Ⅰ群禽腺病毒penton蛋白單克隆抗體的制備和鑒定

侯力丹,陳曉春,薛 麒,鄧 永,孔冬妮,楊承槐,劉 丹*,李俊平* （.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 0008；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 0093）

禽腺病毒（fowl adenovirus,FAd V）是可以通過種源垂直傳播的常見免疫抑制病毒之一,根據(jù)抗原性不同可分為3個(gè)群,其中Ⅰ亞群FAd V（FAd V-Ⅰ）可分為5個(gè)種（A～E）,12個(gè)血清型（血清型1～7、8a、8b、9～11）。2015年下半年以來,多種血清型的FAd V-Ⅰ在我國河南、河北、遼寧、吉林、黑龍江、新疆、安徽、山東、江西、湖北、江蘇等省多個(gè)雞場(chǎng)暴發(fā)流行,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。這些感染最初主要發(fā)生在一些生物安全條件較差的小型養(yǎng)殖場(chǎng),但隨后某些大型現(xiàn)代化養(yǎng)殖場(chǎng)也出現(xiàn)了由FAd V-Ⅰ引起的雞心包積液-肝炎綜合征。SU等[4-5]對(duì)發(fā)生雞心包積液-肝炎綜合征的某大型種雞群開展溯源分析,從其使用的雞新城疫弱毒疫苗中同時(shí)檢測(cè)到雞傳染性貧血病毒（chicken infectious anemia virus,CIAV）和FAd V-Ⅰ的混合污染,經(jīng)過測(cè)序和比對(duì)發(fā)現(xiàn)疫苗中FAd V與我國發(fā)病雞群中FAd V的同源性非常高。自此,對(duì)疫苗中FAd V-Ⅰ污染的監(jiān)測(cè)引起越來越多企業(yè)的關(guān)注。當(dāng)前,國內(nèi)除了血清4型FAd V-Ⅰ外,FAd V-8a、FAd V-8b、FAd V-10及FAd V-11等血清型在我國雞群中也均有流行和感染的報(bào)道[1-3],多血清型的流行為該病的檢測(cè)和防控帶來很大挑戰(zhàn),而國內(nèi)尚無可同時(shí)檢測(cè)FAd V-Ⅰ所有血清型病毒的診斷制品和方法。為此,本試驗(yàn)基于penton蛋白研制了可有效識(shí)別FAd V-Ⅰ所有12個(gè)血清型的單克隆抗體,為開展禽活疫苗FAd V-Ⅰ污染的檢測(cè)及相關(guān)疾病診斷提供儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1參考毒株及主要試劑FAd V-Ⅰ的12個(gè)血清型參考毒株均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定和保存,各毒株的具體信息參見表1。12個(gè)血清型參考毒株接種雞肝癌細(xì)胞（LMH）后,按照Reed-Muench法測(cè)定其TCID50。雞減蛋綜合征病毒（EDSV,127株）、禽白血病病毒（ALV,RAV-1株）、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV,ILT/13株）、禽正呼腸孤病毒（ARV,Reo1133株）均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。FAd V-Ⅰ陽性血清由FAd V KR5株病毒免疫SPF獲得。FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自Sigma公司。限制性內(nèi)切酶購自NEB公司。

