葛根素對飼喂氧化大豆油黃羽肉雞免疫器官抗氧化功能的影響

施 璇,余應(yīng)梅,歐陽經(jīng)鑫,郭帥鵬,陳 春,劉三鳳,黎觀紅* （1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省動物營養(yǎng)重點實驗室,江西 南昌 330045；.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江西 南昌 330045）

現(xiàn)代家禽養(yǎng)殖業(yè)中采用的玉米-豆粕型飼糧難以滿足家禽生長過程中對能量的需求,因此在生產(chǎn)實踐中常添加一定劑量的油脂用以提高飼糧能量水平。添加油脂的飼糧可以減少飼料粉塵,提升飼糧適口性,改善脂蛋白的水解和吸收[1],減緩飼糧通過胃腸道的速度,提高營養(yǎng)物質(zhì)的的吸收利用率[2]。因此,油脂在肉雞飼料上的應(yīng)用越來越普遍。然而,高油脂飼料在加工、貯存、運輸和飼喂過程中易發(fā)生氧化酸敗。研究表明,飼糧中的氧化油脂可通過多種途徑引起畜禽氧化應(yīng)激,導(dǎo)致組織細胞膜結(jié)構(gòu)受損,機體抗氧化功能和免疫力下降,造成生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)量的下降,死亡率增高[3-8]。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白（Keap1）/核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號通路是抗氧化應(yīng)答反應(yīng)中最重要的信號通路,可被內(nèi)/外源性刺激誘導(dǎo),對維持細胞內(nèi)氧化還原平衡和降低細胞因氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用[9-10]。在正常生理狀態(tài)下,Nrf2以抑制狀態(tài)與Keap1偶聯(lián)形成二聚體,Keap1/Nrf2信號處于關(guān)閉狀態(tài)[11]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,Nrf2與Keap1發(fā)生解離或結(jié)合被阻斷,游離的Nrf2進入到細胞核中與核內(nèi)小分子蛋白肌腱膜纖維肉瘤（Maf）結(jié)合形成異二聚體,再與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）相關(guān)序列結(jié)合調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達,抵御機體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[12-14]。

葛根是我國歷史悠久的藥食同源性植物,含有多酚、多糖和黃酮類化合物等活性成分,主要以黃酮類為主,其中,葛根素（puerarin）是主要的黃酮類活性成分[15]。葛根素的化學(xué)名為8-β-D-葡萄吡喃糖-4′,7-二羥基異黃酮,結(jié)構(gòu)與雌二醇相似,具有部分雌激素樣作用[16]。研究表明,葛根素具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抗氧化、抗炎等生物學(xué)功能[17-19]。目前,有關(guān)葛根素的研究主要集中于醫(yī)學(xué)和保健食品方面,在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用鮮見報道[20-21]。免疫器官是機體免疫防御屏障重要的調(diào)控中心,對維持機體免疫穩(wěn)態(tài)具有重要作用。為此,本次試驗通過測定肉雞免疫器官抗氧化酶的活力水平和Keap1/Nrf2信號通路及其下游信號分子m RNA的相對表達量,初步探討氧化大豆油對黃羽肉雞免疫器官抗氧化功能的影響及葛根素的調(diào)節(jié)作用,以期為葛根素在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1氧化大豆油的制備參考文獻[22]的方法制備氧化大豆油。新鮮大豆油為市售精煉一級食用大豆油。新鮮大豆油在沸水浴中連續(xù)加熱10 h,并且持續(xù)通入空氣。分別在加熱第4,7,9,10小時測定大豆油的過氧化值（POV）和丙二醛（MDA）的含量。當(dāng)POV≥90 meq/kg時,氧化大豆油制備結(jié)束。油脂POV用滴定法測定,MDA含量的測定方法參考GB 5009.181-2016。

