，11例對呋塞米試驗有反應；在進行基因檢測確診的基礎上，進一步發(fā)現(xiàn)92.7%的GS患者對氫氯噻氫試驗無明顯反應，而Batter綜合征、假性Batter綜合征有明顯反應。Jiang等[16]在國內(nèi)首次建立簡化的氫氯噻嗪試驗方法，并確定了性別、年齡相匹配的中國人群的正常值。2018年該團隊又首次明確了在中國疑似GS的患者中以基因檢測為金標準，氫氯噻嗪試驗診斷的靈敏度、特異度均高于95%，具有較高的診斷價值[17]。GS患者對氫氯噻嗪試驗無明顯反應，對呋塞米試驗有反應；Batter綜合征患者對氫氯噻嗪試驗有反應(高于正常對照值)，對呋塞米試驗無反應(低于正常對照值)。氫氯噻嗪試驗正常對照值參考Jiang等[16]設立的正常對照值：鈉離子凈排泄率(3.23±0.77)%、氯離子凈排泄率(4.46±1.04)%、鉀離子凈排泄率(8.45±4.06)%。呋塞米試驗正常對照參考Colussi等[18]2007年設立的正常對照值：鈉離子凈排泄率(17.8±7.3)%、氯離子凈排泄率(24.5±8.9)%、鉀離子凈排泄率(39.1±17.8)%。氫氯噻嗪試驗簡便易行且成本低，適用于各級醫(yī)院。但氯離子清除試驗有引起患者電解質(zhì)紊亂的風險，尤其是低鉀血癥，操作步驟復雜，因此可以選擇臨床表現(xiàn)及實驗室檢查結果高度疑似GS的患者進行氫氯噻嗪試驗，高度疑似Batter綜合征的患者進行呋塞米試驗。

3 GS與基因檢測

臨床中盡早對疑似患者進行基因檢測，有助于疾病早期診斷，及時控制癥狀，進而改善患者生存質(zhì)量，同時可對同一家系中其他成員進行篩查。Thomas等[19]對GS等腎臟遺傳病患者進行集中隨訪及整理，明確了1例GS患者的基因型，并對其家屬進行了遺傳咨詢，指導患者后續(xù)臨床治療。

3.1SLC12A3基因與GS SLC12A3基因存在于染色體16q13區(qū)域，編碼噻嗪類利尿劑敏感的離子通道蛋白NCC，見圖1。該基因發(fā)生突變后NCC合成、加工、轉運及降解等環(huán)節(jié)及腎臟的重吸收功能均受影響，導致相應癥狀出現(xiàn)。當前人類基因突變數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.org)中已收錄的400余種突變位點大多為錯義突變，錯義突變中接近半數(shù)為復合雜合突變，純合突變占18%[20]。SLC12A3基因突變位點的多少與GS患者臨床表現(xiàn)之間并無特殊關聯(lián)。有研究顯示，不同地區(qū)GS患者SLC12A3基因突變的主要突變位點存在差異，歐洲人以IVS9+1G>T多見[21]，日本人則以c.2573T>A(p.Leu858His)、c.1924C>T(p.Arg642Cys)多見，且攜帶上述突變的日本GS患者血清鎂水平顯著升高[22]；而PT60M、P．D486N、P．R913Q、c．965-1、c.977 delGCGGACATTTTTGinsACCGAAAATTTT以及c.2877 2878delAG則是中國人群中最常見的突變位點，其中攜帶PT60M和D486N的GS患者比例分別為14.1%和8.4%[8]。亞洲GS患者的SLC12A3基因突變多分布于整個基因，而歐美GS患者的SLC12A3基因突變位點多分布于基因編碼的跨膜區(qū)和胞內(nèi)段部分。結合上述研究結果，SLC13A3基因突變的差異與種族分布呈現(xiàn)一定相關性。

注：SLC12A3為溶質(zhì)載體家族12成員3，NCC為鈉氯協(xié)同轉運蛋白，CLC-Kb為電壓門控氯離子通道圖1 SLC12A3基因編碼腎臟NCC

一項包含137例GS患者的SLC12A3基因分析的研究顯示，錯義突變占72%以上，其中最常見的突變位點為Thr60Met。研究中有102例患者包含2個突變基因，31例患者包含1個突變基因，僅4例患者未明確突變基因[23]。對于檢測顯示僅有單雜合突變的患者，另一個基因突變位點未找到的原因可能包括：①突變可能位于5′非翻譯區(qū)、3′非翻譯區(qū)或內(nèi)含子深部，外顯子測序法不能測出；②SLC12A3包含1個或多個外顯子重排，單個外顯子測序難以確定；③突變位點并不位于SLC12A3基因[22]。因此，研究建議為了提高診斷率，可使用多重連接探針擴增技術對僅攜帶單個突變等位基因的人群進行細致全貌的基因組重排篩查。隨著下一代測序技術(next-generation sequencing，NGS)的出現(xiàn)，全外顯子組以及全基因組測序的使用越來越頻繁，尋找突變位點有了新的突破[23-25]。

