HD11來源NDV Ex對雞骨髓源樹突狀細胞活化和細胞因子水平的影響

丁 偉,劉婷婷,鄒映雪,黃天鴻,馮嘉軒,曲書靚,蘇佳鑫,張 頔,徐小洪,丁 壯 （吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點實驗室,吉林 長春 130062）

所有細胞均可以釋放外泌體,其大小處于40～100 nm之間[1]。外泌體膜富含脂筏,通過與細胞膜相融合的方式釋放。研究表明,外泌體中除蛋白質(zhì)外,還包含DNA、m RNA、微小RNA等各種核酸[2]。有報道稱,病毒可以借助外泌體將致病性蛋白或基因組運輸至機體各處,促進病毒在機體內(nèi)的擴散,導(dǎo)致免疫功能失調(diào)[3]。反轉(zhuǎn)錄病毒可以借助外泌體釋放,進而感染周圍細胞[4]。感染禽白血病病毒的細胞釋放的外泌體可以激活CD4＋、CD8＋T細胞[5]。病毒感染細胞后會對宿主細胞釋放的外泌體的組分產(chǎn)生影響,一方面機體可以利用外泌體發(fā)揮抗病毒免疫作用,而另一方面病毒也可以利用外泌體促進其在機體中的繁殖。因此,研究外泌體在病毒傳播過程中發(fā)揮的作用是揭示機體抗病毒反應(yīng)的重要方向之一。

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是一種重要的禽類病毒,強毒株在禽類種群內(nèi)的傳播給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。已有研究表明,NDV感染后細胞分泌的外泌體含有3種miRNA,具有促進NDV復(fù)制的作用[6]。另外,NDV感染細胞后分泌的外泌體中含有病毒蛋白NP、F、V和W,可以抑制抗病毒細胞因子的分泌,促進病毒增殖[7-8]。

然而,抗病毒天然免疫過程并非是單一種類細胞的活動,而是由多種細胞組織協(xié)作完成的,其中樹突狀細胞（dendritic cells,DCs）作為一種專職的抗原遞呈細胞,是連接天然免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)的重要橋梁[9]。未成熟DCs有較強的抗原遞呈功能,經(jīng)過病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP）激活后,DCs便會從非淋巴組織遷移到次級淋巴組織的T細胞區(qū),在此過程中DCs逐漸成熟,表面高表達MHCⅡ類分子和共刺激分子（CD40、CD86等）,抗原遞呈及刺激T淋巴細胞活化能力顯著增強,響應(yīng)微生物感染進而啟動機體免疫應(yīng)答[10]。禽類DCs最早見于盲腸扁桃體,是位于腸黏膜的次生淋巴器官[11],隨后在禽的其他淋巴組織及表皮發(fā)現(xiàn)了3種主要類型的樹突狀細胞,即并指狀樹突狀細胞、濾泡樹突狀細胞和表皮樹突狀細胞,能夠識別不同的微生物并直接啟動相關(guān)信號途徑[12]。禽類DCs體外培養(yǎng)僅有零星報道,極大限制了對禽類DCs的進一步研究與應(yīng)用。近年來,隨著新的chDCs標(biāo)記的發(fā)現(xiàn),為chDCs相關(guān)研究和應(yīng)用提供了可能性[13-14]。

本試驗利用重組雞粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（chGM-CSF）和重組雞白細胞介素4（chIL-4）體外誘導(dǎo)雞骨髓細胞分化為雞骨髓源樹突狀細胞（chicken bone marrow-derived dendritic cells,chBMDCs）,并對誘導(dǎo)條件進行優(yōu)化,利用HD11來源NDV Ex刺激未成熟chBMDCs,通過形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定來初步鑒定體外誘導(dǎo)培養(yǎng)所得的chBMDCs,檢測chBMDCs活化情況及細胞因子水平,評估其對chBMDCs的影響。

1 材料與方法

1.1細胞、病毒、動物及主要試劑雞巨噬細胞系HD11由本實驗室保存；NDV強毒NA-1株（Gen-Bank:DQ659677）由本實驗室分離保存；1～6周齡SPF雞均購自哈爾濱獸醫(yī)研究所；所有動物實驗均按照吉林大學(xué)動物福利研究倫理委員會批準的實驗操作規(guī)范操作（批準文號:2017060815-2）；protein A/G磁珠購自MCE公司；重組雞GM-CSF蛋白、鼠TSG101抗體、PE標(biāo)記的鼠抗雞MHCⅡ抗體購自Abcam公司；重組雞IL-4蛋白購自Kingfisher Biotech公司；Histopaque-1119購自Sigma公司；兔抗雞CD40抗體購自博奧森公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體Multiscience公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自BiOworld公司；Eastep Super Total RNA Extraction Kit購自Promega公司；ECL發(fā)光液購自碧云天試劑公司。