1.2試驗設(shè)計選取健康狀況良好、體質(zhì)量（34.3±0.6）g的1日齡雌性黃羽肉雞360只,隨機均分成4個處理組,每個處理6個重復(fù),每個重復(fù)15只雞。4個處理分別飼喂含新鮮大豆油的飼糧（Ⅰ組,對照組）、含新鮮大豆油且添加750 mg/kg葛根素的飼糧（Ⅱ組）、含氧化大豆油的飼糧（Ⅲ組）和含氧化大豆油且添加750 mg/kg葛根素的飼糧（Ⅳ組）。葛根素的添加量參考文獻[18,23-25]確定。本試驗所用的新鮮大豆油其POV和MDA分別為1.53 meq/kg和0.18 mg/kg,氧化大豆油POV和MDA分別為95 meq/kg和26.41 mg/kg。1～28日齡飼糧中大豆油添加量為2%,29～56日齡飼糧中大豆油添加量為3%。本試驗所用的葛根素購自楊凌慈緣生物科技有限公司,純度為98.31%,批次號為CY190320。

1.3試驗飼糧與飼養(yǎng)管理本試驗采用的基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧,根據(jù)我國NT/T 33—2004《雞飼養(yǎng)標準》推薦的營養(yǎng)水平,按1～28,29～56日齡2個階段進行配制。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗雞采用四層籠籠養(yǎng)。試驗前對雞舍進行充分沖洗和嚴格消毒,入雛前24 h將雞舍升溫至32～35℃,此后溫度每周降低2～3℃,直至保持在22～24℃為止。采用連續(xù)光照、自然通風(fēng)。試驗期舍內(nèi)光照、濕度和溫度根據(jù)常規(guī)飼養(yǎng)管理要求進行控制,雞只按正常免疫程序進行免疫。整個試驗期雞只自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)） %

1.4樣品采集在28,56日齡時,黃羽肉雞提前禁食12 h,期間自由飲水,每個重復(fù)隨機選取1只雞,斷頸處死,取胸腺、脾臟和法氏囊用1×PBS和DEPC溶液沖洗干凈并用吸水紙吸取殘余液體后分裝入凍存管中,迅速置于液氮中冷凍,最后置于—80℃冰箱保存待用。

1.5測定指標及方法

1.5.1免疫器官MDA含量和抗氧化指標 采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定胸腺、脾臟和法氏囊勻漿上清液MDA含量、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性,檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.2Keap1/Nrf2信號通路及其下游信號分子m RNA表達 將免疫器官分別與TransZol溶液按1∶9（g∶m L）比例混合用高速組織研磨儀制成10%的組織勻漿,然后提取組織勻漿中總RNA再反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)測定Keap1、Nrf2、Maf、SOD、GSH-Px、HO-1、NQO1 m RNA表達水平。所用試劑購于北京全式金生物技術(shù)有限公司（北京,中國）,試驗操作步驟嚴格按照說明書進行。相關(guān)引物序列見表2。試驗結(jié)果以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)源性對照進行歸一化,再根據(jù)2—△△Ct法計算相關(guān)m RNA的相對表達水平。

表2 qPCR引物序列

1.6統(tǒng)計分析采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理,用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA）,用Duncan氏法進行多重比較檢驗,結(jié)果以“平均值±標準誤”表示,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1葛根素對飼喂氧化大豆油黃羽肉雞免疫器官抗氧化指標的影響由表3可知,與對照組相比,飼喂含氧化大豆油飼糧顯著提高28日齡肉雞肝臟和法氏囊以及56日齡脾臟中MDA含量（P＜0.01）,且顯著提高28日齡肉雞胸腺MDA含量（P＜0.05）。與對照組相比,飼喂含氧化大豆油飼糧顯著降低28日齡肉雞脾臟T-AOC以及28日齡肉雞胸腺、脾臟和法氏囊SOD活力（P＜0.05）,且顯著降低56日齡肉雞胸腺和法氏囊T-AOC以及56日齡胸腺SOD活力（P＜0.01）。與對照組相比,飼喂含氧化大豆油飼糧顯著提高28,56日齡脾臟、法氏囊以及56日齡胸腺GSH-Px活力（P＜0.01）。與對照組相比,飼糧中添加葛根素顯著降低28日齡肉雞法氏囊MDA含量（P＜0.05）,且顯著降低56日齡肉雞胸腺MDA以及28日齡胸腺和法氏囊GSHPx活力（P＜0.01）。與對照組相比,飼糧中添加葛根素顯著提高28日齡肉雞胸腺T-AOC（P＜0.01）,且顯著提高28日齡胸腺和56日齡脾臟SOD活力以及28日齡脾臟GSH-Px活力（P＜0.05）。與飼喂氧化大豆油飼糧組相比,飼糧中添加葛根素顯著降低28,56日齡肉雞胸腺以及56日齡脾臟MDA含量（P＜0.01）,且顯著提高28日齡肉雞胸腺和脾臟以及56日齡肝臟和脾臟T-AOC（P＜0.01）。與飼喂氧化大豆油飼糧組相比,飼糧中添加葛根素顯著提高28日齡和56日齡脾臟SOD活力（P＜0.05）,顯著降低28日齡脾臟和法氏囊以及56日齡法氏囊GSH-Px活力（P＜0.01）,并且顯著降低56日齡脾臟GSH-Px活力（P＜0.05）。