表1 FAd V的12種血清型參考毒株信息

1.2penton蛋白的表達(dá)與純化根據(jù)GenBank上公布的FAd V-Ⅰ的序列,采用DNAStar軟件對(duì)penton蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性、抗原性和功能區(qū)的分析,選取penton蛋白抗原表位相對(duì)集中且在FAd V-I中同源性較高的49～166aa和375～525aa蛋白序列作為表達(dá)蛋白的備選片段。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)分析,人工合成825 bp核酸片段并在兩端加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)用于載體的克隆,序列合成由北京六合華大蛋白研發(fā)中心有限公司完成。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別對(duì)合成的序列和質(zhì)粒p ET30a進(jìn)行雙酶切,純化回收的片段和表達(dá)載體酶切產(chǎn)物用DNA Ligation Kit連接后,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21。從轉(zhuǎn)化的平板挑單克隆到1.5 m L含相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min培養(yǎng),IPTG（0.5 mmol/L）誘導(dǎo),37℃、200 r/min培養(yǎng)2 h。誘導(dǎo)菌液以常規(guī)SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.3基于penton蛋白的間接ELISA檢測(cè)方法建立參照相關(guān)文獻(xiàn),以1.2純化的penton蛋白作為包被抗原建立用于檢測(cè)其抗體的間接ELISA方法[6]。首先用p H9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液稀釋純化好的penton蛋白,終質(zhì)量濃度為2 mg/L,100μL/孔,4℃過夜；后用PBST（含0.05%吐溫的PBS）洗滌3次。用含2%牛奶的PBS進(jìn)行封閉,200μL/孔,37℃孵箱中2 h,后用PBST（含0.05%吐溫的PBS）洗滌3次。分別加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、陰性對(duì)照（SP2/0培養(yǎng)上清）、空白對(duì)照（PBS）、陽性對(duì)照（陽性血清用PBS做1 000倍稀釋）作為一抗,100μL/孔,37℃孵育1 h。用PBST（含0.05%吐溫的PBS）洗滌3次后分別加入工作濃度的山羊抗小鼠IgG/HRP作為二抗,100μL/孔,37℃孵育1 h。再用PBST（含0.05%吐溫的PBS）洗滌3次,加入顯色液顯色5 min,每孔加入50μL終止液（含2 mol/L硫酸）終止。在雙波長（450,630 nm）下測(cè)吸光值,記錄保存數(shù)據(jù)。

1.4單克隆抗體的制備用1.2純化的penton蛋白按照常規(guī)方法[7]制備雜交瘤細(xì)胞系,并按照1.3步驟以penton蛋白包被的ELISA板進(jìn)行2次篩選。篩選出的ELISA陽性的雜交瘤細(xì)胞株上清進(jìn)行與全病毒的反應(yīng)性檢測(cè),并按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄方法對(duì)制備的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)。將培養(yǎng)24 h的雜交瘤細(xì)胞用秋水仙素法檢查染色體數(shù)目,觀察染色體特征是否符合雜交瘤細(xì)胞的染色特性,并用ELISA方法進(jìn)行抗體亞類分型。將篩選出的雜交瘤細(xì)胞系按照常規(guī)方法[7]通過腹腔注射小鼠,收集腹水,并置于—40℃保存。將每株單克隆抗體的腹水從1∶1 000開始倍比稀釋至1∶16 000作為一抗,用間接免疫熒光法（IFA）測(cè)定腹水效價(jià)。

1.5單克隆抗體的鑒定將表1所列FAd V-I 12個(gè)血清型毒株病毒液分別用含2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成100 TCID50/0.1 m L,接種已長成良好LMH細(xì)胞單層的96孔板,每個(gè)毒株接種4孔,100μL/孔,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)5 d后棄去96孔板的細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔約加250μL PBS輕洗細(xì)胞表面1次,盡量棄盡PBS,然后每孔加入100μL冷甲醇,置室溫固定10～15 min,棄去甲醇,自然晾干2～5 min,作為FAd V-Ⅰ陽性板備用。將1.4中制備的腹水作為一抗,采用IFA篩選與FAd V-Ⅰ12個(gè)血清型毒株全病毒具有良好反應(yīng)性的細(xì)胞株,接種的4個(gè)FAd V-Ⅰ陽性病毒孔中只要1孔出現(xiàn)特異性綠色熒光即判為該單克隆抗體與FAd V-Ⅰ反應(yīng)。同時(shí)在LMH細(xì)胞板上接種EDSV（127株）、ALV（RAV-1株）、ILTV（ILT/13株）、ARV（Reo1133株）等作為對(duì)照,觀察制備的單克隆抗體與相關(guān)病毒是否存在交叉反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1重組蛋白的表達(dá)與純化重組表達(dá)菌小量表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè),結(jié)果顯示在約37 k Da處出現(xiàn)重組penton蛋白的特定目的條帶（圖1）,說明penton蛋白表達(dá)成功。將表達(dá)菌擴(kuò)大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)超聲破菌、離心,分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果在沉淀中檢測(cè)到大量的目的蛋白,說明其表達(dá)形式為包涵體表達(dá)（圖2）。純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,有明顯蛋白條帶（圖3）,以BSA為標(biāo)準(zhǔn),通過SDS-PAGE凝膠掃描分析,純化蛋白質(zhì)量濃度＞0.5 g/L,純度＞85%。純化重組蛋白用FAd V-Ⅰ陽性血清進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè),有特異性條帶（圖4）。