1.2外泌體分離與鑒定

1.2.1外泌體的分離 HD11密度達95%時將培養(yǎng)基替換為不含F(xiàn)BS的DMEM,加入PBS或NA-1（MOI＝0.5）,以此來避免血清中外泌體殘留。48 h后收集細胞上清液,經(jīng)0.22μm濾器過濾,4℃、100 000×g（Beckman Coulter 480 Instruments）離心60 min。將超離產(chǎn)物用PBS洗滌1次后重懸于PBS中,通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測其濃度后儲存于—80℃?zhèn)溆?。將超離產(chǎn)物與雞CD63抗體在室溫下靜置孵育30 min,將混合物與protein A/G磁珠在旋轉(zhuǎn)條件下溫育30 min。用PBS洗滌磁珠3次后用洗脫緩沖液（150 mol/L甘氨酸,p H2.7）洗脫,中和緩沖液中和后儲存于—80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2透射電子顯微鏡及Western blot鑒定外泌體 取20μL樣品滴于200目銅網(wǎng),5 min后用濾紙吸干液體,以2%多聚甲醛固定后經(jīng)1%磷烏酸負染2 min,PBS清洗2次后經(jīng)電鏡觀察外泌體形態(tài)。取樣品上樣SDS-PAGE凝膠進行電泳分離,將SDSPAGE凝膠經(jīng)半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗為鼠TSG 101（1∶2 500）,二抗為1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG。

1.3chBMDCs的分離及培養(yǎng)處死4周齡雛雞,浸入75%乙醇中浸泡30 min,無菌條件下取出雞股骨和脛骨,泡入預(yù)冷1640培養(yǎng)基中,注射器吸取含100 U/m L青霉素和100 mg/L鏈霉素的預(yù)冷1640培養(yǎng)基,沖洗骨髓至髓腔變白；收集沖洗液,過200目篩網(wǎng),過濾組織塊和骨碎屑,2 000×g離心10 min；棄上清液,收集沉淀并用淋巴細胞分離液重懸沉淀細胞,然后按照3∶1的比例向骨髓細胞懸液緩緩加入含1%雙抗的預(yù)冷1640培養(yǎng)基,2 000×g離心10 min；收集中間交接面處的白色霧狀細胞2 m L,重懸后2 000×g離心10 min,洗滌2次,棄上清液,收集沉淀。用含有10%胎牛血清（FBS）（Gibco,USA）、100 U/m L青霉素和100 mg/L鏈霉素的完全1640培養(yǎng)基重懸細胞,細胞計數(shù)。每只雞可以分離到（2～5）×107個骨髓細胞。將分離所得骨髓細胞加入六孔細胞培養(yǎng)板中,每孔補加含有ch GM-CSF和chIL-4的完全1640培養(yǎng)基,終體積為2 m L,細胞終濃度2×106/m L,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d用新鮮含細胞因子的完全1640培養(yǎng)基替換1/2的培養(yǎng)基,同時在第3,5天去除非黏附細胞（如粒細胞和死細胞）。第6天加入NA-1、NDV相關(guān)外泌體刺激細胞24 h,第7天收集細胞進行后續(xù)試驗。

1.4chBMDCs形態(tài)學(xué)觀察通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)、細胞聚集和細胞生長情況,并拍照記錄不同培養(yǎng)條件對細胞分化的影響。

1.5chBMDCs純度及表型檢測將各組收集到的chBMDCs分別裝入玻璃離心管中,1 000×g離心10 min后棄上清液,然后用0.01 mol/L PBS重懸細胞,調(diào)整細胞濃度至5×105/m L。向用于鑒定DC純度的細胞（未刺激的DC）中加入PE標(biāo)記的抗雞MHCⅡ（abcam公司）,室溫避光孵育20 min,0.01 mol/L PBS洗滌2次（1 000×g離心5 min）,然后用200μL PBS（0.01 mol/L）重懸DC,最后應(yīng)用流式細胞儀進行檢測；向用于鑒定DC成熟表型的細胞中加入無熒光標(biāo)記的兔抗雞CD40,室溫孵育20 min,0.01 mol/L PBS洗滌2次（1 000×g離心5 min）,然后再加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H＋L）（Multiscience公司）,室溫避光孵育20 min后用0.01 mol/L/PBS洗滌2次（1 000×g離心5 min）,然后用200μL PBS（0.01 mol/L）重懸DC,最后應(yīng)用流式細胞儀進行檢測。