表3 葛根素對飼喂含氧化大豆油黃羽肉雞免疫器官抗氧化指標的影響

2.2葛根素對飼喂氧化大豆油黃羽肉雞免疫器官Keap1/Nrf2信號通路的影響由圖1可知,與對照組相比,飼喂含氧化大豆油飼糧顯著降低28日齡肉雞脾臟Nrf2和56日齡胸腺Nrf2、Kaep1以及56日齡脾臟Maf m RNA表達（P＜0.01）,且顯著降低28,56日齡肉雞法氏囊Nrf2以及28日齡胸腺和56日齡法氏囊Maf mRNA表達（P＜0.05）。與對照組相比,飼喂含氧化大豆油飼糧顯著降低28日齡肉雞胸腺SOD以及28,56日齡胸腺HO-1 m RNA表達（P＜0.05）,且顯著降低28日齡肉雞法氏囊SOD以及56日齡脾臟和28日齡法氏囊HO-1 m RNA表達（P＜0.01）。與對照組相比,飼喂含氧化大豆油飼糧顯著降低28日齡肉雞脾臟NQO1 m RNA表達（P＜0.01）,且顯著降低28,56日齡法氏囊NQO1 m RNA表達（P＜0.05）。與對照組相比,添加葛根素顯著提高56日齡肉雞脾臟Nrf2以及28,56日齡法氏囊Keap1 m RNA表達（P＜0.05）,且顯著提高28日齡和56日齡肉雞胸腺以及56日齡脾臟Keap1 m RNA表達（P＜0.01）。與對照組相比,添加葛根素顯著提高56日齡肉雞胸腺Maf和56日齡胸腺HO-1以及2,56日齡法氏囊和56日齡胸腺NQO1 m RNA表達（P＜0.05）,且顯著提高28日齡肉雞脾臟Maf和28日齡胸腺NQO1 m RNA表達（P＜0.01）。與飼喂氧化大豆油飼糧組相比,飼糧中添加葛根素顯著提高28日齡肉雞胸腺Nrf2和28日齡脾臟Keap1以及28日齡胸腺Maf、NQO1 mRNA表達（P＜0.05）,且顯著提高56日齡肉雞胸腺和28日齡法氏囊Nrf2、NQO1以及56日齡脾臟和28日齡法氏囊Keap1 m RNA表達（P＜0.01）。與飼喂氧化大豆油飼糧組相比,飼糧中添加葛根素顯著提高28日齡和56日齡肉雞胸腺Keap1、HO-1以及28,56日齡法氏囊Maf、SOD m RNA表達（P＜0.01）,且顯著提高56日齡肉雞胸腺和脾臟Maf以及56日齡胸腺SOD和28日齡脾臟GSHPx m RNA表達（P＜0.01）。與飼喂氧化大豆油飼糧組相比,飼糧中添加葛根素顯著降低28日齡肉雞法氏囊GSH-Px m RNA表達（P＜0.05）,顯著提高56日齡脾臟和28日齡法氏囊HO-1 m RNA表達量（P＜0.01）。