圖1 蛋白小量表達(dá)檢測(cè)圖

圖2 蛋白大量表達(dá)檢測(cè)圖

圖3 蛋白大量表達(dá)純化檢測(cè)圖

圖4 純化重組蛋白的免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)圖

2.2雜交瘤細(xì)胞的篩選和鑒定用ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清中的抗體進(jìn)行檢測(cè),經(jīng)過1次亞克隆和篩選后,進(jìn)行亞型鑒定。經(jīng)過篩選后,共獲得2株陽性雜交瘤細(xì)胞株,分別標(biāo)識(shí)為Mab-penton-6＃和Mab-penton-9＃。按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn),均無細(xì)菌污染、支原體污染和外源病毒污染。亞類鑒定均為IgG1型,輕鏈均為κ鏈。結(jié)果見表2。

表2 2株雜交瘤細(xì)胞株篩選與鑒定結(jié)果

2.3間接免疫熒光法檢測(cè)單克隆抗體反應(yīng)性與效價(jià)用雜交瘤細(xì)胞株Mab-penton-6＃、Mab-penton-9＃少量制備的小鼠腹水作為第一抗體進(jìn)行IFA檢測(cè),正常細(xì)胞對(duì)照背景最暗且無特異性熒光,以陽性病毒孔出現(xiàn)特異性熒光最亮的一抗和二抗的工作濃度為最適濃度。根據(jù)熒光強(qiáng)弱,其結(jié)果可判為＋（1個(gè)視野內(nèi)有1個(gè)左右的特異性熒光）、＋＋（1個(gè)視野內(nèi)有1～10個(gè)特異性熒光）、＋＋＋（1個(gè)視野內(nèi)有10個(gè)以上特異性熒光）。結(jié)果顯示,2株單克隆抗體與FAd V-Ⅰ各血清型12株參考毒株均呈現(xiàn)出典型的強(qiáng)熒光信號(hào),而與EDSV、ALV、ILTV、ARV等病原感染細(xì)胞均不發(fā)生反應(yīng),說明建立的IFA方法特異性良好（圖5為Mab-penton-6＃檢測(cè)結(jié)果,Mab-penton-9＃檢測(cè)結(jié)果未展示）。同時(shí),用IFA測(cè)定抗體效價(jià),結(jié)果表明,Mab-penton-6＃、Mab-penton-9＃雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體腹水效價(jià)分別為1∶8 000和1∶4 000。最終選用Mabpenton-6＃雜交瘤細(xì)胞大量制備單克隆抗體。

圖5 Mab-penton-6＃雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體IFA檢測(cè)

3 討論

自2015年以來,以包涵體肝炎-心包積液綜合征為主要臨床癥狀的疾病在我國山東、河南以及其他省份陸續(xù)暴發(fā)并持續(xù)流行,該病發(fā)病時(shí)間主要集中于3～5周齡,并能引發(fā)20%～30%的病死率,給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8-10]。大量流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,血清4型、8b型、11型FAd V-Ⅰ是目前國內(nèi)流行的主要代表血清型[11],同時(shí)還有報(bào)道指出從某些禽用弱毒疫苗中檢測(cè)到血清4 FAd V-Ⅰ[5,12]。經(jīng)過基因組對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),禽用弱毒疫苗中污染的血清4型FAd V-Ⅰ與野毒株具有非常高的同源性[4],提示弱毒疫苗中可能的FAd V-Ⅰ污染是該病傳播途徑之一。