1.6chBMDCs活化相關(guān)分子mRNA檢測通過Eastep Super Total RNA Extraction Kit（Promega,USA）提取對照組chDCs、NA-1、NDV相關(guān)外泌體刺激組ch DCs的RNA,隨后使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega,USA）、oligo-d T和隨機引物的混合物（1∶1）對所得RNA進行反轉(zhuǎn)錄。cDNA經(jīng)無菌蒸餾水稀釋作為qPCR的模板或在—40℃保存?zhèn)溆?。qPCR采用Fast Start Universal YBR Green Master（瑞士羅氏公司）進行試驗,并使用GAPDH的表達水平進行數(shù)據(jù)標(biāo)準化,以基因的相對表達量2—△△Ct計算表達水平。表1中列出了本研究中用于qPCR的所有引物。

表1 引物信息表

2 結(jié)果

2.1外泌體的分離與鑒定使用雞CD63抗體聯(lián)合protein A/G磁珠處理超速離心產(chǎn)物,即外泌體和NDV病毒粒子的混合物。利用protein A/G磁珠聯(lián)合雞CD63抗體的分離方法分離得到外泌體后,經(jīng)Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白TSG 101（圖1A）。透射電鏡下可觀察到外泌體形態(tài),直徑約為100 nm,具有典型的杯狀結(jié)構(gòu),且無病毒粒子（圖1B）,說明該方法可有效分離外泌體與NDV病毒粒子并且保持外泌體完整結(jié)構(gòu)。

圖1 外泌體的分離與鑒定

2.2chBMDCs培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1不同淋巴細胞分離液對ch BMDCs分離效率的影響 分別使用Histopaque?-1119分離液和雞外周血淋巴細胞分離液分離4周齡SPF雞的骨髓細胞,添加自制雞細胞因子GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d后觀察細胞狀態(tài)。結(jié)果顯示,同禽外周血淋巴細胞分離液組相比,Histopaque?-1119分離液組chBMDCs的目的細胞數(shù)量更多,說明Histopaque?-1119分離液對雞骨髓單核細胞的分離效率更高（圖2）。

圖2 不同淋巴細胞分離液對ch BMDCs分離效率的影響

2.2.2雞日齡對chBMDCs分離效率的影響 在不同研究中,ch BMDCs分離所用雞由1周齡到3月齡不等,因此,為了確認分離chBMDCs所用雞的最佳日齡,我們使用Histopaque?-1119分離液分離1,3,4,6,8周齡SPF雞的骨髓細胞,添加自制雞細胞因子GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d后觀察細胞狀態(tài)。結(jié)果顯示,相比于其他周齡SPF雞,4周齡雞骨髓分離所得的chBMDCs的數(shù)量和純度都更好,同時在分離過程中我們發(fā)現(xiàn)同4周齡SPF雞相比,6周齡SPF雞骨髓脂肪化較嚴重（圖3）。

圖3 不同周齡SPF雞chBMDCs的分離效果

2.2.3雞品種對chBMDCs分離效率的影響 不同研究所選用雞品種有很大差異,而所得的細胞形態(tài)也有極大差異,因此我們比較了4周齡SPF雞（白來航）和一種常用肉雞（嶺南黃雞）分離所得的chBMDCs的形態(tài)。結(jié)果顯示,肉雞分離所得chBMDCs較SPF雞含有大量圓形雜細胞,表明SPF雞（白來航）更適用于分離chBMDCs（圖4）。

圖4 不同雞品種對ch BMDCs分離效果的影響

2.2.4細胞因子對chBMDCs分離效率的影響 在之前的研究中,我們通過Bac-to-Bac表達系統(tǒng)獲得了真核表達的ch GM-CSF和chIL-4蛋白,但是其純度一直未能達到理想水平,在培養(yǎng)chBMDCs過程中可能會活化chBMDCs由此影響試驗結(jié)果。因此,在本試驗中,我們比較了相同濃度下,商品化GM-CSF、IL-4與自制ch GM-CSF、chIL-4的chBMDCs誘導(dǎo)效果,結(jié)果表明雖然自制細胞因子可以有效刺激ch BMDCs分化,但是所得細胞多呈現(xiàn)成熟DC形態(tài),說明自制細胞因子中的雜質(zhì)可能會提前誘導(dǎo)DC的成熟,因此我們計劃采用商品化ch GMCSF和chIL-4進行后續(xù)試驗（圖5）。

圖5 不同細胞因子對chBMDCs分離效果的影響

2.2.5血清對chBMDCs分離效率的影響 我們比較了不同品牌胎牛血清（BI和Gibico）對chBMDCs分化的影響,為了排除血清中補體對對chBMDCs的影響,我們首先對血清進行了滅活處理。結(jié)果顯示,使用滅活Gibico胎牛血清培養(yǎng)所得chBMDCs的純度和比例都更高,培養(yǎng)6 d后chBMDCs比例可達70%左右（圖6）,因此,我們確定使用Gibico胎牛血清進行后續(xù)試驗。