圖1 葛根素對飼喂含氧化大豆油黃羽肉雞免疫器官Keap1/Nrf2信號通路相關(guān)分子mRNA表達的影響

3 討論

3.1葛根素對飼喂氧化大豆油黃羽肉雞免疫器官抗氧化指標的影響動物采食過量含過氧化物的氧化油脂會誘導(dǎo)機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[26]。據(jù)報道,氧化應(yīng)激的評判可以以一些應(yīng)激指標的測定作為依據(jù),例如SOD、CAT、GSH-Px活性以及GSH和MDA含量[27-28]。T-AOC作為衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合指標,T-AOC的降低表明機體自由基的產(chǎn)生和清除失衡,處于氧化還原失衡狀態(tài)[22,29]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),飼喂含氧化大豆油飼糧黃羽肉雞免疫器官中MDA含量升高,SOD活力和T-AOC降低以及CAT低到未檢測出,表明長期且大量采食含氧化大豆油的飼糧會增加黃羽肉雞免疫器官中脂質(zhì)過氧化物,免疫器官的抗氧化能力減弱,對機體造成氧化損傷,進而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。SOD和GSH-Px作為抗氧化防御第一道防線,在應(yīng)激狀態(tài)下其活力通常降低[30],但是也有研究表明應(yīng)激狀態(tài)下機體內(nèi)GSH-Px活力水平升高[29]。另據(jù)報道,MDA能夠有效破壞SOD的合成途徑,降低機體內(nèi)SOD活力[31]。本試驗結(jié)果表明,飼喂含氧化大豆油飼糧的黃羽肉雞免疫器官中GSH-Px活力升高,推測SOD、CAT和GSH-Px發(fā)揮抗氧化作用可能存在先后效應(yīng)。首先,SOD清除自由基產(chǎn)生H2O2,再由CAT和GSH-Px清除[32-33]。由于CAT在機體內(nèi)每秒可分解107mol的H2O2,非常高效。因而,CAT首先發(fā)揮清除作用,保護細胞免受H2O2的氧化損傷[34]。因此,在氧化大豆油刺激機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激時,大量的脂質(zhì)過氧化物和自由基產(chǎn)生,SOD首先發(fā)揮催化作用將其轉(zhuǎn)化為H2O2,再由CAT快速高效地分解。當(dāng)機體內(nèi)CAT含量過低時,GSHPx取而代之發(fā)揮清除效應(yīng),因而組織中GSH-Px活力不會顯著降低。另有研究證明,在應(yīng)激條件下機體可以額外合成SOD[35]。因此,在長期的氧化應(yīng)激過程中也會有SOD持續(xù)生成,發(fā)揮抗氧化作用,并不會出現(xiàn)與CAT相同的結(jié)果。葛根素具有許多的藥理作用,如抗氧化、降血壓、預(yù)防心臟疾病和神經(jīng)變性等[36-37]。目前,有關(guān)葛根素對家禽胸腺、脾臟和法氏囊的研究鮮見報道。飼糧中添加葛根素后胸腺、脾臟和法氏囊MDA含量呈現(xiàn)出降低的結(jié)果?；ㄇ嗨赝瑢儆邳S酮類化合物,飼糧中添加花青素也會降低氧化應(yīng)激狀態(tài)下法氏囊中MDA含量,提高SOD活力[27]。異黃酮是黃酮類化合物的一個亞類,具有較強的抗氧化活性[38]。葛根素主要活性成分為8-β-D-葡萄吡喃糖-4′,7-二羥基異黃酮。MDA是過氧化脂質(zhì)的主要降解產(chǎn)物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有一個醛基,醛基性質(zhì)活潑,容易發(fā)生縮合反應(yīng)和加成反應(yīng)。由葛根素和MDA化學(xué)結(jié)構(gòu)式我們可以看出,葛根素中的羥基可以與MDA中的醛基發(fā)生縮合反應(yīng),從而達到清除MDA的效果。然而,羥基化學(xué)性質(zhì)也較為活潑,與其相連的α-C可以發(fā)生氧化反應(yīng),因此葛根素也可以通過自身氧化,減少機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。因此,飼糧中添加葛根素可以降低免疫器官中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。