3.2CLCNKB(chloride channel CLC-Kb)基因與GS

氯離子通道由CLCNKA(chloride channel CLC-Ka)或CLCNKB(位于染色體1p36區(qū))基因編碼，包含CLC-Ka和CLC-Kb兩個亞型。CLC-Kb與Na+，K+-ATP酶共同促進NCC對鈉離子、氯離子的重吸收(圖2)，CLCNKB基因突變可導致腎小管重吸收功能減弱。遠曲小管上無CLC-Ka分布，但髓袢升支粗段上的CLC-Ka可對功能喪失的CLC-Kb發(fā)揮代償作用，代償作用越完整，癥狀越輕。

注：SLC12A3為溶質(zhì)載體家族12成員3，NCC為鈉氯協(xié)同轉運蛋白，CLC-kb為電壓門控氯離子通道圖2 CLCNKB基因編碼CLC-kb

部分癥狀表現(xiàn)典型的GS患者基因檢測時未發(fā)現(xiàn)SLC12A3基因突變，但存在CLCNKB基因突變，也有患者同時存在SLC12A3及CLCNKB基因突變。Jeck等[26]在3例GS患者的基因檢測中發(fā)現(xiàn)了CLCNKB突變。一項包含448例GS患者的研究顯示，CLCNKB突變患者約占全部患者的3%[6]。Lee等[27]在34例GS患者的基因檢測中發(fā)現(xiàn)SLC12A3突變29例，CLCNKB突變3例，且SLC12A3突變患者低血鎂及低尿鈣程度較CLCNKB突變患者更重。Kong等[28]報道1例8歲10個月的GS患者基因檢測結果，既出現(xiàn)SLC12A(3p.N359K)突變也出現(xiàn)CLCNKB(p.L94I)突變，推測是兩種突變共同導致最終的表型，但需要更多的證據(jù)證實CLCNKB p.L94I的致病性。Li等[29]報道3例GS患者，第1例為SCL12A3復合雜合突變，突變中一個源于父親p.T60M，另一個源于母親p.L858H；第2例為SCL12A3純合突變，突變均來自雙親的p.N359K；第3例為SCL12A3和CLCNKB雜合突變，兩個突變均來自母親，包括SCL12A3中的P.T60M突變和CLCNKB基因中的P.W391R突變。綜上所述，CLCNKB基因突變在GS中確實存在，但具體致病機制尚不明確，需要進一步研究探索其潛在的致病機制。

4 GS與NGS

NGS可以一次性檢測數(shù)百至數(shù)千種基因變異。NGS按照覆蓋測序范圍大小可以分為靶向目標基因測序、全外顯子組測序、全基因測序。它以成本低、通量高、速度快的優(yōu)點在遺傳領域廣泛應用。NGS的出現(xiàn)彌補了傳統(tǒng)測序技術的不足，使針對GS患者突變基因及基因致病性的研究得以廣泛而深入地開展。

Ashton等[30]應用NGS對384例臨床疑似腎臟遺傳病患者及其16名家系成員進行了基因檢測，并對突變基因進行致病性分析。其中Bartter/GS患者174例，遠端腎小管性酸中毒76例，并在27個基因中共鑒定出269個不同的突變，可能致病性突變95個，致病性突變136個，未描述突變100個。此外，基因檢測修正了16例患者的臨床診斷。Hureaux等[31]對1 033例臨床疑似腎小管病變的患者進行了NGS檢測，結果顯示，臨床考慮診斷為GS的272例患者中有117例檢測到GS相關基因突變，并有42例患者通過NGS排除診斷。雖然NGS為GS診斷提供了便利，但也面臨諸多挑戰(zhàn)：①NGS對基因變異的解釋，尤其是意義未知的突變，需要更大的基因庫配合，有風險評估不準確的缺點；②雖然NGS存在諸多優(yōu)點，但并不適合所有疾病，也不能完全替代所有基因檢測方式，需要與多種檢測技術聯(lián)用，才能發(fā)揮更大的診斷價值。

5 小 結

GS的臨床診斷首先依靠臨床表現(xiàn)、實驗室檢查結果和家族遺傳病史。臨床表現(xiàn)需要與其余腎小管疾病進行鑒別，實驗室檢查結果會受到患者飲食及服用藥物的干擾。當臨床高度懷疑患者為GS時，醫(yī)師可在保證患者安全性的前提下進行氯離子清除試驗。同時在條件充分時可進行基因檢測，基因檢測可以進一步明確GS突變基因及其致病性、完善表型-基因型的對應關系、指導治療并提供遺傳咨詢。上述臨床診斷、實驗室診斷及基因診斷的結合可以使GS診斷更及時、準確。但在氯離子清除試驗的安全性、突變基因的致病性、表型-基因型對應關系及基因庫的完善等方面還需要深入研究，以使更多GS患者受益。