圖6 不同品牌血清對chBMDCs分離效果的影響

2.3NDV Ex對天然免疫細胞活化的影響為了檢測NDV Ex對ch BMDCs活化的影響,我們以PBS、NDV Ex、NDV（MOI＝0.5）處理chBMDCs,24 h后觀察細胞形態(tài),分別以流式細胞術(shù)檢測MHCⅡ、CD40的表達情況,以qPCR檢測MHCⅡ、CD40、CD80、CD86、CD11b、CCR6、CCR7的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,NDV和NDV Ex處理后chBMDCs的形態(tài)會發(fā)生顯著變化,細胞會顯著聚團、形態(tài)呈現(xiàn)拉絲和多形性（圖7）；流式細胞術(shù)檢測顯示NDV Ex處理會顯著抑制MHCⅡ的表達,輕微抑制CD40的表達（圖8）；與其一致的是,NDV Ex處理會顯著抑制MHCⅡ、CD83、CD40等DC活化相關(guān)的細胞因子的轉(zhuǎn)錄（圖9）。結(jié)果表明,NDV Ex會抑制chBMDCs的活化。

圖7 不同刺激物處理后chBMDCs的形態(tài)變化

圖8 不同刺激物對chBMDCs MHCⅡ、CD40表達量的影響

圖9 不同刺激物對chBMDCs各細胞因子mRNA的影響

3 討論

自從1991年利用GM-CSF體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs以來,DCs研究已經(jīng)取得極大進展,尤其是人類和小鼠的DCs體外培養(yǎng)極大促進了DCs功能和臨床應(yīng)用的研究[15-16]。在已經(jīng)建立的骨髓細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs的方法中,骨髓細胞多來源于鼠等實驗動物[17]。經(jīng)典DCs培養(yǎng)的細胞因子組合是GM-CSF和IL-4[18]。GM-CSF可促進骨髓細胞發(fā)育,是生成和維持DCs發(fā)育和分化的最根本的細胞因子,IL-4抑制粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生,促進單核細胞向DCs的轉(zhuǎn)化,并維持DCs成熟[19-20]。但是目前為止尚沒有相對成熟、效率較高的ch DCs誘導(dǎo)培養(yǎng)方法,導(dǎo)致ch DCs及其免疫學(xué)相關(guān)研究相對滯后。因此,建立一種高效成熟chBMDCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法尤為重要。本試驗通過Bac-to-Bac表達系統(tǒng)獲得了真核表達的chGM-CSF和chIL-4,但是其純度一直未能達到理想水平,因此我們采用商品化chGM-CSF和chIL-4進行下一步試驗。本研究最終有效優(yōu)化了chBMDCs的分離培養(yǎng)條件,即使用Histopaque?-1119分離液,4周齡SPF（白來航）雞,經(jīng)滅活處理的Gibico血清,商品化的chIL-4和ch GM-CSF培養(yǎng)6 d得到未成熟chBMDCs。

DC接觸抗原刺激后會經(jīng)歷復(fù)雜的成熟活化過程,表現(xiàn)為上調(diào)細胞表面主要組織相容性復(fù)合體MHCⅠ和MHCⅡ以及共刺激分子CD80、CD86和CD40[21]。正常情況下,不成熟的DC捕獲抗原并逐漸成熟,然后遷移到淋巴結(jié)激活T細胞,啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)[22]。然而,微環(huán)境中的特異性信號也可能會抑制DC成熟,導(dǎo)致形成具有免疫抑制或免疫耐受的樹突狀細胞[23-24]。在本試驗中,我們發(fā)現(xiàn)NDV Ex會抑制chBMDCs的活化。研究表明,外泌體可通過模式識別受體調(diào)節(jié)DC的功能,例如胰腺癌細胞來源外泌體中的miR-203可以下調(diào)樹突狀細胞TLR-4表達,并減少TLR-4下游細胞因子如TNF-α和IL-12的表達[25]。此外,IL-6、IL-10可以通過活化DC內(nèi)STAT3信號傳導(dǎo)通路抑制LPS誘導(dǎo)的DC成熟[26-28]。因此,在后續(xù)試驗中,我們將檢測IL-6、IL-10以及模式識別受體在NDV Ex引起的DC活化抑制過程中的作用。

外泌體及其組分在介導(dǎo)天然免疫細胞的抗病毒作用中發(fā)揮重要作用,因此明確外泌體是否參與NDV感染過程中宿主天然免疫應(yīng)答的啟動十分必要。本試驗補充了外泌體在NDV感染中發(fā)揮的作用,為闡明NDV在機體內(nèi)的致病機制奠定了基礎(chǔ)。