3.2葛根素對飼喂氧化大豆油黃羽肉雞免疫器官Keap1/Nrf2信號通路的影響Keap1/Nrf2信號通路是調(diào)節(jié)機體氧化還原反應(yīng)的經(jīng)典途徑,可被內(nèi)/外源性刺激誘導(dǎo),對維持細胞內(nèi)氧化還原平衡和降低細胞因氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用[9-10]。Nrf2作為Keap1/Nrf2信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子,在生理狀態(tài)下與Keap1形成聚合物,Nrf2的功能被抑制[39-41]。本試驗結(jié)果表明,Keap1/Nrf2信號通路受氧化大豆油影響,Keap1和Nrf2 mRNA表達量降低,添加葛根素后其m RNA表達量升高。有研究認為,Keap1是哺乳動物細胞內(nèi)親電劑和氧化劑的傳感器,Keap1的半胱氨酸殘基修飾或與親電劑/氧化劑結(jié)合或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)直接被破壞,減少或阻斷了Keap1與Nrf2的結(jié)合,導(dǎo)致細胞質(zhì)中Nrf2積累、向核內(nèi)易位并激活Keap1/Nrf2信號通路及其下游信號分子[42]。當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)下時,Keap1與Nrf2結(jié)合能力減弱,釋放出Nrf2和新生的Nrf2在細胞質(zhì)中積聚,活化的Nrf2進入細胞核中與Maf結(jié)合,激活并啟動ARE調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達[13]。在氧化大豆油的作用下,Maf、SOD、HO-1和NQO1 m RNA表達量降低。SOD、GSH-Px、HO-1和NQO1均是Keap1/Nrf2信號通路下游的抗氧化酶。HO-1可催化血紅素生成等摩爾的膽紅素、CO和鐵離子（Fe2＋）,且可與Nrf2共同發(fā)揮抗氧化、抗炎等作用,廣泛參與心臟、肝臟、腎臟等組織細胞的抗氧化應(yīng)激損傷[43-44]。有研究表明,Nrf2的激活伴隨著HO-1 m RNA表達量升高[45],與本試驗結(jié)果相一致。當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)下,Keap1/Nrf2信號通路被激活,該通路作用下產(chǎn)生的抗氧化活性物質(zhì)處于一種持續(xù)消耗的狀態(tài),以抵御應(yīng)激對機體造成的損傷。因此,在氧化應(yīng)激狀態(tài)下Keap1/Nrf2信號通路及其下游相關(guān)信號分子mRNA表達量降低,系統(tǒng)抗氧化能力逐漸減弱。葛根素具有抗氧化作用[17],在含氧化大豆油的飼糧中添加葛根素后,黃羽肉雞免疫器官中Keap1/Nrf2信號通路及其下游信號分子m RNA表達量升高,系統(tǒng)抗氧化能力增強,因而發(fā)揮對機體的保護作用。根據(jù)Keap1/Nrf2信號通路相關(guān)信號分子m RNA表達結(jié)果推測,葛根素也可能作用于該通路中的某一信號分子,增強該通路中抗氧化物質(zhì)的表達,提高機體抗氧化能力。但是,葛根素調(diào)節(jié)機體抗氧化能力的作用機制及其作用靶點尚不明晰,仍需深入研究。

飼喂氧化大豆油導(dǎo)致黃羽肉雞免疫器官MDA含量升高,降低免疫器官T-AOC水平和SOD活性以及Keap1/Nrf2信號通路中相關(guān)分子的m RNA表達。飼糧中添加葛根素可降低飼喂氧化大豆油黃羽肉雞免疫器官MDA含量,提高免疫器官T-AOC水平和Keap1/Nrf2信號通路下游抗氧化酶的產(chǎn)生,從而提高免疫器官的抗氧化功能。