作為常見的垂直傳播性病毒之一,SPF雞胚中一旦攜帶FAd V-Ⅰ便會(huì)造成生產(chǎn)的禽用弱毒疫苗出現(xiàn)污染,為該病的防控帶來很大風(fēng)險(xiǎn)。現(xiàn)有SPF雞微生物控制國家標(biāo)準(zhǔn)中,針對(duì)FAd V特別是Ⅲ群的EDSV已有明確的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),但FAd V-Ⅰ檢測(cè)控制標(biāo)準(zhǔn)缺乏系統(tǒng)對(duì)應(yīng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。在2015年版《中國獸藥典》的禽活疫苗成品外源病毒檢驗(yàn)中還未將FAd V-Ⅰ列入正式檢測(cè)項(xiàng)目,相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)亟待建立。作為一種疫苗中潛在外源病毒,針對(duì)FAd V-Ⅰ的檢測(cè)應(yīng)不僅是針對(duì)某一種或幾種特定血清型,而是要確保FAd V-Ⅰ均可以被檢出。針對(duì)FAd V-Ⅰ的通用型檢測(cè)中,早在1998年就有報(bào)道指出,通過1對(duì)通用引物可同時(shí)檢測(cè)出FAd V-Ⅰ所有的血清型[13]。這種分子生物學(xué)檢測(cè)除了需要進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證外,還有另一個(gè)缺陷,即僅核酸檢測(cè)無法證實(shí)其中是否存在具有感染性的活病毒,在實(shí)施病毒分離鑒定時(shí)如果有高效的單克隆抗體,則可通過IFA等快速確定FAd V-Ⅰ的存在。本研究成功獲得2株可識(shí)別FAd V-Ⅰ的雜交瘤細(xì)胞系,其所分泌的單克隆抗體可與FAd V-Ⅰ的12個(gè)血清型參考毒株發(fā)生特異性反應(yīng),針對(duì)FAd V-Ⅰ呈現(xiàn)出識(shí)別的廣譜型,而對(duì)Ⅲ群FAd V（EDSV）以及其他常見禽類病毒未發(fā)生任何交叉反應(yīng),具有較好的群特異性。該單克隆抗體在IFA檢測(cè)中明確易判,為實(shí)現(xiàn)SPF雞胚等疫苗生產(chǎn)原料以及疫苗成品檢驗(yàn)的高效檢測(cè)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

FAd V編碼的蛋白包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中結(jié)構(gòu)蛋白包括五鄰體（penton）、六鄰體（hexon）和纖突蛋白（fiber）,fiber主要是通過識(shí)別宿主細(xì)胞上的特異受體而使病毒吸附結(jié)合在宿主細(xì)胞上,有助于病毒的侵入和內(nèi)化[14-16]。hexon是主要的結(jié)構(gòu)蛋白,包含主要屬和亞屬特異型抗原決定簇和次要型特異性抗原決定簇[17],能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[18]。此前,已有針對(duì)某些血清型FAd V-Ⅰ的單克隆抗體或者多克隆抗體的相關(guān)報(bào)道。如曹潔等[19]制備了針對(duì)血清4型FAd V-Ⅰfiber 1蛋白多克隆抗體,王萍等[7]制備了抗血清4型FAd V-Ⅰfiber 2蛋白的單克隆抗體,郭浩然等[20]制備了抗血清4型FAd V-Ⅰfiber 2蛋白的多克隆抗體,路浩等[21]制備了針對(duì)血清8型FAd V-Ⅰ纖突蛋白的多克隆抗體,上述研究均關(guān)注于六鄰體或纖突蛋白,主要針對(duì)某一血清型進(jìn)行特異性識(shí)別。penton蛋白在不同血清型間較為保守,因此,本研究率先將FAd V-Ⅰ編碼penton蛋白的基因進(jìn)行了深入的同源性分析,在此基礎(chǔ)上篩選并確定了12個(gè)血清型penton蛋白中同源性最高的2段基因以linker進(jìn)行連接,以此作為免疫原制備單克隆抗體,經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí)本研究所制備的單克隆抗體比上述其他蛋白制備單克隆抗體具有更廣泛的識(shí)別譜,可有效識(shí)別12個(gè)血清型參考毒株。

綜上所述,本研究研制了可同時(shí)有效識(shí)別12個(gè)血清型FAd V-Ⅰ的單克隆抗體,靈敏度高、特異性強(qiáng),為規(guī)范SPF雞以及禽活疫苗等樣品中FAd V-Ⅰ的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。